本发明涉及小分子化合物领域，具体地，涉及一种能够用于治疗、预防和调节系统性自身免疫性疾病和炎症性皮肤病的小分子化合物。
背景技术：
哺乳动物体内大约有超过500种蛋白激酶，蛋白激酶催化蛋白质特殊位点氨基酸的磷酸化，根据氨基酸的磷酸化可分为酪氨酸激酶，丝氨酸和精氨酸激酶，其中酪氨酸激酶有将近100种。jak(januskinase)是细胞内非受体性酪氨酸蛋白激酶(tyrosinekinase)的一个家族，包括jak1,jak2,jak3和tyk2四个成员。jak主要在造血细胞、白细胞和肠道上皮细胞内表达，负责介导参与炎症反应的各种细胞因子的信号传递。当细胞因子和细胞表面受体结合时，jak通过自我磷酸化而被激活，激活的jak随即通过磷酸化受体的细胞内部分使之活化并招募stat蛋白家族成员，之后stat被jak通过磷酸化激活形成二聚体，脱离受体进入细胞核，进行基因转录的调控，从而影响细胞的生物学功能。jak-stat(signaltransducerandactivatoroftranscriptionproteins)信号传导通路是炎症性细胞因子和受体相结合之后激发的信号在细胞内传导的主要通路。许多证据表明，jak-stat信号通路与很多疾病，特别是自身免疫性疾病如风湿性关节炎，肠道疾病，过敏性疾病，以及炎症性皮肤疾病等有重要关联。因此，这类蛋白激酶成为了干预疾病的最重要药物研发靶点。目前多家制药公司已经针对jak家族成员进行新药研发，针对jak1，jak2和jak3的小分子药物已经被批准用于多个免疫性疾病的治疗用药，然而针对tyk2的抑制剂还极少有报道，目前还在临床开发进程中。
银屑病(psoriasis)是一种常见多发的慢性复发性、自身免疫性、炎症性皮肤病。银屑病的发病机理涉及皮肤和免疫细胞两个方面，一方面，银屑病皮损内的表皮增生伴随角化不全，表皮更新速度由28-30天降至3-5天；另一方面，免疫细胞包括树突状细胞(dendriticcells，dc)、巨噬细胞(macrophages)和t细胞(tcells)活化并进入表皮并分泌多种炎性细胞因子如肿瘤坏死因子alpha(tumornecrosisfactorα,tnf-α)、白细胞介素1beta(interleukin-1β,il-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,il-6)、白细胞介素22(interleukin-22,il-22)等，这些细胞因子诱导表皮角朊细胞(keratinocytes)增生，增生的角朊细胞也合成并分泌炎性细胞因子如il-1b，il-6和tnf-α从而使皮肤的炎症反应进一步加重，形成一种恶性循环。银屑病皮损内活化的dcs产生il-21和il-23，后者刺激表皮内的t细胞产生特异性细胞因子ifnγ和il-17，th17细胞通过分泌il-17和il-22诱导角朊细胞产生对中性粒细胞有趋化作用的炎症因子如il-8，ccl20，gm-csf(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor)和抗微生物多肽(anti-microbialpeptides)，从而造成中性粒细胞聚集在表皮角化不全的角质层内这一银屑病特征性病理现象。
研究表明，上述细胞因子介导的信号传导系统通过对jak家族成员jak1，jak2,jak3和tyk2酪氨酸激酶的激活，磷酸化细胞因子受体，招募stat(signaltransducerandactivatoroftranscriptionproteins),最终导致细胞内的基因表达影响细胞生物学功能。jak成员之间的配对与上游的细胞因子直接有关。取决于不同的细胞因子刺激，可能出现jak1/jak2，jak1/jak3，jak1/tyk2，jak2/tyk2,jak2/jak2的不同的配对组合，其中jak1配对最为常见。tyk2对于一型干扰素(ifn-alpha,ifn-beta),il-6和il-23的信号转导极为重要。炎症性疾病和自身免疫性疾病有关的免疫细胞分化和功能都与tyk2有重要关联。通常tyk2与其家族成员在被信号传递系统激活后可以是tyk2/jak1,tyk2/jak2,tyk2/jak1/jak2配对形式出现。可以想象利用高效的小分子对jak激酶活性，特别是tyk2激酶活性进行抑制可以阻断炎症因子介导的信号通路，控制炎症，有效治疗自身免疫性疾病和或炎症性皮肤疾病。
银屑病目前没有根治性治疗手段，一般轻度银屑病通过外用药物如糖皮质激性、维甲酸和维生素d衍生物治疗，中度银屑病通过外用药并辅以光疗(puva)可以较好地控制病情，重度银屑病可考虑系统用药如口服氨甲喋呤(methotrexate)、维甲酸类药物(retinoids)，或注射生物制剂。然而，90％的银屑病患者选择外用药物治疗，但高效和副作用小的外用药仍然缺乏，不能满足患者的需求。目前多家制药公司已经针对jak家族成员进行新药研发，但多集中于抑制jak1，jak2和jak3。例如，基于jak3在免疫细胞分化和发育中的作用，辉瑞开发的jak3抑制剂tofacitinib(xeljanz)于2012年被fda批准上市治疗类风湿性关节炎。目前，tyk2抑制剂的研究不很常见，仅有个别tyk2抑制剂进入临床开发阶段。综上上述，这些研究提示抑制tyk2可能是免疫抑制药物研发的新方向，尤其针对il17/il23轴驱动的自身免疫病。开发适合外用的jak抑制剂，特别是针对tyk2的外用抑制剂可能给轻中度银屑病患者带来更加有效，使用方便和安全的治疗手段。
当前jak抑制剂在自身免疫性疾病上的巨大成功和持续开发新的适应症，为开发新型外用针对炎症性皮肤疾病的新药提供了很好的机会。jakafi是第一个进入市场的jak抑制剂,是jak1/jak2抑制剂，用于治疗多细胞血症或骨髓纤维化。辉瑞的tofacitinib是第一个用于治疗自身免疫性疾病的jak抑制剂,对jak1,jak2和jak3的一定的选择性。随着对jaks及其参与细胞因子受体功能的认识，许多制药公司过去几年一直在努力开发具有更好选择性的化合物,从而能够调节特异性的细胞因子信号通路。一些jak1抑制剂,如filgotinib,upatcitinib,和pf04965842或tyk2抑制剂bms-986165,目前正在临床开发自身免疫性疾病,如ra,银屑病,或克罗恩病。最近，另一个jak1/tyk2抑制剂pf-06700841作为临床候选药物，正在开发潜在的治疗炎症性疾病,包括炎症性肠病(ibd),脱发,和银屑病。银屑病发病过程中，单核巨噬细胞和dcs来源的几个细胞因子如il-21和il-23在th17细胞的分化中起关键作用，而大量th17细胞聚集在表皮内又是银屑病的特征之一，阻断th17细胞分化过程中炎症性细胞因子促发的信号传导、以及角朊细胞和其它免疫细胞内炎症因子促发的信号传导，就有望获得高效而安全的自身免疫抑制剂。本发明开发了一系列高效和特异的jak激酶抑制剂，特别是针对tyk2抑制剂、和/或jak1抑制剂、和/或jak1/tyk2双重抑制剂，和/或tyk2/jak2双重抑制剂，可适用与治疗各类系统性自身免疫性疾病和炎症性皮肤疾病，例如以银屑病或湿疹为首选适应症。
技术实现要素：
本发明旨在于开发适合作为系统用药或外用涂抹给药的高效和特异jak激酶抑制剂，tyk2抑制剂、和/或jak1抑制剂、和/或jak1/tyk2双重抑制剂，和/或tyk2/jak2双重抑制剂，可作为治疗银屑病和或湿疹首选适应症的小分子药。
本发明提供的一种小分子化合物，其特征在于，为由如下结构式所示的化合物或其立体异构体，几何异构体，互变异构体，消旋体，水合物，溶剂化物，代谢产物以及药学上可接受的盐或前药：
其中，上述x1、x2选自碳或氮；
在本发明中，该小分子化合物优选为如下结构所示的三类化合物：
上述a1、a2、a3、a4、a5中的一个或一个以上的碳被氮、硫或氧替代；
由上述a1、a2、a3、a4、a5形成的五元环具有芳香性；
即、a1、a2、a3、a4、a5形成的五元环可以为如下结构所示的类似化合物：
上述五元环上，任一或任几个氢原子为r所取代，为如下结构所示的类似化合物；
当r为多取代时，各个r之间相同或不相同；
上述r选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、氨基、胺基、取代的胺基、羧基、酰胺基-conh2、取代的酰胺基、酯基(-c(o)o-rz，rz为烷基、芳基等)、取代的羰基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基。
上述烷基一般为碳原子数不大于6的支链烷基或支链烷基；
上述取代的烷基指烷基碳链上的氢原子中的一个或一个以上为其他基团所取代，此处所指的其他基团可以为环烷基(以类似于
作为优选的方案，当r为取代的烷基时可以为如下结构所示的几类化合物：
即、上述r可以为
其中，上述n为1，2,3......自然数；优选为6以内。
上述r1为烷基，如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基等等支链或直链烷基基团；
该烷基基团上的一个或多个氢原子还可以为环烷基、氰基、卤素、卤代烷(氯甲烷基、二氯甲烷基、三氯甲烷基、氯乙烷基、氯丙烷基、溴甲烷基、二溴甲烷基、三溴甲烷基、溴乙烷基、溴丙烷基、氟甲烷基、二氟甲烷基、三氟甲烷基、氟乙烷基、氟丙烷基等等类似的卤代烷的基团)所取代，以取代的甲基为例，形成如下分子式所示的结构：
r11、r12相同或不相同，分别选自氰基、卤素、卤代烷；
或r1为环烷基，如：环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷等等，该环烷基烷基环上的一个或多个氢原子可以为烷基、氰基、卤素、卤代烷所取代，具体结构可以为如下结构式所示的化合物：
n1为0,1,2,3,4,5；
r13为烷基环上的一个或几个氢原子为卤素、氰基所取代或不取代；
或r1为杂环烷基，如：氮杂、氧杂、硫杂的四元、五元、六元杂环，该杂环烷基的环上的一个或多个氢原子可以为烷基、氰基、卤素、卤代烷所取代，具体结构可以为如下结构式所示的化合物：
b1、b2、b3、b4、b5、b6为碳、氧、硫、氮；
r14为烷基环上的一个或几个氢原子为卤素、氰基所取代或不取代。
此外，上述r还可以为
其中，上述r2、r3为相同或不相同的烷基(如：一般指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基等碳原子数不大于8的烷基)。
此外，上述r还可以为
其中，上述m为0,1,2,3,4,5，即为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷等等，该环烷基烷基环上的一个或多个氢原子可以为r4烷基、氰基、卤素、卤代烷所取代或不取代。
上述取代的胺基指胺基上的氢原子中的一个或一个以上为其他基团所取代，此处所指的其他基团可以为烷基、环烷基、羧基、氰基、磺酸基、酰胺基、酯基等等基团；
作为优选的方案，当r为取代的酰胺基时可以为如下结构所示的几类化合物：
上述r为含氮基团。
如：为
或为nh2，以及与nh2基团发生反应的产物；
作为优选的方案，当r为取代的胺基时可以为如下结构所示的几类化合物：
上述r可以为
其中，上述r1为氢、烷基(如：一般指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基等碳原子数不大于6的烷基)；
上述r2为烷基(同上)、取代的烷基(同上)、环烷基(环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷等)、取代的环烷基(即、环烷基环上的氢原子的一个或多个为卤素、氰基、炔基所取代，如：该
此外，上述r还可以为
其中，上述r3为氢、烷基；
上述r4同于r2。
作为优选的方案，当r为取代的酰胺基时可以为如下结构所示的几类化合物：
此外，上述r还可以为
其中，n为0或自然数；
上述r5为氢、烷基；
上述r6同于r2。
作为优选的方案，当r为取代的羰基时可以为如下结构所示的几类化合物：
