基于Cytb基因鉴别裸盖鱼的引物和探针以及方法与流程

本发明涉及物种检测领域，更具体地，本发明涉及基于cytb基因鉴别裸盖鱼的引物和探针、方法以及试剂盒。
背景技术：
：裸盖鱼(anoplopomafimbria)，又名黑鳕鱼，属于辐鳍鱼纲(actinopterygii)、鮋形目(scopaeniformes)、黑鮋亚目(anoplopomatoidei)、黑鮋科(anoplopomatidae)裸盖鱼属(anoplopoma)，属于冷水性底栖鱼类。裸盖鱼外观体型与鳕鱼类似，鱼肉洁白如玉，日本市场最先将其称为“银鳕鱼”，由于其体表呈黑色，在我国又被称为“黑鳕鱼”。市场上被称为“银鳕鱼”的还有南极犬牙鱼，它主要分布在智利与阿根廷南部，以及澳洲、法国、新西兰、南非和英国管辖的次南极区群岛海域附近；而裸盖鱼主要分布在北太平洋两侧，包括美国阿拉斯加、加利福尼亚附近海域、日本北部海域、白令海峡附近海域等。裸盖鱼肉质白细鲜嫩、无肌间小刺、富含dha等多种营养成分，加之自然资源稀少、捕捞量较小，导致该鱼的价格昂贵，在世界范围内已成为高端水产品的典型代表之一。裸盖鱼捕捞后去头去内脏，在-40℃下冷冻，而后通过低温冷链运输到全球各主要消费国。由于我国经济的快速发展，消费者对高端水产品的需求增长巨大，我国目前成为该鱼的主要进口国、消费国之一。由于该鱼的价格高，消费者极少整条购买，因此进口商将冷冻的裸盖鱼再次分割、切片、包装后销售。具有分类学鉴定特征的鱼头、鱼鳍等均随着船上加工、二次切割被剔除掉，普通消费者很难通过外形特征鉴定市面上的裸盖鱼产品。一些不法分子利用裸盖鱼产品的这个特点，用大小等规格接近的鱼切片冒充裸盖鱼销售，赚取经济利益，这种行为严重违反了我国食品安全法“禁止生产经营掺假掺杂食品”的规定；更为严重的是，少数人用“油鱼”(即棘鳞蛇鲭、异鳞蛇鲭)切片冒充银鳕鱼产品，“油鱼”因含有大量人体不能消化利用的蜡酯，不少人食用后导致腹泻，据媒体报道，已经引起了多起食品安全事件，引发了社会广泛关注。一时间，消费者“望鳕却步”、“谈鳕色变”，这种掺杂掺假的行为扰乱了正常的经济秩序与行业发展，给消费者的健康带来威胁。目前基于分子生物学的方法是鉴定鱼品种的主要途径，主要步骤包括提取dna、pcr扩增保守片段、测定序列、序列比对分析、绘制进化树等，以判断待测样品的物种属性。但该方法由于包含“测定序列”这一环节，因此检测时间至少需要3～4天，不能满足监管、质检在时效性方面的需求。鉴于上述情况，急需建立一种能快速鉴定裸盖鱼的方法作为水产品质量监管的参考依据。技术实现要素：一方面，本发明的目的在于提供基于cytb基因鉴定裸盖鱼的引物和探针。其中，引物包括一对扩增引物，分别包括seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列。所述探针包括seqidno.3所示的核苷酸序列，且所述探针的5’端携带有荧光基团，3’端携带有荧光淬灭基团。优选地，所述荧光基团是fam，所述荧光淬灭基团是dna小沟结合物(dnaminorgroovebinders，mgb)。优选地，所述荧光基团是fam，所述荧光淬灭基团是mgb，所述mgb的3’端连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽。另一方面，本发明还提供一种鉴定裸盖鱼的方法，所述方法包括：步骤(1)：基于所述裸盖鱼的cytb基因设计并合成引物和探针；步骤(2)：从待检样品中提取dna；以及，步骤(3)：利用所述引物和所述探针，以所述dna作为模板dna，通过实时荧光pcr反应来鉴定所述裸盖鱼。优选地，在步骤(1)中，所述引物包括一对扩增引物，分别包括seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列，所述探针包括seqidno.3所示的核苷酸序列，且所述探针的5’端携带有荧光基团，3’端携带有荧光淬灭基团。优选地，所述荧光基团是fam，所述荧光淬灭基团是dna小沟区结合剂。优选地，在步骤(2)中，以水产品的肌肉组织为待检样品进行dna提取，以浓度为10ng/μl～100ng/μl且a260/a280比值在1.7～1.9范围内的dna作为所述模板dna。优选地，在步骤(3)中，所述实时荧光pcr反应的条件为：95℃10min；95℃15s，60℃1min，并收集荧光信号，循环40次。