上述r为
其中，上述r7同于r2。
作为优选的方案，当r为取代的酰胺基时可以为如下结构所示的几类化合物：
此外，上述r还可以为
其中，上述r17选自氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、羟基、醚基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基；
上述r18选自氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、羟基、醚基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基。
进一步地本发明提供的一种小分子化合物，还具有这样的特点：即、
上述r为
其中，上述r8、r9为相同或不相同的烷基。
进一步地本发明提供的一种小分子化合物，还具有这样的特点：即、
上述r为
其中，所述m为0,1,2,3,4,5。
进一步地本发明提供的一种小分子化合物，还具有这样的特点：即、由上述a1、a2、a3、a4、a5形成的五元环被替换为其他多元芳香环所替代。如：六元环、七元环或苯并环等。
本发明中所提及的取代的环烷基指环基环上的一个或多个氢原子为其他基团所取代，此处所指的其他基团可以为烷基、取代的烷基(同上)、卤素(f，cl，br，i)、羧基、氰基(-cn)、磺酸基(-so4,)、磺酰基(-so2ra，ra为氢、烷基、芳基等)、炔基(-c≡ch，-c≡crb，rb为烷基、芳基等)、酰胺基(-c(o)nrxry，rxry为烷基、芳基等)、酯基(-c(o)o-rz，rz为烷基、芳基等)、芳基、杂芳基等等基团。
本发明中所提及的取代的杂环烷基指在上述取代的环烷基的基础上，其环上的一个或多个碳原子为氧、硫、氮所替代。
本发明中所提及的芳基指苯、萘等六元及以上的芳香环或苯并芳香环。
本发明中所提及的取代的芳基指苯、萘、芴等五元及以上的芳香环或苯并芳香环，环上的一个或多个氢原子为其他基团所取代，此处所指的其他基团可以为烷基、取代的烷基(同上)、卤素(f，cl，br，i)、羧基、氰基(-cn)、磺酸基(-so4,)、磺酰基(-so2ra，ra为氢、烷基、芳基等)、炔基(-c≡ch，-c≡crb，rb为烷基、芳基等)、酰胺基(-c(o)nrxry，rxry为烷基、芳基等)、酯基(-c(o)o-rz，rz为烷基、芳基等)、芳基、杂芳基等等基团。
本发明中所提及的杂芳基指噻吩、吡咯、吡啶、呋喃、咪唑、苯并咪唑、喹啉等五元及以上的芳香杂环或苯并芳香杂环。
本发明中所提及的取代的杂芳基指指噻吩、吡咯、吡啶、呋喃、咪唑、苯并咪唑、喹啉等五元及以上的芳香杂环或苯并芳香杂环，环上的一个或多个氢原子为其他基团所取代，此处所指的其他基团可以为烷基、取代的烷基(同上)、卤素(f，cl，br，i)、羧基、氰基(-cn)、磺酸基(-so4,)、磺酰基(-so2ra，ra为氢、烷基、芳基等)、炔基(-c≡ch，-c≡crb，rb为烷基、芳基等)、酰胺基(-c(o)nrxry，rxry为烷基、芳基等)、酯基(-c(o)o-rz，rz为烷基、芳基等)、芳基、杂芳基等等基团。
进一步地本发明提供的一种小分子化合物，还具有这样的特点：即、用于治疗、预防和缓解与自身免疫相关的炎症性皮肤病。可以为口服，外用，注射等各种剂型。
本发明的作用和效果：
本发明根据jak激酶的蛋白结构，特别是jak1和tyk2的蛋白结构，进行了合理设计，合成的化合物首先进行jak的激酶生化活性检测，跟据ic50建立sar(structure-activityrelationship)，对ic50在200nm以下的强效抑制剂再进行细胞学的测试，并确定化合物的选择性。参见具体活性实验数据可以发现，本发明涉及的几类化合物具有良好的细胞活性的抑制能力。
本发明提供的抑制剂也可以用于其它自身免疫性相关的皮肤病如斑秃，白癜风，皮肤表现为主的红斑狼疮，扁平苔藓，光泽苔藓，硬化萎缩性苔藓，脂膜炎，特应性皮炎，等等。
本发明中获得的适用于口服或静脉给药的jak抑制剂，tyk2抑制剂、和/或jak1抑制剂、和/或jak1/tyk2双重抑制剂也仍然可以用于治疗银屑病及其它自身免疫性疾病如ra,ibd,ms等。
具体实施方式
实施例一、合成化合物(tdm-180607)的一般方法
步骤1：example7c
将原始化合物7a即4,6-二氯嘧啶(10.0g，0.067mol)和乙腈(100ml)加入到三颈瓶中，然后将化合物7b即4-硝基-1h-吡唑(7.59g，0.067mol)和n，n-二异丙基乙胺(12.5ml，0.073mol)加入到三口瓶中，50℃回流16小时后，将反应溶液减压浓缩，过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)得到白色固体化合物7c即4-氯-6-(4-硝基-1h-吡唑-1-基)嘧啶(5.7g,产率38％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.63(d,j＝0.6hz,1h),9.11(d,j＝1.0hz,1h),8.77(d,j＝0.6hz,1h),8.17(d,j＝1.0hz,1h).
步骤2:example7e
将所述化合物7c(2.8g,12.4mmol)，n，n-二异丙基乙胺(2.3ml,13.7mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(20ml)加入到单口瓶中，搅拌5分钟，20℃条件下，将化合物7d即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(1.21g,12.4mmol)加入到单口瓶中，加热至90℃，并搅拌反应16h。然后将反应液倒入甲醇中，析出大量黄色固体，过滤干燥得到化合物7e即n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(4-硝基-1h-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺(3.1g,产率87％)。lcms[m+1]+＝287.2
步骤3:example7f
将所述化合物7e(2.0g,6.98mmol)，铁粉(1.96g,34.96mmol)，氯化铵(1.88g,34.96mmol)，乙醇和水(80ml，乙醇：水＝2:1)加入到单口瓶。然后将混合物在90℃加热3h，冷却至室温，反应液水洗后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后，干燥，过滤浓缩得到黄色固体化合物7f即6-(4-氨基-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-4-胺(1.0g,产率56％)。lcms[m+1]+＝257.1
步骤4:example7(tdm-180607)
将所述化合物7f(50mg,0.194mmol)，三乙胺(19.7mg,0.292mmol)和无水二氯甲烷(10ml)加入到单口瓶中，搅拌5min后，加入化合物7g即2,2-二氟环丙烷羧酸(26mg,0.214mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(56mg,0.292mmol),室温下搅拌16h，将反应液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝0/100)得到白色固体化合物7即2,2-二氟-n-(1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)环丙酰胺(17.8mg,产率25％)。lcms[m+1]+＝361.0
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.75(s,1h),9.75(s,1h),8.69(d,j＝0.5hz,1h),8.49(s,1h),7.97(s,1h),7.88(s,1h),7.49(s,1h),7.03(s,1h),3.83(s,3h),2.77(ddd,j＝13.5,10.9,7.9hz,1h),2.17–1.89(m,2h).
上述表内化合物性状和产率如下：
白色固体tdm-180608即3,3,3-三氟-n-(1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丙酰胺(5mg,产率:12％)
灰白色固体tdm-180613即n-(1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)环丙烷甲(5mg,产率:4％)
黄色固体tdm-180614即2-氰基-n-(1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙酰胺(25.2mg,产率:4％)
实施例二、合成化合物tdm-180611的一般方法
步骤1:example11
将所述化合物7f(100mg,0.388mmol)，乙基磺酰氯(16mg,0.128mmol)，三乙胺(39.4mg,0.584mmol)和无水二氯甲烷加入到单口瓶中，室温下搅拌16h后，将反应液浓缩，刮板纯化得到白色固体化合物11即n-(1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙磺酰胺(16.2mg,产率12％)。lcms[m+1]+＝349.0。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.24(s,1h),8.48(s,1h),7.99(s,1h),7.72(s,1h),7.52(s,1h),7.10(s,1h),3.83(s,3h),3.06(q,j＝7.3hz,2h),1.22(d,j＝7.4hz,3h).
灰白色固体化合物tdm-180612即n-(1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丙烷-1-磺酰胺(16.2mg,产率:16％)
实施例三、合成化合物tdm-180627的一般方法
步骤1：example27c
将所述化合物7f(50mg,0.194mmol)，三乙胺(19.7mg,0.292mmol)和无水二氯甲烷加入到单口瓶中，搅拌5min后，加入化合物27b即2-乙酰氧基乙酸(25mg,0.214mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(56mg,0.292mmol)，室温下搅拌2h，将反应液浓缩，刮板纯化得到白色固体化合物27c即2-((1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)氨基)-2-氧代乙基乙酸酯(40mg,产率58％)。lcms[m+1]+＝357.0
步骤2：example27(tdm-180627)
将所述化合物27c(40mg,0.112mmol)，氢氧化锂(27mg,1.12mmol)，四氢呋喃(5ml)和水(3ml)加入到单口烧瓶中，室温下搅拌2h，反应液水洗后加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，并将有机相干燥，过滤浓缩，通过刮板和高压液相色谱制备得到白色固体化合物27即2-羟基-n-(1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙酰胺(6mg,yield17％)。lcms[m+1]+＝315.1
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.19(s,1h),9.75(s,1h),8.79(s,1h),8.49(s,1h),8.00(d,j＝16.6hz,2h),7.49(s,1h),7.02(s,1h),4.01(d,j＝5.7hz,2h),3.83(s,3h).
实施例四、合成化合物tdm-180615的一般方法
步骤1：example15c
将原始化合物15a即4,6-二氯嘧啶(5.96g,40mmol)和乙腈(50ml)加入到三颈瓶中，然后将化合物15b即1h-吡唑-4-羧酸乙酯(5.6g,40mmol)和碳酸钾(16.58g,120mmol)加入到三口瓶中。将反应液加热到50℃反应16h，冷却至室温，将反应液水洗后加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，并将有机相干燥浓缩，过柱纯化得到白色固体化合物15c即1-(6-氯嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯(5.92g,产率58.7％)。lcms[m+1]+＝253.0
步骤2：example15e
将所述化合物15c(2.0g,7.92mmol)，碳酸钾(3.28g,23.8mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(25ml)加入到单口瓶中，搅拌5min，20℃条件下，将化合物15d即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(1.21g,12.4mmol)加入到单口瓶中，加热至70℃，并搅拌反应16h。然后将反应液过滤，滤液浓缩得到白色固体，加入甲醇(20ml)洗涤后过滤干燥，得到化合物15e即1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯(1.42g,产率57％)。lcms[m+1]+＝314.1
步骤3：example15f
将所述化合物15e(500mg,1.59mmol)，氢氧化钠(191mg,4.79mmol)，四氢呋喃(20ml)和水(10ml)加入到单口烧瓶中，室温下搅拌16h，将反应液水洗后加入乙酸乙酯萃取后，分离水相，用1m盐酸调节水相ph，析出白色固体，过滤干燥得到化合物15f即1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸(300mg,yield66％)。lcms[m+1]+＝286.0。
步骤4：example15(tdm-180615)
将所述化合物15f(50mg,0.175mmol)，n，n-二异丙基乙胺(52mg,0.40mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到单口瓶中，搅拌5min。20℃条件下，将化合物15g即2,2,2-三氟乙胺(20mg,0.20mmol)和hatu(77mg,0.20mmol)加入到单口瓶中，室温反应16h。将反应液倒入水中，析出白色固体，过滤干燥后用高压液相色谱制备得到白色固体化合物15即1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-n-(2,2,2-三氟乙基)-1h-吡唑-4-甲酰胺(13.2mg,产率24％)。lcms[m+1]+＝367.0
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.93(s,1h),9.22(s,1h),9.01(s,1h),8.56(s,1h),8.24(s,1h),8.00(s,1h),7.52(s,1h),7.11(s,1h),4.14–4.01(m,3h),3.84(s,3h).
白色固体化合物tdm-180616即n-(氰基甲基)-1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-甲酰胺(41.2mg,产率:64％)
实施例四、合成化合物tdm-180628的一般方法
步骤1：example28c
将原始化合物28b即1-丙胺(5.96g,40mmol)，三乙胺(552mg,5.45mmol)，1h-吡唑-4-磺酰氯(300mg,1.818mmol)和二氯甲烷(10ml)加入到单口瓶中，混合溶液室温搅拌反应2小时后，浓缩，采用砂芯漏斗过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到黄色油状化合物28c即n-丙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(360mg,crude)。lcms[m+1]+＝190。
步骤2：example28e
将所述化合物28c(180mg,0.95mmo)，化合物28d即4,6-二氯嘧啶(709mg,4.76mmol)，碳酸钾(393mg,2.85mmol)和乙腈(10ml)加入到单口瓶中，加热至60℃反应4h。反应液过滤，滤液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到白色固体化合物28e即1-(6-氯嘧啶-4-基)-n-丙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(150mg,产率52.4％)。lcms[m+1]+＝302。
步骤3：example28(tdm-180628)
将所述化合物28e(60mg,0.198mmol)，化合物28f即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(38.8mg,0.297mmol)，碳酸钾(82.9mg,0.594mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到单口瓶中，混合物加热至70℃反应4h，反应液过滤，滤液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝0/100)后，采用高压液相色谱制备得到白色固体化合物28即1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-n-丙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(25mg,产率34.9％)。lcms[m+1]+＝363.0
1hnmr(400mhz,meod)δ8.91(d,j＝0.5hz,1h),8.51(s,1h),8.01(s,2h),7.56(s,1h),7.14(s,1h),3.90(s,3h),2.90(t,j＝7.0hz,2h),1.60–1.47(m,2h),0.92(t,j＝7.4hz,3h).
实施例五、合成化合物tdm-180629的一般方法
步骤1：example29c
将原始化合物29b即1-乙胺(9.09ml,18.18mmol)，三乙胺(552mg,5.45mmol)，1h-吡唑-4-磺酰氯(300mg,1.818mmol)和二氯甲烷(20ml)加入到单口瓶中，混合溶液在室温下搅拌反应2h后，将反应液浓缩，采用砂芯漏斗过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到黄色油状化合物29c即n-乙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(310mg,crude)。lcms[m+1]+＝176
步骤2：example29e
将所述化合物29c(160mg,0.914mmol)，化合物29d即4,6-二氯嘧啶(408mg,2.74mmol)，碳酸钾(379mg,2.74mmol)和乙腈(10ml)加入到单口瓶中，加热至60℃反应3h。冷却至室温后将反应液过滤，滤液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到白色固体化合物29e即1-(6-氯嘧啶-4-基)-n-乙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(130mg,产率49.6％)。lcms[m+1]+＝288
步骤3：example29(tdm-180629)
将所述化合物29e(30mg,0.1045mmol)，化合物29f即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(16.22mg,0.1672mmol)，碳酸钾(43.26mg,0.3135mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到单口瓶中，加热至70℃反应4h。反应液过滤，将滤液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/100)后，采用高压液相色谱制备得到黄色固体化合物29即1-(6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-n-乙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(15mg,产率41.2％))。lcms[m+1]+＝349.4
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.98(s,1h),8.84(d,j＝0.7hz,1h),8.56(s,1h),8.15(s,1h),8.02(s,1h),7.56(dd,j＝14.6,9.0hz,2h),7.13(s,1h),3.84(s,3h),2.92-2.83(m,2h),1.04(t,j＝7.2hz,3h).
实施例六、合成化合物tdm-180619的一般方法
步骤1：example19c
将原始化合物19a即2,4-二氯吡啶(5.00g,33.8mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(50ml)加入到三颈瓶中，然后将化合物19b即4-硝基-1h-吡唑(3.44g,30.4mmol)和碳酸铯(16.5g,50.7mmol)加入到三口瓶中，100℃回流16小时。然后冷却至室温，将反应液水洗后加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后干燥浓缩，过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)得到白色固体化合物19c即2-氯-4-(4-硝基-1h-吡唑-1-基)(1.33g,产率17.5％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.93(d,j＝4.4hz,1h),8.70(s,1h),8.59(s,1h),8.20(d,j＝4.2hz,1h),8.05(s,1h).
步骤2:example19e
将所述化合物19c(1.19g,5.3mmol)，碳酸钠(786mg,7.4mmol))，化合物19d即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(514mg,5.3mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(30ml)加入到单口瓶中，搅拌5min，20℃条件下，将pd2(dba)3(485mg,0.53mmol)和xantphos(613mg,1.06mmol)加入到单口瓶中，置换n2，加热至130℃，并在n2保护下搅拌反应22h。冷却至室温，将反应液水洗后加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后干燥浓缩，过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到黄色固体化合物19e即n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(4-硝基-1h-吡唑-1-基)吡啶-2-胺(400mg,产率26.5％)。lcms[m+1]+＝286.0
步骤3:example19f
将所述化合物19e(360mg,1.263mmol)，铁粉(353.7mg,6.316mmol)，氯化铵(337.9mg,6.316mmol)，乙醇和水(80ml，乙醇：水＝4:1)加入到单口瓶中，然后将混合物在90℃加热3h。冷却至室温，反应液水洗后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤后，干燥，过滤浓缩得到黄色固体化合物19f即4-(4-氨基-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-胺(260mg,产率80.7％)。lcms[m+1]+＝256.1
步骤4:example19(tdm-180619)
将所述化合物19f(20mg,0.078mmol)，三乙胺(12mg,0.118mmol)和无水二氯甲烷(6ml)加入到单口瓶中，搅拌5min后，加入化合物19g即3,3,3-三氟丙酸(11mg,0.0858mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(22.6mg,0.118mmol)，室温下搅拌3h。然后将反应液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝0/100)得到白色固体化合物19即3,3,3-三氟-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丙酰胺(8mg,产率28.1％)。lcms[m+1]+＝366.0
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.64(s,1h),8.91(s,1h),8.57(s,1h),8.13(d,j＝5.7hz,1h),7.94(s,1h),7.84(s,1h),7.41(d,j＝0.6hz,1h),7.13-6.93(m,2h),3.81(s,3h),3.51(q,j＝11.1hz,2h).
灰白色固体化合物tdm-180620即2,2-二氟-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)环丙烷甲(7mg,产率:25％)
灰白色固体化合物tdm-180621即n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)环丙烷甲(15mg,产率:39.4％)
灰白色固体化合物tdm-180622即2-氰基-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙酰胺(8mg,产率:31.9％)
实施例七、合成化合物tdm-180623的一般方法
步骤1：example23(tdm-180623)
将所述化合物19f(50mg,0.196mmol)，三乙胺(29.7mg,0.294mmol)，四氢呋喃(15ml)和无水二氯甲烷(15ml)加入到单口瓶中，搅拌5分钟后，加入化合物23b即乙基磺酰氯(25.2mg,0.196mmol)，室温下搅拌反应3h。然后将反应液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝0/100)得到黄色固体化合物23即n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙磺酰胺(8.0mg,产率11.7％)。lcms[m+1]+＝348.1
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.66(s,1h),9.40(s,1h),8.39(s,1h),8.08(d,j＝6.2hz,1h),7.95(s,1h),7.74(s,1h),7.49(s,1h),7.31-7.22(m,1h),7.22-7.16(s,1h),3.84(s,3h),3.12(q,j＝7.3hz,2h),1.24(t,j＝8.2hz,3h).