又一方面，本发明还提供一种用于鉴定裸盖鱼的实时荧光pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括一对扩增引物以及探针，所述一对扩增引物分别具有seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列，所述探针具有seqidno.3所示的核苷酸序列，且所述探针的5’端携带有荧光基团fam，3’端携带有荧光淬灭基团dna小沟区结合剂。优选地，所述试剂盒中还包括含有裸盖鱼成分的阳性对照品和不含有裸盖鱼成分的阴性对照品。优选地，所述试剂盒中还包括：ddh2o；以及，选自以下的试剂：dna聚合酶、pcr缓冲液、dntps。本发明基于裸盖鱼cytb编码基因的序列，设计出裸盖鱼的物种特异性引物和探针，基于实时荧光pcr技术，建立了快速鉴定裸盖鱼的方法。该方法的操作步骤主要包括dna提取和实时荧光pcr检测，整个过程只需2-4小时，大大提高了鉴别检测的效率，可供检测、科研、质监等机构用于裸盖鱼及其初级加工品的精准鉴别。另外，经验证，该方法具有良好的特异性，能将裸盖鱼与市场上冒充裸盖鱼以及易混品种(如棘鳞蛇鲭、异鳞蛇鲭、太平洋鳕鱼、大西洋鳕鱼、黑线鳕、狭鳕、无须鳕、裸盖鱼、细鳞壮鳕等)区分开，从而为行业监管提供了可靠的技术支撑。附图说明图1是示出以裸盖鱼成分作为待检样品进行本发明的实时荧光pcr鉴别检测结果的图，其中曲线1是裸盖鱼成分实验组的扩增曲线。图2是示出本发明的一种鉴定裸盖鱼的方法的灵敏度分析结果的图，其中曲线a是以裸盖鱼肌肉组织作为待测样品时的扩增曲线，曲线b是以含1％的裸盖鱼肌肉组织的样品作为待测样品时的扩增曲线，曲线c是以含0.5％的裸盖鱼肌肉组织的样品作为待测样品时的扩增曲线，曲线d是以含0.1％的裸盖鱼肌肉组织作为待测样品时的扩增曲线，曲线e是以含0.01％裸盖鱼肌肉组织作为待测样品时的扩增曲线。图3是以小鳞犬牙南极鱼为待检样品，用本发明的方法进行鉴别检测的结果，其中曲线2和3是裸盖鱼成分阳性对照组的扩增曲线，小鳞犬牙南极鱼和空白对照组均无扩增信号。图4是以棘鳞蛇鲭为待检样品，用本发明的方法进行检测鉴别的结果，其中曲线4和5是裸盖鱼成分阳性对照组的扩增曲线，棘鳞蛇鲭和空白对照组均无扩增信号。图5是以长鳍金枪鱼为待检样品，用本发明的方法进行检测鉴别的结果，其中曲线6和7是裸盖鱼成分阳性对照组的扩增曲线，长鳍金枪鱼和空白对照组均无扩增信号。图6是以黑线鳕为待检样品，用本发明的方法进行检测鉴别的结果，其中曲线8和9是裸盖鱼成分阳性对照组的扩增曲线，黑线鳕和空白对照组均无扩增信号。图7是以狭鳕为待检样品，用本发明的方法进行检测鉴别的结果，其中曲线10和11是裸盖鱼成分阳性对照组的扩增曲线，狭鳕和空白对照组均无扩增信号。具体实施方式以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细的描述，具体实施方式仅是对本发明技术方案的示例性说明，本发明的范围并不限于此。基于裸盖鱼的cytb基因的序列设计了一对扩增引物和一条探针，即具有seqidno.1和seqidno.2所示核苷酸序列的引物以及具有seqidno.3所示核苷酸序列的探针。为了便于描述，将一对扩增引物中的上游引物称为afcyf，下游引物称为afcyr，探针称为afcyp，其中上游引物afcyf具有seqidno.1所示的核苷酸序列，下游引物afcyr具有seqidno.2所示的核苷酸序列，探针afcyp具有seqidno.3所示的核苷酸序列。上游引物afcyf和下游引物afcyr是能特异性鉴定裸盖鱼的引物对，对裸盖鱼具有特异性，而对不含有裸盖鱼成分的dna不发生特异性扩增。上述引物还可以用于荧光素、生物素等化学发光物质进行标记。探针的5’端携带有荧光基团，优选是fam，3’端携带有荧光淬灭基团，优选是mgb，且进一步优选mgb的3’端连接有二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide，dpi3)。如本文所述，其中“裸盖鱼成分”是指特异性来自于裸盖鱼的成分，可以是裸盖鱼本身或包含裸盖鱼的加工产品。基于本发明所提供的引物与探针，本发明还提供了一种特异性鉴别裸盖鱼的方法，所述方法包括：以待检样品的dna为模板，利用具有seqidno.1和seqidno.2所示核苷酸序列的引物以及具有seqidno.3所示核苷酸序列的探针进行实时荧光pcr反应。获取待测样品的dna的方法是本领域技术人员的常规实验方法，例如可采用酚/氯仿等方法进行dna的提取，也可以采用是市售dna提取试剂盒，这类试剂盒的选择与使用方法均是本领域技术人员的常规实验方法。