黄色固体化合物tdm-180624即n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丙烷-1-磺酰胺(14mg,产率:19.8％)
实施例八、合成化合物tdm-180626的一般方法
步骤1：example26c
将所述化合物26a(30mg,0.118mmol)，三乙胺(17.9mg,0.177mmol)，四氢呋喃(8ml)和无水二氯甲烷(8ml)加入到单口瓶中，搅拌5min后，加入化合物26b即2-乙酰氧基乙酸(11.1mg,0.129mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(33.9mg,0.177mmol)，混合溶液在室温下搅拌3h。然后将反应液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝0/100)得到白色固体化合物26c即2-((1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)氨基)-2-氧代乙基乙酸酯(30mg,产率71.6％)。lcms[m+1]+＝356.1
步骤2：example26(tdm-180626)
将所述化合物26c(30mg,0.0845mmol)，氢氧化锂(20.3mg,0.845mmol)，四氢呋喃(6ml)和水(0.6ml)加入到单口烧瓶中，室温下搅拌3h。然后用无水硫酸钠干燥反应液，过滤浓缩，刮板纯化得到棕色固体化合物26即2-羟基-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙酰胺(16mg,产率60.5％)。lcms[m+1]+＝314.1
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.14(s,1h),8.91(s,1h),8.57(s,1h),8.12(d,j＝5.6hz,1h),7.94(d,j＝6.3hz,2h),7.41(s,1h),7.06-6.98(m,1h),5.79(t,j＝5.9hz,1h),4.01(d,j＝5.9hz,2h),3.81(s,3h)。
实施例九、合成化合物tdm-180632的一般方法
步骤1：example32b
将所述化合物29c(193mg,1.1029mmol)，化合物32a即2,4-二氯吡啶(486.4mg,3.3087mmol)，碳酸铯(1078mg,3.3087mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(3ml)加入到单口瓶中，加热至50℃反应3h。反应液水洗后加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后，干燥过滤浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)得到白色固体化合物32b即1-(2-氯吡啶-4-基)-n-乙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(113mg,产率35.9％)。lcms[m+1]+＝287
步骤2：example32(tdm-180632)
将所述化合物32b(30mg,0.1053mmol)，化合物32c即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(30.6mg,0.316mmol)，碳酸钾(102.9mg,0.3mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到单口瓶中，搅拌5min，20℃条件下，将pd2(dba)3(9.6mg,0.01mmol)和xantphos(12.2mg,0.02mmol)加入到单口瓶中，置换n2，加热至130℃，并在n2保护下搅拌反应4h。冷却至室温后将反应液过滤，滤液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/100)得到黄色固体化合物32即n-乙基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-磺酰胺(17.3mg,产率47.3％)。lcms[m+1]+＝348.0
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.08(s,1h),9.02(s,1h),8.19(d,j＝5.7hz,1h),8.08(s,1h),7.94(s,1h),7.52(t,j＝5.7hz,1h),7.43(s,1h),7.22(dd,j＝5.7,1.9hz,1h),7.15(d,j＝1.7hz,1h),3.81(s,3h),2.98–2.81(m,2h),1.04(t,j＝7.2hz,3h).
实施例十、合成化合物tdm-180633的一般方法
步骤1：example33b
将所述化合物28c(120mg,0.634mmol)，化合物33a即2,4-二氯吡啶(282mg,1.9mmol)，碳酸铯(620mg,1.9mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到单口瓶中，加热至60℃反应2h。反应液水洗后加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后，干燥过滤浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)得到白色固体化合物33b即1-(2-氯吡啶-4-基)-n-丙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(100mg,产率52.6％)。lcms[m+1]+＝301
步骤2：example33(tdm-180633)
将所述化合物33b(30mg,0.1mmol)，化合物32c即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(30.6mg,0.3mmol)，碳酸钾(102.9mg,0.3mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到单口瓶中，搅拌5min，20℃条件下，将pd2(dba)3(9.6mg,0.01mmol)和xantphos(12.2mg,0.02mmol)加入到单口瓶中，置换n2，加热至130℃，并在n2保护下搅拌反应4h。反应液过滤，将滤液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/100)后，采用高效液相相色谱制备得到黄色固体化合物33即n-丙基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-磺酰胺(20mg,产率49.6％)。lcms[m+1]+＝362.1
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.34(s,1h),9.15(s,1h),8.16(d,j＝6.1hz,1h),8.12(s,1h),7.96(s,1h),7.59(t,j＝5.8hz,1h),7.48(s,1h),7.25(s,1h),3.83(s,3h),2.82(dd,j＝13.0,7.0hz,2h),1.49-1.39(m,2h),0.84(t,j＝7.4hz,3h).
实施例十一、合成化合物tdm-180634的一般方法
步骤1：example34c
将原始化合物34a即2,4-二氯吡啶(3.0g,20.3mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(30ml)加入到三颈瓶中，然后将化合物34b即1h-吡唑-4-羧酸乙酯(2.56g,18.24mmol)和碳酸铯(9.9g,30.45mmol)加入到三口瓶中，60℃反应4h。然后将反应液冷却至室温，加水洗涤反应液后加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后干燥浓缩，过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)得到白色固体化合物34c即1-(2-氯吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯(2.9g,产率56.8％)。lcms[m+1]+＝253.0
步骤2：example34e
将所述化合物34c(1.006g,4.0mmol)，碳酸钠(594mg,5.6mmol)，化合物34d即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(388mg,4.0mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(32ml)加入到单口瓶中，搅拌5min，20℃条件下，将pd2(dba)3(36.6mg,0.04mmol)和xantphos(46.3mg,0.08mmol)加入到单口瓶中，置换n2，加热至130℃，并在n2保护下搅拌反应3h。然后将反应液冷却至室温，加水洗涤反应液后加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后干燥浓缩，过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到黄色固体化合物34e即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯(910mg,产率72.9％)。lcms[m+1]+＝313.0
步骤3：example34f
将所述化合物34e(810mg,2.6mmol)，氢氧化钠(1.04g,26.0mmol)，四氢呋喃(30ml)和水(10ml)加入到单口烧瓶中，室温下搅拌24h，将反应液水洗后加入乙酸乙酯萃取后，分离水相，用1m盐酸调节水相ph＝5，析出白色固体，过滤干燥的化合物34f即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸(510mg,产率69.1％)。lcms[m+1]+＝285.0
步骤4：example34(tdm-180634)
将所述化合物34f(64mg,0.225mmol)，n，n-二异丙基乙胺(70mg,0.54mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(6ml)加入到单口瓶中，搅拌5min。20℃条件下，将化合物34g即2,2,2-三氟乙胺(26.8mg,0.270mmol)和hatu(128.5mg,0.338mmol)加入到单口瓶中，室温反应2h。然后将反应液倒入水中，析出白色固体，过滤干燥后用高压液相色谱制备得到白色固体化合物34即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-n-(2,2,2-三氟乙基)-1h-吡唑-4-甲酰胺(48mg,产率58.4％)。lcms[m+1]+＝366.0
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.32(s,1h),9.13(s,1h),8.94(s,1h),8.30(s,1h),8.16(d,j＝6.5hz,1h),7.96(s,1h),7.48(s,1h),7.22(d,j＝4.7hz,2h),4.10(dd,j＝9.8,6.3hz,2h),3.84(s,3h).
灰色固体化合物tdm-180635即n-(氰基甲基)-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)吡啶-4-基)-1h-吡唑-4-甲酰胺(24.5mg,产率:33.8％)
实施例十二、合成化合物tdm-180601的一般方法
步骤1:example1c
将化合物1a即2,4-二氯嘧啶(10.0g，0.067mol)和乙腈(120ml)的浆液加入到三颈瓶中，化合物1b即4-硝基-1h-吡唑(7.23g，0.064mol)和n，n-二异丙基乙胺(12.5ml，0.073mol)依次加入，在20℃搅拌。在室温下搅拌16小时后，将反应溶液减压浓缩。通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化残余物，得到白色固体化合物1c即2-氯-4-(4-硝基-1h-吡唑基-1-基)嘧啶(5.6g，产率37％)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.31(d,j＝5.0hz,1h),8.79(s,1h),8.32(s,1h),7.94(d,j＝5.4hz,1h).
步骤2:example1e
将化合物1c(5.0g，22.16mmol)和n，n-二异丙基乙胺(3.44g，26.6mmol)在n，n-二甲基甲酰胺(50ml)中的混合物在室温下搅拌5分钟。向该混合物中加入化合物1d即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(2.37g，24.4mmol)。在60℃回流16小时后，将反应溶液倒入水(100ml)中，用乙酸乙酯(100ml×4)萃取混合物。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，并将滤液减压浓缩。将残余物用二氯甲烷(10ml)搅拌30分钟，然后过滤，得到黄色固体化合物1e即n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(4-硝基-1h-吡唑-1-基)嘧啶-2-胺(6.2g，收率97％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.90(s,1h),9.37(s,1h),8.72-8.56(m,2h),7.96(s,1h),7.25(t,j＝7.0hz,1h),3.85(s,3h).
步骤3:example1
向化合物1e(5.0g，17.5mmol)的乙酸(100ml)混合物中加入铁粉(29.4g，525mmol)。将所得混合物在60℃加热4小时，然后冷却，然后加入四氢呋喃(200ml)，过滤，用氨水溶液调节滤液至ph9，过滤，用无水硫酸钠干燥，浓缩。得到黄色固体化合物1f即4(4-氨基-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(1.85g，收率41.3％)。lcms[m+1]+＝257.0
步骤4:example1(tdm-180601)
在二氯甲烷(30ml)中加入化合物1f(100mg，0.39mmol)和三乙胺(59.1mg，0.585mmol)，在室温下搅拌5分钟。向该混合物中加入化合物1g即环丙基甲酸(36.9mg，0.429mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(112.1mg，0.585mmol)。将所得混合物在室温下搅拌4小时，然后在减压下浓缩。通过刮板(石油醚/乙酸乙酯＝0/100)纯化得到灰白色固体化合物1即n-(1(2(-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)环丙烷酰胺(28mg，产率22.2％)。lcms[m+1]+＝325.0
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.53(s,1h),9.66(s,1h),8.77(s,1h),8.45(d,j＝5.3hz,1h),8.06-7.73(m,2h),7.55(s),7.10(d,j＝6.4hz,1h),3.82(s,3h),1.78-1.67(m,1h),1.25(d,j＝10.2hz,2h),0.81(d,j＝6.1,2h).
灰色固体化合物tdm-180602即3,3,3-三氟-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丙酰胺(55mg,产率:41.6％)
灰色固体化合物tdm-180603即2,2-二氟-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)环丙烷-1-甲酰胺(61mg,产率:43.4％)
黄色固体化合物tdm-180604即2-氰基-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙酰胺(60mg,产率:47.5％)
黄色固体化合物tdm-180605即n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙磺酰胺(38mg,产率:28.1％)
黄色固体化合物tdm-180606即n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丙烷-1-磺酰胺(30mg,产率:21.2％)
实施例十三、合成化合物tdm-180625的一般方法
步骤1:example25c
在二氯甲烷(30ml)中加入化合物25a(100mg，0.39mmol)和三乙胺(59.1mg，0.585mmol)，在室温下搅拌5分钟。向该混合物中加入化合物25b即2-乙酰氧基乙酸(50.7mg，0.429mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(112.1mg，0.585mmol)。将所得混合物在室温下搅拌4小时，然后在减压下浓缩。通过刮板(石油醚/乙酸乙酯＝0/100)纯化得到灰白色固体化合物25c即2-((1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)氨基)-2-氧代乙基乙酸酯(103mg，产率74.0％)。lcms[m+1]+＝357.0
步骤2:example25(tdm-180625)
将化合物25c(70mg，0.196mmol)溶于四氢呋喃(20ml)和水(2ml)的混合溶液中，然后加入氢氧化锂(47mg，1.96mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。然后将混合物用无水硫酸镁干燥并减压浓缩。通过刮硅胶板纯化，得到灰白色固体化合物25即2-羟基-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙酰胺(21mg，产率34.1％)。lcms[m+1]+＝315.1
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.26(s,1h),9.70(s,1h),8.91(s,1h),8.46(d,j＝5.3hz,1h),8.05(s,1h),7.87(s,1h),7.55(s,1h),7.12(d,j＝5.3hz,1h),5.82(t,j＝5.3hz,1h),4.03(d,j＝5.3hz,2h),3.83(s,3h).
实施例十四、合成化合物tdm-180609的一般方法
步骤1:example9c
将化合物9a(5.0g，0.0335mol)和乙腈(80ml)加入到三颈瓶中，然后依次加入化合物9b(4.7g，0.0335mol)即1h-吡唑-4-羧酸乙酯和碳酸钾(13.9g，0.1mol)，在50℃下搅拌过夜。将反应液倒入冰水中。用乙酸乙酯(50ml×2)萃取后，将合并的有机层用无水硫酸镁干燥并减压浓缩。通过过柱(石油醚/etoac＝8/1)纯化，得到黄色固体化合物9c即1-(2-氯嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯(3.2g，产率38％)。lcms[m+1]+＝253.6
步骤2:example9e
在1,4-二氧六环(40ml)中加入化合物9c(500mg,1.98mmol)，化合物9d(250mg,2.58mmol)即1-甲基-1h-吡唑-4-胺,醋酸钯(44mg,0.20mmol)，碳酸钾(820mg,5.95mmol)和4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(229mg,0.40mmol)，在100℃下搅拌过夜。然后冷却，用乙酸乙酯(20ml×2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩，并通过过柱(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到黄色固体化合物9e即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯(153mg，产率25％)。
步骤3:example9f
在三颈瓶中依次加入化合物9e(153mg，0.48mmol),四氢呋喃(5ml)和氢氧化锂(35.1mg，1.465mmol)，在室温下过夜搅拌。将反应溶液用水稀释，用稀盐酸调节至ph＝2。用乙酸乙酯(50ml×3)萃取后，合并的有机层并用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，得到白色固体化合物9f即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸(90mg，产率64.7％)。lcms[m+1]+＝286.0
步骤4:example9
将化合物9f(45mg，0.157mmol)和n，n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到三颈瓶中，然后一边搅拌依次加入化合物9g(16.78mg，0.181mmol)，n，n-二异丙基乙胺(70.2mg,0.544mmol)和2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(68.9mg，0.181mmol)，在室温下搅拌过夜，将反应溶液倒入冰水(20ml)中，然后过滤并干燥，得到黄色固体化合物9即n-(氰甲基)-1(2(-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-甲酰胺(30.3mg，收率59.4％)。lcms[m+1]+＝324.0
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.78(s,1h),9.17-9.4(m,2h),8.55(d,j＝4.0hz,1h),8.29(s,1h),7.92(s,1h),7.61(s,1h),7.19(s,j＝4.0hz,1h),4.15-4.07(m,2h),3.85(s,3h)
白色固体化合物tdm-180610即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-n-(2,2,2-三氟乙基)-1h-吡唑-4-甲酰胺(21mg,产率:36.3％)
实施例十五、合成化合物tdm-180630的一般方法
步骤1:example30c
将化合物30b即1-丙胺(1.07g,18.18mmol)，三乙胺(552mg,5.45mmol)，1h-吡唑-4-磺酰氯(300mg,1.818mmol)和二氯甲烷(10ml)加入到单口瓶中，混合溶液室温搅拌反应2h后，浓缩，采用砂芯漏斗过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到黄色固体化合物30c即n-丙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(390mg,粗品)。lcms[m+1]+＝190
步骤2:example30e
将化合物30c(190mg,1mmol)，化合物30d即2,4-二氯嘧啶(447mg,3mmol)，碳酸钾(414mg,3mmol)和乙腈(10ml)加入到单口瓶中，加热至60℃反应4h，过滤，将滤液水洗后加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后干燥浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到白色固体化合物30e即1(2-氯嘧啶-4-基)-n-丙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(132mg,产率43.9％)。lcms[m+1]+＝302
步骤3:example30(tdm-180630)
将化合物30e(60mg,0.198mmol)，化合物30f即1-甲基-1h-吡唑-4-胺(38.8mg,0.297mmol)，碳酸钾(82.9mg,0.594mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入到单口瓶中，加热至70℃反应4h，反应液过滤，将滤液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/100)后，采用hplc制备得到白色固体化合物30即1(2-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基嘧啶-4-基)-n-丙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(25mg,产率34.9％)。lcms[m+1]+＝363
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.80(s,1h),8.84(s,1h),8.58(d,j＝4.8hz,1h),8.18(s,1h),7.88(s,1h),7.68(t,j＝5.8hz,1h),7.20(d,j＝5.3hz,1h),3.83(s,3h),2.82(dd,j＝13.1,6.8hz,2h),1.49-1.37(m,2h),0.84(t,j＝7.4hz,3h).
实施例十六、合成化合物tdm-180631的一般方法
步骤1:example31c
将化合物31b即1-乙胺(9.09ml,18.18mmol)，三乙胺(552mg,5.45mmol)，1h-吡唑-4-磺酰氯(300mg,1.818mmol)和二氯甲烷(20ml)加入到单口瓶中，混合溶液在室温搅拌反应2h后，浓缩，采用砂芯漏斗过柱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到黄色油状化合物31c(310mg,粗品)，即n-乙基-1h-吡唑-4-磺酰胺。lcms[m+1]+＝176
步骤2:example31e
将化合物31c(160mg,0.914mmol)，化合物31d即2,4-二氯嘧啶(408mg,2.74mmol)，碳酸钾(379mg,2.74mmol)和乙腈(10ml)加入到单口瓶中，加热至60℃反应3h，过滤，将滤液浓缩，刮板纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到白色固体化合物31e即1-(2-氯嘧啶-4-基)-n-乙基-1h-吡唑-4-磺酰胺(130mg,产率49.6％)。lcms[m+1]+＝288
步骤3:example31(tdm-180631)
example31(tdm-180631)按照制备tdm-180629中所述的方法制备，得白色固体即n-乙基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-磺酰胺(130mg，收率49.6％)。lcms[m+1]+＝349.4
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.80(s,1h),8.85(s,1h),8.58(d,j＝4.6hz,1h),8.18(d,j＝0.4hz,1h),7.88(s,1h),7.66(t,j＝5.6hz,2h),7.20(d,j＝5.3hz,1h),3.83(s,3h),2.98-2.79(m,2h),1.05(t,j＝7.2hz,3h).
实施例十七、合成化合物tdm-180710的一般方法
步骤1:example110c
在室温下向化合物110a(200mg，0.95mmol)即4-氯-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺和化合物110b(130.8mg，1.045mmol)即甲基1h-吡唑-3-羧酸甲酯的混合物中加入碳酸铯(928.6mg，2.85mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(15ml)。然后将混合物加热至100℃并搅拌2.5小时。反应结束后用乙酸乙酯(50ml×3)萃取混合物。将有机层用饱和盐水(60ml×6)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并将滤液减压浓缩。向残余物中加入etoac和pe，过滤收集沉淀，得到白色固体化合物110c即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-3-羧酸甲酯(181.4mg，收率64％)。lcms[m+1]+＝300.
步骤2:example110d
在室温下向化合物110c(181.4mg，0.61mmol)的甲醇(5ml)和四氢呋喃(5ml)的混合溶液中加入氢氧化锂(240mg)的水溶液。然后将混合物在室温下搅拌3小时。减压浓缩混合物以除去过量的甲醇和四氢呋喃，然后用盐酸(2m)中和溶液，过滤收集沉淀。沉淀中加入乙醇，减压浓缩带走水分，得到白色固体化合物110d(151.5mg，收率87％)，即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-3-羧酸。lcms[m+1]+＝286.
步骤3:example110(tdm-180710)
在室温下向化合物110e(34mg，0.368mmol)即2-氨基乙腈的n,n-二甲基甲酰胺(10ml)混合物中加入n，n-二异丙基乙胺(126.6mg，0.98mmol)。将混合物搅拌5分钟，然后向混合物中加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(139.65mg，0.368mmol)和化合物110d(70mg，0.245mmol)，并在室温下搅拌3小时。反应结束后向混合物中加入水(40ml)，过滤收集沉淀物。向沉淀中加入乙酸乙酯和石油醚，然后通过过滤收集到白色固体化合物110,tdm-180710,即n-(氰基甲基)-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-3-甲酰胺(56.6mg，产率71.5％)。lcms[m+1]+＝324.
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.83(s,1h),9.22(t,j＝5.6hz,1h),8.78(s,1h),8.60(d,j＝4.8hz,1h),7.97(s,1h),7.52(s,1h),7.28(d,j＝5.3hz,1h),7.03(d,j＝2.4hz,1h),4.33(d,j＝5.7hz,2h),3.85(s,3h).