利用上述引物对和探针，通过实时荧光pcr，就能够快速、准确地检测出待测样品中是否含有裸盖鱼成分，检测灵敏度可高达0.1％。本发明还涉及一种用于特异性鉴定裸盖鱼的实时荧光pcr检测试剂盒，所述试剂盒中含有具有seqidno.1和seqidno.2所示核苷酸序列的引物以及具有seqidno.3所示核苷酸序列的探针。此外，上述试剂盒中还可含有其他试剂，包括但不限于：pcr反应试剂，阳性对照品，阴性对照品，ddh2o，和/或dna提取试剂。pcr反应试剂包括但不限于dna聚合酶、10×pcr缓冲液、dntps、mgcl2溶液(25mmol/l)。dna聚合酶优选是taq酶，浓度为5u/μl。dntps中含有datp、dttp、dgtp、dctp，各种dntp的浓度优选为2.5mmol/l。mgcl2溶液的浓度优选为25mmol/l。10×pcr缓冲液含有500mmkcl和100mmtris-hcl(ph8.3)。阳性对照品优选为裸盖鱼的肌肉组织冻干粉。阴性对照品优选为草鱼的肌肉组织冻干粉。试剂盒中的ddh2o为经两次蒸馏处理的无核酸酶的h2o，可作为空白对照的模板，直接加入到空白对照反应体系中，也可添加到样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系中用于将各反应体系补充至预定体积。上述试剂盒的规格优选为50次反应/盒，存储条件为-20±2℃。本发明所提供的实时荧光pcr检测试剂盒能够实现快速、准确鉴定或鉴别裸盖鱼的目的。本发明的主要优点在于：(1)提供了可特异性鉴别出裸盖鱼的引物，所述引物特异性强，能够对裸盖鱼及其冒充品种或易混品种进行准确的鉴别，结果可靠。(2)利用本发明提供的试剂盒，能够快速实现检测鉴别裸盖鱼的目的，灵敏度高，所需样品少，检测效果好。下面结合具体实施例，对本发明进行详细阐述。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1：dna的提取以裸盖鱼和市场上常见的银鳕鱼(小鳞南极犬牙鱼(dissostichuseleginoides)、莫氏南极犬牙鱼(dissostichusmawsoni))、棘鳞蛇鲭(ruvettuspretiosus)、异鳞蛇鲭(lepidocybiumflavobrunneum)、绿青鳕(pollachiusvirens)、蓝鳕(micromesistiuspoutassou)、细鳞壮鳕(albatrossiapectoralis)、大西洋鳕(gadusmorhua)、太平洋鳕鱼(gadusmacrocephalus)、黑线鳕(melanogrammusaeglefinus)、黄线狭鳕(gaduschalcogrammus)、草鱼、鳙鱼、巴沙鱼、三文鱼(大西洋鲑)、鲐鱼、大菱鲆、小黄鱼、大黄鱼、蓝点马鲛、河鲀、金枪鱼(大目金枪鱼、黄鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼)、鲣鱼、南美白对虾等水产品作为待检样品。从各种待检样品中分别取肌肉组织100mg，剪碎，放入l.5ml离心管中，加入300μl组织裂解液(含有10mmtris-hcl、0.1medta和0.5％sds，ph8.0)和20μl蛋白酶k(20mg/ml)，充分混匀，置于55℃水浴锅消化至混合物变澄清。往消化液中加入300μltris-饱和酚和300μl氯仿，充分混合10min，12000rpm离心10min。将上清转移至新的离心管中，加入600μl氯仿进行抽提，充分混合10min，12000rpm离心10min。将上清转移至新的离心管中，加入1000μl冰乙醇沉淀dna，12000rpm离心3min，弃去上清液。用70％乙醇清洗沉淀两次，室温下干燥，最后加入100μl去离子水溶解dna。使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度汁检测dna溶液在260nm和280nm处的吸光值a260和a280，并通过以下公式计算dna浓度：c＝a260×n×50×1000，其中，c代表dna浓度(单位为μg/μl)；n代表dna的稀释倍数。当dna浓度为10ng/μl～100ng/μl，a260/a280比值在1.7～1.9之间时，适宜于实时荧光pcr分析。将溶解的dna储存于-20℃备用。实施例2：实时荧光pcr鉴别裸盖鱼方法的特异性分析以实施例1中所提取的dna为模板，利用由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的上述引物及探针，进行实时荧光pcr检测鉴别，反应体系见表1。