实施例十八、合成化合物tdm-180711的一般方法
步骤1:example111c
在室温下向化合物111a(200mg，0.95mmol)即4-氯-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺和化合物111b(130.8mg，1.045mmol)即甲基1h-吡咯-3-羧酸甲酯的混合物中加入碳酸铯(928.6mg，2.85mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(15ml)。然后将混合物加热至100℃并搅拌2.5小时。反应结束用乙酸乙酯(50ml×3)萃取混合物。将有机层用饱和盐水(60ml×6)洗涤，并用无水硫酸钠干燥，然后将滤液减压浓缩。向残余物中加入乙酸乙酯和石油醚，过滤收集沉淀物，得到白色固体化合物111c(238.5mg，收率84％)即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡咯-3-羧酸甲酯。lcms[m+1]+＝299.
步骤2:example111d
在室温下向化合物111c(238.5mg，0.8mmol)的甲醇(5ml)和四氢呋喃(5ml)的混溶液中加入氢氧化锂(400mg)的水(10ml)溶液。然后将混合物在室温下搅拌3小时。减压浓缩混合物以除去过量的甲醇和四氢呋喃，然后用盐酸(2m)中和溶液，过滤收集沉淀。向沉淀中加入乙醇，减压浓缩带着残余水分，得到淡黄色固体化合物111d(219mg，收率96.5％)，即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡咯-3-羧酸。lcms[m+1]+＝285.
步骤3:example111(tdm-180711)
在室温下将化合物111d(100mg，0.35mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中，然后加入n，n-二异丙基乙胺(181mg，1.4mmol)，将混合物搅拌5分钟，然后向混合物中加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(139.65mg)，0.368mmol)和化合物111e(48.6mg，0.525mmol)即2-氨基乙腈，并在室温下搅拌3小时。向混合物中加入水(40ml)，过滤收集沉淀物。向沉淀中加入乙酸乙酯和石油醚，然后通过过滤收集得白色固体化合物111，tdm-180711(73.1mg，产率64.8％)，即n-(氰基甲基)-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡咯-3-甲酰胺。lcms[m+1]+＝323
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.66(s,1h),8.87(s,1h),8.48(d,j＝5.3hz,1h),8.29(t,j＝1.9hz,1h),7.88(s,1h),7.76(s,1h),7.54(s,1h),7.09(d,j＝5.5hz,1h),6.77(dd,j＝3.2,1.6hz,1h),4.29(d,j＝5.6hz,2h),3.84(s,3h).
实施例十九、合成化合物tdm-180738的一般方法
步骤1：example138b
将化合物b0(627mg,3.0mmol),化合物138a(508mg,3.3mmol)和cs2co3(1.93g,6.0mmol)的dmf(20ml)的混合物加热至100℃，搅拌2小时。将混合物倒入(～50ml)中，过滤收集沉淀出的固体。固体粗品用etoac/pe(～1:2)打浆，过滤，干燥固体，得到浅绿色固体化合物138b(620mg，58％收率)，即5-甲基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯。
lcms[m+1]+＝328.2
步骤2：example138c
向化合物138b(570mg,1.74mmol)的thf(15ml)和meoh(15ml)的混合物中加入lioh(15ml,饱和的)。混合物在室温下搅拌2小时。混合物用h2o(30ml)稀释，用etoac(50ml)萃取。分离水层并用hcl(1n)调节ph＝2，过滤收集沉淀出的固体，真空干燥。得到白色固体化合物138c(440mg，78％收率)即5-甲基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸。
lcms[m+1]+＝300.1
步骤3：example138(tdm-180738)
向化合物138c(80mg，0.27mmol)即3-甲基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸的n,n-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中加入n，n-二异丙基乙胺(139mg，1.08mmol)，将混合物搅拌5分钟，然后加入化合物138d(37.5mg，0.405mmol)即氨基乙腈盐酸盐和2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(153.9mg，0.405mmol)在室温下搅拌16小时。向混合物中加入水，过滤收集沉淀，向沉淀中加入乙醇，减压浓缩除去残余的水分，向残留物中加入乙酸乙酯和石油醚，过滤收集沉淀，得到白色固体化合物138，tdm-180738，(71.6mg，产率78.7％)即3-甲基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-n-(2,2,2-三氟乙基)-1h-吡唑-4-甲酰胺。lcms[m+1]+＝3381hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.76(s,1h),9.32(s,1h),9.14(s,1h),8.51(d,j＝5.3hz,1h),7.97(s,1h),7.59(s,1h),7.14(d,j＝5.3hz,1h),4.31(d,j＝5.4hz,2h),3.87(s,3h),2.47(s,3h).
相似方法制备的化合物如下:
tdm-180739白色固体化合物139即3-甲基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-n-(2,2,2-三氟乙基)-1h-吡唑-4-甲酰胺(82.7mg,产率:80.5％)。
实施例二十、合成化合物tdm-180741的一般方法
步骤1：example141b
1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯
将化合物b0(326mg，1.56mmol)，化合物141a(240mg，1.72mmol)和cs2co3(1.27g，3.9mmol)在dmf(12ml)中的混合物，110℃条件下反应2小时。将反应液倒入h2o(20ml)中，析出的固体，过滤收集。固体用乙酸乙酯/石油醚(1：2)打浆，过滤，在真空下干燥。得到浅黄色固体化合物141b(400mg，产率：82％)。lcms[m+1]+＝314.0.
步骤2：example141c
1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-羧酸
向化合物141b(400mg，1.28mmol)的meoh(8ml)混合物中加入lioh(8ml，饱和)溶液，反应液在30℃下搅拌4小时。减压浓缩混合物，用hcl(2n)中和至ph至约5，析出沉淀，过滤收集，固体中加入乙醇，浓缩旋干。得到浅绿色固体化合物141c(300mg，产率82％)。
lcms[m+1]+＝286
步骤3：example141(tdm-180741)
n-(2-氰乙基)-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-甲酰胺
向化合物141c(150mg，0.52mmol)的dipea(335mg，2.6mmol)和dmf(10ml)中加入hatu(297mg，0.78mmol)和化合物141d(110mg，1.56mmol)。所得混合物在室温下搅拌6小时，减压浓缩混合物以除去dmf，然后加入h2o(15ml)，用h2o洗涤固体，然后用乙酸乙酯/石油醚(约5：1)打浆，过滤收集固体，干燥。得到灰白色固体化合物141(136.4mg；产率78％)。
lcms[m+1]+＝338.
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.78(brs,1h),9.06(s,1h),8.88-8.98(m,1h),8.55(d,j＝5.2hz,1h),8.24(s,1h),7.92(s,1h),7.59(brs,1h),7.19(d,j＝5.2hz,1h),3.85(s,3h),3.45-3.55(m,2h),2.75-2.83(m,2h).
相似方法制备的化合物如下:
tdm-180742灰白色固体化合物142即1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-n-(3,3,3-三氟丙基)-1h-吡唑-4-甲酰胺(128.4mg；收率64％)。
实施例二十一、合成化合物tdm-180743的一般方法
步骤1：example143b
n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(4-硝基-1h-吡唑-1-基)嘧啶-2-胺
将化合物b0(326mg，1.56mmol)，化合物143a(264mg，2.34mmol)和cs2co3(1.27g，3.9mmol)在dmf(12ml)中的混合物加热至110℃，反应5小时。将混合物倒入h2o(20ml)中，过滤收集沉淀出的固体。获得的固体用乙酸乙酯/石油醚(1：2)打浆，过滤，干燥。得到黄色固体化合物143b(240mg，产率54％)。
lcms[m+1]+＝287.
步骤2：example143c
4-(4-氨基-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺
向化合物143b(220mg，0.77mmol)的meoh(30ml)溶液中加入pd/c(100mg，10％w.t.)。将所得混合物加热至35℃反应3小时。将混合物用dcm(50ml)稀释，通过硅藻土垫过滤，用dcm/meoh洗涤，滤液和洗涤液浓缩并在真空下干燥。得到浅黄色固体化合物143c(170mg，产率86％)。
lcms[m+1]+＝257.1.
步骤3：example143(tdm-180743)
3-氰基-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丙酰胺
向化合物143c(80mg，0.31mmol)的dipea(120mg，0.93mmol)和dmf(10ml)溶液中加入hatu(171mg，0.45mmol)和化合物143d(62mg，0.62mmol)。反应液在室温下搅拌6小时。反应完成后，将混合物倒入h2o中，用etoac(30ml×3)萃取，将合并的有机层用h2o和盐水洗涤na2so4干燥，过滤，浓缩，柱层析(dcm/meoh＝10/1)纯化得到将粗产物。粗产物用乙酸乙酯/石油醚(4：1)打浆，得到白色固体化合物143(35.5mg；产率44％)。
lcms[m+1]+＝338.
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.5(s,1h),9.71(s,1h),8.85(brs,1h),8.47(d,j＝5.2hz,1h),7.88(s,2h),7.55(brs,1h),7.13(d,j＝5.2hz,1h),3.83(s,3h),2.65-2.82(m,4h).相似方法制备的化合物如下:
tdm-180744白色固体化合物144即4,4,4-三氟-n-(1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丁酰胺(22.2mg；产率22％)。
实施例二十二、合成化合物tdm-180746的一般方法
步骤1:example146c
在室温下，向化合物146a(500mg，2.4mmol)即4-氯-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺的n,n-二甲基甲酰胺(25ml)溶液中加入化合物146b(304mg，2.4mmol)即5-甲基-4-硝基-1h-吡唑和碳酸铯(1.95g，6mmol)。然后将混合物加热至115℃并搅拌4小时。反应结束后向混合物中加入水，过滤收集沉淀物，向沉淀中加入石油醚和乙酸乙酯，收集沉淀，得到黄色固体化合物146c(250mg，产率34.7％)，即n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(3-甲基-4-硝基-1h-吡唑-1-基)嘧啶-2-胺。lcms[m+1]+＝301.
步骤2:example146d
在室温下，向化合物146c(250mg，0.83mmol)的甲醇(30ml)溶液中加入适量的pd/c，然后将混合物在真空下脱气，在氢气氛围下加热至35℃并搅拌3小时。过滤混合物，减压浓缩滤液，得到灰色固体化合物146d(140mg，产率62.5％)即4-(4-氨基-3-甲基-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺。lcms[m+1]+＝271.