其中pcr缓冲液的配方为：500mmkcl，100mmtris-hcl(ph8.3)，gelatin0.1％。实时荧光pcr反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，并收集荧光信号，循环反应40次。表1为了验证该引物/探针及检测方法的特异性，以银鳕鱼(小鳞南极犬牙鱼、莫氏南极犬牙鱼)、棘鳞蛇鲭、异鳞蛇鲭、绿青鳕、蓝鳕、细鳞壮鳕、大西洋鳕、太平洋鳕、黑线鳕、狭鳕、草鱼、鳙鱼、巴沙鱼(鲶鱼)、三文鱼(大西洋鲑)、鲐鱼、大菱鲆、小黄鱼、大黄鱼、蓝点马鲛、河鲀(红鳍东方鲀)、大目金枪鱼、黄鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、鲣鱼、南美白对虾等水产品的dna为模板进行实时荧光pcr检测；同时以ddh2o作为反应的空白对照。以裸盖鱼基因组dna为模板的实时荧光pcr扩增结果见图1，以其他品种的dna为模板扩增所得的ct值及结果判定见表2。由图1和表2可见，基于引物afcyf/afcyr与探针afcyp建立的实时荧光pcr方法，以目标品种即裸盖鱼的基因组dna为模板时具有特异性的扩增曲线，其ct值约在19左右，远远小于实时荧光pcr反应通常的阳/阴性ct分界值35.0，阳性扩增明显；以其余受测品种的dna为模板时均无扩增信号，且无ct值。另外，作为示例，图3～图7分别示出了以小鳞南极犬牙鱼、棘鳞蛇鲭、长鳍金枪鱼、黑线鳕、狭鳕作为待检样品进行荧光实时pcr检测鉴别的结果。由图可知，这些样品均未出现特异性扩增的阳性信号。由此说明，本申请所提供的引物和探针以及基于该引物和探针建立的实时荧光pcr方法能对裸盖鱼进行特异性地鉴别和鉴定。表2样品ct值结果判定样品ct值结果判定裸盖鱼19.43+鳙鱼/-小鳞南极犬牙鱼/-巴沙鱼/-莫氏南极犬牙鱼/-三文鱼/-异鳞蛇鲭/-鲐鱼/-黄线狭鳕/-大菱鲆/-黑线鳕/-小黄鱼/-绿青鳕/-大黄鱼/-蓝鳕/-蓝点马鲛/-细鳞壮鳕/-南美白对虾/-无须鳕/-河鲀/-大西洋鳕/-大目金枪鱼/-太平洋鳕/-黄鳍金枪鱼/-棘鳞蛇鲭/-长鳍金枪鱼/-狭鳞庸鲽/-鲣鱼/-草鱼/-ddh2o/-以上结果表明，引物afcyf/afcyr和探针afcyp以及基于引物afcyf/afcyr和探针afcyp建立的实时荧光pcr方法，可以特异性地鉴别出裸盖鱼。实施例3：实时荧光pcr鉴别裸盖鱼成分的灵敏度分析为评价本发明所建立的实时荧光pcr方法的灵敏度，将裸盖鱼肌肉组织与市面上主要易混品种(如棘鳞蛇鲭等)的肌肉组织按不同比例混匀，裸盖鱼肌肉组织的质量分数分别为1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％。采用酚/氯仿或市售dna提取试剂盒的方法，从混合组织样品中提取dna，以从纯裸盖鱼肌肉组织提取的dna为阳性对照，以从纯棘鳞蛇鲭肌肉组织提取的dna作为阴性对照，以ddh2o为空白对照，按照实施例2进行实时荧光pcr检测。结果见图2和表3。结果显示，含有1％、0.5％、0.1％裸盖鱼肌肉组织的样品组出现特异性扩增的阳性信号，也就是说利用本申请的实时荧光pcr方法能检测出这些样品中含有裸盖鱼成分。而含有0.01％或0.001％裸盖鱼肌肉组织的样品组未出现特异性扩增的阳性信号。因此，本申请的鉴别裸盖鱼的方法的检测灵敏度为0.1％。表3以上通过实施例对本发明的具体实施方式进行了详细的说明，但本发明的保护范围并不受限于此。在实现本发明目的的前提下，本领域技术人员能对本发明的技术方案做出各种改变和变型。sequencelisting<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所<120>基于cytb基因鉴定裸盖鱼的引物和探针以及方法<130>461860<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1ccttacgggacttttcctcgc21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2acctcggccgatgtgcatat20<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3ttgcgaccgccttctcttccgtc23当前第1页12