步骤3:example146f(tdm-180746)
在室温下向化合物146d(40mg，0.15mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中加入n，n-二异丙基乙胺(57.4mg，0.444mmol)，将混合物搅拌5分钟，然后向混合物中加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(84mg，0.222mmol)和化合物146e(18.8mg，0.222mmol)即氰乙酸，并在室温下搅拌16小时。减压浓缩混合物以除去n,n-二甲基甲酰胺，向残余物中加入水并用乙酸乙酯(60ml×3)萃取。将有机层用饱和盐水(30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，并将滤液减压浓缩，将其通过硅胶柱(乙酸乙酯：甲醇＝20：1)纯化，得到白色固体化合物146，tdm-180746(19.7mg，产率39.5％)，即2-氰基-n-(3-甲基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)乙酰胺。lcms[m+1]+＝338
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.17(s,1h),9.65(s,1h),8.87(s,1h),8.43(d,j＝5.4hz,1h),7.86(s,1h),7.53(s,1h),7.06(d,j＝5.4hz,1h),3.97(s,2h),3.83(s,3h),2.32(d,j＝10.0hz,3h).
相似方法制备的化合物如下:
tdm-180747白色固体化合物147即3,3,3-三氟-n-(3-甲基-1-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丙酰胺(29.9mg,产率:26.6％)。
实施例二十三、合成化合物tdm-180704的一般方法
步骤1：example104b
将所述化合物104a(30mg,0.117mmol),碘甲烷(20mg,0.141mmol),氢氧化钾(19.7mg，0.351mmol)和四氢呋喃(5ml)加入到单口瓶中。在66℃下搅拌反应4小时后，将反应液过滤，滤液浓缩，得到类白色固体化合物104b即n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(4-(甲基氨基)-1h-吡唑-1-基)嘧啶-2-胺(30.5mg，粗品)。lcms[m+1]+＝271.1
步骤2:example104(tdm-180704)
将所述化合物104b(30mg，0.106mmol)，三乙胺(16mg，0.159mmol)，化合物104c(16.3mg，0.133mmol)，hatu即2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(63.4mg,0.167mmol)和二氯甲烷(5ml)加入到50ml单口瓶中，室温下搅拌1.5小时。然后反应液用水(10ml×2)洗涤，分离得到有机层，用mg2so4干燥，减压浓缩。通过制备硅胶板(100％乙酸乙酯)纯化，得到类白色固体化合物104即2,2-二氟-n-甲基-n-(1-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)环丙烷甲酰胺(22.5mg，收率51.4％)。lcms[m+1]+＝375.1。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.78(s,1h),8.45–8.30(m,2h),7.95(s,1h),7.82(s,1h),7.68(s,1h),7.25–7.23(m,1h),3.98(s,3h),3.58(s,3h),2.57–2.38(m,1h),2.23(td,j＝14.0,7.7hz,1h),1.81(tdd,j＝12.3,7.9,4.8hz,1h).
实施例二十四、合成化合物tdm-180698的一般方法
步骤1：example98c
将所述化合物98a(100mg,0.391mmol),化合物98b(73mg,0.469mmol),氢氧化钾(66mg，1.173mmol)和四氢呋喃(20ml)加入到单口瓶中。在66℃下搅拌反应16小时后，将反应液过滤，滤液浓缩，浓缩物通过制备硅胶板(100％乙酸乙酯)纯化得到类白色固体化合物98c即4-(4-(乙胺基)-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(90.5mg，收率81.5％)。lcms[m+1]+＝285.1
步骤2:example98(tdm-180698)
将所述化合物98c(30mg，0.106mmol)，三乙胺(16mg，0.159mmol)，化合物98d(16.2mg，0.127mmol)，edcl即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(30.5mg，0.159mmol)和二氯甲烷(10ml)加入到50ml单口瓶中，室温下搅拌16小时。然后反应液用水(10ml×2)洗涤，分离得到有机层，用mg2so4干燥，减压浓缩。通过制备硅胶板(100％乙酸乙酯)纯化，得到类白色固体化合物98即n-乙基-2,2-二氟-n-(1-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)环丙甲酰胺(9.6mg，收率23.3％)。lcms[m+1]+＝389.1。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.76(s,1h),8.40(d,j＝5.4hz,1h),7.91(s,1h),7.84(s,1h),7.73(s,1h),7.58(s,1h),7.17(d,j＝5.4hz,1h),4.05(q,j＝7.0hz,2h),3.94(s,3h),2.52–2.41(m,1h),2.23(td,j＝14.0,7.6hz,1h),1.86–1.75(m,2h),1.30(t,j＝6.1hz,4h).
相似方法制备的化合物如下:
tdm-180705类白色固体化合物105即n-乙基-3,3,3-三氟-n-(1-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)丙酰胺(17.4mg,产率:41.7％)
实施例二十五、合成化合物tdm-180713的一般方法
步骤1：example113c
将所述化合物113a(50.0mg，0.195mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，加入所述化合物113b(24.5mg，0.215mmol)和醋酸(0.2ml)，室温下搅拌15分钟。然后加入三乙酰基硼氢化钠(49.6mg，0.234mmol)，反应液在室温下搅拌18小时。反应液倒入水(20ml)中，用碳酸氢钠调ph至近中性，分离得有机层，用二氯甲烷(15ml×2)萃取水层，将合并的有机层用盐水洗涤，再用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，浓缩物通过制备tlc(甲醇/二氯甲烷＝1/20)纯化，得到白色固体化合物113c即n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)-1h-吡唑-1-基)嘧啶-2-胺(52mg，收率75.3％)。lcms[m+1]+＝355.1。
步骤2:example113(tdm-180713)
向所述化合物113c(30mg，0.085mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液中加入氢氧化钾(14.5mg，0.255mmol)和碘甲烷(14.5mg，0.102mmol)，反应液在66℃下搅拌4小时。反应结束后反应液在减压下浓缩，浓缩物通过制备tlc(100％etoac)纯化，得到类白色固体化合物113即4-(4-(甲基((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(20.3mg，64.8％)。lcms[m+1]+＝369.2。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.37(d,j＝5.5hz,1h),7.83(s,1h),7.75(s,1h),7.67(s,1h),7.43(s,1h),7.14(d,j＝5.5hz,1h),4.01(dd,j＝11.1,3.7hz,2h),3.93(s,3h),3.57(s,3h),3.41(td,j＝11.9,1.8hz,2h),2.97(d,j＝6.7hz,2h),1.85(s,1h),1.72(d,j＝12.9hz,2h),1.39(ddd,j＝25.0,12.2,4.5hz,4h),0.88(t,j＝6.7hz,2h).
实施例二十六、合成化合物tdm-180717的一般方法
步骤1：example117c
将所述化合物117a(50.0mg，0.195mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，加入所述化合物117b(21.5mg，0.215mmol)和醋酸(0.2ml)，室温下搅拌15分钟。然后加入三乙酰基硼氢化钠(49.6mg，0.234mmol)。反应液在室温下再搅拌3小时。反应液倒入水(20ml)中，用碳酸氢钠调ph至近中性，分离得有机层，用二氯甲烷(15ml×2)萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，再用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到白色固体化合物117c即n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(4-(((3-甲基吡啶-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑-1-基)嘧啶-2-胺(61mg，收率91.9％，粗品)。lcms[m+1]+＝341.2。
步骤2:example117(tdm-180717)
向所述化合物117c(53mg，0.156mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液中加入氢氧化钾(26.2mg，0.468mmol)和碘甲烷(26.5mg，0.187mmol)，反应液在66℃下搅拌4小时。反应结束后反应液在减压下浓缩，浓缩物通过制备tlc(100％乙酸乙酯)和制备hplc纯化，得到类白色固体化合物117即4-(4-(甲基((3-甲基吡啶-3-基)甲基)氨基)-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-基胺(8.2mg，14.8％)。lcms[m+1]+＝355.2。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.38(d,j＝5.5hz,1h),7.88(s,1h),7.75(s,1h),7.67(s,1h),7.49(d,j＝13.7hz,1h),7.15(d,j＝5.5hz,1h),5.32(d,j＝14.8hz,1h),4.55(d,j＝5.9hz,2h),4.46(d,j＝6.0hz,2h),3.94(s,3h),3.58(s,3h),3.26(s,2h),1.40(s,4h).
实施例二十七、合成化合物tdm-180718的一般方法
步骤1：example118c
将所述化合物118a(50.0mg，0.195mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，加入所述化合物118b(21.5mg，0.215mmol)和醋酸(0.2ml)，室温下搅拌15分钟。然后加入三乙酰基硼氢化钠(49.6mg，0.234mmol)。反应液在室温下再搅拌4小时。反应液倒入水(20ml)中，用碳酸氢钠调ph至近中性，分离得有机层，用二氯甲烷(15ml×2)萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，再用无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到白色固体化合物118c即4-(4-(((4,4-difluorocyclohexyl)甲基)氨基)-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(51mg，收率67.4％，粗品)。lcms[m+1]+＝389.2。
步骤2:example118(tdm-180718)
向所述化合物118c(51mg，0.131mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液中加入氢氧化钾(22.1mg，0.394mmol)和碘甲烷(22.4mg，0.158mmol)，反应液在66℃下搅拌5小时。反应结束后反应液在减压下浓缩，浓缩物通过制备hplc纯化，得到类白色固体化合物118即4-(4-(((4,4-二氟环己基)甲基)(甲基)氨基)-1h-吡唑-1-基)-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(11.2mg，21.3％)。lcms[m+1]+＝403.2。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.37(d,j＝5.3hz,1h),7.82(s,1h),7.74(s,1h),7.68(s,1h),7.42(s,1h),7.13(d,j＝5.4hz,1h),3.93(s,3h),3.57(s,3h),2.98(d,j＝6.5hz,2h),2.13(s,2h),1.90(d,j＝13.5hz,3h),1.63(d,j＝23.3hz,3h),1.38(dd,j＝23.3,11.2hz,3h).
实施例二十八、合成化合物tdm-180699的一般方法
步骤1:example99c
将化合物99a即4-氯-n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(824mg,4.0mmol)，化合物99b即4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯(2.35g,8.0mmol),pd(dppf)cl2(292mg,0.4mol)，碳酸钠(292mg,0.4mmol)，1,4-二氧六环(42ml)和水(7ml)加入到三颈瓶中。体系水泵条件下抽气置换氮气三次。反应液在95℃条件下反应24小时后冷却。反应完成后,减压浓缩后粗产物用柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/甲醇＝1/20)，得到灰白色固体化合物99c即n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺(0.8g,，产率83％)。lcms[m+1]+＝242.1
步骤2:example99e
化合物99c(600mg,2.48mmol)，碳酸铯(3.23g,9.92mmol)和化合物99d即2,4-二溴丁酸甲酯(710mg,2.73mmol)加入到二甲基甲酰胺(15ml)中，混合物45℃下搅拌2小时。反应完成后,将其倒入水(30ml)中，乙酸乙酯(40mlx4)萃取。合并有机层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后粗产物柱层析(洗脱剂：乙酸乙酯)分离纯化得到灰白色固体化合物99e即1-(4-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基)环丙烷甲酸甲酯(420mg，产率50％)。
lcms[m+1]+＝340.1
1hnmr(400mhz,dmso-d6))δ9.36(s,1h),8.59(s,1h),8.35(d,j＝5.2hz,1h),8.15(s,1h),7.94(s,1h),7.51(s,1h),7.00(d,j＝5.2hz,1h),4.23-4.47(m,2h),3.83(s,3h),3.64(s,3h),1.72-1.81(m,4h).
步骤3:example99f
在化合物99e(400mg,1.18mmol)的甲醇(5ml)溶液中加入氢氧化锂水溶液(1m,5ml)。反应液室温下反应2小时。反应完成后，减压旋干，盐酸(2m)酸化至ph为4析出固体沉淀，过滤，滤饼干燥得绿色固体化合物99f即1-(4-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基)环丙烷羧酸(320mg，产率84％)。
lcms[m+1]+＝326.1
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.14(brs,1h),9.35(s,1h),8.56(s,1h),8.34(d,j＝5.2hz,1h),8.11(s,1h),7.94(s,1h),7.51(s,1h),7.00(d,j＝5.2hz,1h),3.83(s,3h),1.61-1.76(m,4h).
步骤4:example99(tdm-180699)
化合物74h99f(80mg,0.25mmol)和n,n'-二异丙基乙胺(57mg,0.44mmol)加入到二甲基甲酰胺(5ml)中搅拌5分钟。随后加入化合物99g即3,3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐(43mg,0.34mmol)和hatu(100mg,0.26mmol)。所得混合物在室温下搅拌4小时，将其倒入水(30ml)中，乙酸乙酯(30ml*3)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后粗产物柱层析纯化分离(乙酸乙酯/石油醚＝0-100％)，得到白色固体化合物99即(3,3-二氟吡咯烷-1-基)(1-(4-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基基)环丙基)甲酮(97.2mg，产率84％)。
lcms[m+1]+＝401.1
1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ8.39(d,j＝5.2hz,1h),8.18(s,1h),8.09(s,1h),7.81(s,1h),7.59(s,1h),6.94(s,1h),6.83(d,j＝5.2hz,1h),4.23-4.47(m,2h),3.95(s,3h),3.69-3.86(m,2h),1.94-1.99(m,2h),1.57-1.65(m,2h).
相似方法制备的化合物如下:
tdm-180700灰白色固体化合物100即(3,3-二氟吡咯烷-1-基)(1-(4-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基基)环丙基)甲酮(85mg,yield79％)
实施例二十九、合成化合物tdm-180714的一般方法
步骤1：example114b
向所述化合物114a(80.0mg，0.588mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入dmf(0.5ml)和二氯亚砜(209.8mg，1.763mmol)，将混合物在40℃下搅拌3小时。减压除去溶剂后，得无色油状液体化合物114b即3,3-二氟环丁烷碳酰氯(90.9mg,crude)。
步骤2:example114(tdm-180714)
向所述化合物114c(70.8mg，0.294mmol)的dmf(5ml)溶液中加入三乙胺(89.1mg，0.882mmol)和化合物114b(90.9mg，0.588mmol)，溶液在室温下搅拌1.5h。将反应液在减压下浓缩，通过制备型hplc纯化浓缩物得到黄色固体化合物114即(3,3-二氟环丁基)(3-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基)甲酮(6.9mg，6.5％)。lcms[m+1]+＝360.1。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.76(s,1h),8.39(d,j＝5.1hz,1h),8.22(s,1h),7.83(s,1h),7.55(s,1h),7.10(s,1h),6.87(d,j＝5.1hz,1h),4.25–4.04(m,1h),3.93(s,3h),3.01(dt,j＝14.5,8.7hz,4h).
实施例三十、合成化合物tdm-180737的一般方法
步骤1:example137c
在室温下，向化合物137a(150mg，0.62mmol)即n-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(1h-吡唑-4-基)嘧啶-2-胺的n,n-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中加入化合物137b(241mg，1.24mmol)即2-溴-2-甲基丙酸乙酯和碳酸铯(505mg，1.55mmol)。然后将混合物加热至60℃并搅拌2小时。反应结束后用乙酸乙酯(40ml×3)萃取混合物，将有机层用饱和盐水(30ml×6)洗涤，并用无水硫酸钠干燥，将滤液减压浓缩。将其通过硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝13:87)纯化，得到白色固体化合物137c(213mg，产率85％)，即2-甲基-2-(4-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基)丙酸乙酯。lcms[m+1]+＝356.
步骤2:example137d
在室温下，向化合物137c(189mg，0.53mmol)的甲醇(4ml)和四氢呋喃(4ml)的混合溶液中加入氢氧化钠(212mg)的水(8ml)溶液。然后将混合物在室温下搅拌2小时。减压浓缩混合物以除去过量的甲醇和四氢呋喃，然后用盐酸(2m)中和溶液。溶液用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，有机层用饱和盐水(30ml)洗涤，并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩滤液，得到黄色固体化合物137d(127mg，产率73.4％)，即2-甲基-2-(4-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基)丙酸。lcms[m+1]+＝328.
步骤3:example137(tdm-180737)
在室温下，向化合物137d(60mg，0.183mmol)和化合物137e(39.4mg，0.275mmol)即3,3-二氟吡咯烷的n,n-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中加入三乙胺(74mg，0.732mmol)。将混合物搅拌5分钟，然后向混合物中加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(104mg，0.275mmol)并在室温下搅拌16小时。向混合物中加入水(40ml)并用乙酸乙酯(40ml×3)萃取，将有机层用饱和盐水(30ml×6)洗涤，并用无水硫酸钠干燥，将滤液减压浓缩。将其通过硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝0：100)纯化，得到白色固体化合物137，tdm-180737(61mg，收率80％)，即1-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)-2-甲基-2-(4-(2-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-1h--吡唑-1-基)丙-1-酮。lcms[m+1]+＝417
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.29(d,j＝5.2hz,1h),8.03(d,j＝12.9hz,2h),7.75(s,1h),7.46(s,1h),6.81(s,1h),6.76(d,j＝5.2hz,1h),3.84(s,3h),3.71(s,2h),2.80(d,j＝13.3hz,2h),2.13(s,2h),1.58(s,3h),1.18(s,3h).
鉴别化合物对jak激酶活性抑制作用的实验
janus激酶(jak)包括jak1，jak2，jak3和tyk2，通过jak-stat通路转导细胞因子介导的信号。激酶的大小在120-140kda，有7个确定的同源区域，为jh1-jh7。jh1是酶活性重要的区域，含有典型酪氨酸激酶特征，酪氨酸的磷酸化导致jak蛋白构象的改变，从而促进底物的结合。jak-stat系统包含三个主要的部分：穿过细胞膜的受体，连接到受体上的janus激酶，和将信号传输到细胞核和dna中的信号传导和转录激活子(stat)。当细胞因子与受体结合时，jak将受体磷酸化，吸引stat蛋白，stat蛋白也被磷酸化后相互结合形成二聚体，二聚体进入细胞核与dna结合，导致基因转录。
perkinelmer公司的ezreader可用来检测被激酶催化多肽底物磷酸化，该设备基于微控流体分离技术，可以直接检测荧光标记的底物和产物，分离步骤在微流体芯片内通过控制压力和电场强度实现。激酶实验一般控制在产物转化率为20-30％。该生物学测试方法是用来鉴别化合物对jak激酶活性的抑制作用。
1、实验材料
s1.1受试化合物
化合物粉末用dmso溶解，密封储存于-20℃冰箱。内部化和物ref1用于jak1,jak2和tyk2测试的阳性对照，ref2用于jak3测试的阳性对照。
2.试剂
s2.1、1mhepes缓冲液
s2.2、40mmatp溶液
s2.3、0.5％吐温20
s2.4、35％牛血清蛋白
s2.5、1m二硫苏糖醇溶液
s2.6、0.5mmjaktidepeptide底物溶液
s2.7、0.5mmirstidepeptide底物溶液
s2.8、实验缓冲液assaybuffer：20mmhepes缓冲液,ph7.4，10mm氯化镁，0.01％牛血清蛋白bsa，0.0005％吐温-20，1mm二硫苏糖醇溶液。
s2.9、反应终止液stopbuffer：180mmhepes缓冲液，20mm乙二胺四乙酸，0.2％coatingreagent3.s2.10、分离液separationbuffer：100mmhepes缓冲液，10mm乙二胺四乙酸，0.0005％吐温20，0.1％coatingreagent3,1％二甲基亚砜。
3.实验方法
s3.1、化合物板的配制
将化合物用二甲基亚砜溶解到10mm，取一定体积稀释到0.6mm，取0.6mm稀释液10μl加到384微孔板，然后3倍梯度稀释，共8个浓度点。
s3.2、化合物排列
阳性对照(hpe1)：ref1，终浓度：10μm
阳性对照(hpe1)：ref2，终浓度：10μm
阴性对照(zpe)：dmso，终浓度为1.6％
化合物：最高终浓度为10μm，3倍稀释，8个浓度点，2个重复。
4.实验操作步骤
s4.1.用echo每孔加250nl化合物至实验板，1000转离心1分钟；
s4.2.加入5μl实验缓冲液，震荡几秒使化合物充分溶解；
s4.3.加入5μl3×的底物溶液，加入5μl3×激酶溶液，800转离心1分钟；
s4.4.jak1,jak2,jak3和tyk2激酶在反应体系中的终浓度分别为20，1，1，和1nm.
s4.5.室温孵育，每个激酶需要不同时间，不同批次的激酶有时间上的差异
s4.6.反应到20％-30％，加入15μl终止液终止，1000转离心2分钟。
s4.7.放置到ezreader上读板。
s4.8.ezreader读数由峰高度计算，％产物转换率＝产物/(产物+底物)*100
5.数据处理：ic50计算
利用作图软件xlfit制作受试化合物浓度曲线，计算ic50值。
利用该实验方法获得了上述各实施例中所示的化合物的ic50值列于下表中：
下表列出了上述各实施例中所示的化合物的ic50值。“a”表示≥10μm；“b”表示≥1μm同时<10μm；“c”表示≥0.1μm同时<1μm；“d”表示<0.1μm。