一种包含C反应蛋白抗原结合结构域的结合蛋白的制作方法
本发明涉及免疫技术领域，具体而言，涉及一种包含c反应蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白。
背景技术：
c反应蛋白(c-reactiveprotein，crp)一种急性时相反应蛋白(acutephaseprotein)，1930年美国洛克菲勒研究院avery实验室的tillett和fransic发现急性感染患者的血清能和肺炎双球菌细胞壁上的c多糖发生沉淀反应，后证实参与反应的是一种蛋白质，故称之为c反应蛋白。crp属于穿透素家族成员之一，相对分子质量为115kd-140kd，它由5个相同的亚单位以非共价键形式结合，形成对称的环状五球体，中间环绕一孔型结构，其凹面含有配体结合位点，每个亚单位有206个氨基酸残。在炎症、感染、组织损伤时，crp在细胞因子(如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子)等的刺激下，主要由肝脏合成后分泌至人的血液中，在血液中的半衰期大概为19h。外周血淋巴细胞也能合成少量的crp。
crp具有多种生物学功能，参与多种自身生理及病理生理过程。crp与磷脂胆碱残基具有高度亲和力，并且可以和多种自身配体(如浆细胞脂蛋白、损伤细胞的细胞膜、小核糖体蛋白颗粒、调理素细胞等)或外来配体(如多聚糖、磷脂以及细菌、真菌、寄生虫等微生物的组分)相结合。crp与这些配体结合后，仅能激活补体活化经典途径的初级阶段，限制补体激活晚期炎症反应的发展及强度。此外，crp还能增加淋巴细胞活性，增强巨噬细胞对各种细菌和异物的吞噬能力，抑制血小板凝集及抗炎等作用。
随着检测技术的进步，急性时相反应蛋白特别是crp与急性感染、组织血管损伤等之间的关系越来越受到重视，许多研究结果发现它是急性时相反应蛋白中最重要的蛋白之一，也是人体感染的一个重要的标志物，其体内含量的变化情况与下述感染性疾病、心血管疾病、自身免疫病、恶性肿瘤和抑郁症等疾病的发生、发展均存在较强的相关性。
1)血清crp水平是指示细菌感染的一项敏感而客观的指标。通常情况下，机体crp浓度较低，新生儿血清crp<2mg/l，儿童和正常成年人血清中crp≤10mg/l。在感染性疾病疾病中，crp浓度可在6-8h内迅速上升，24-48h达到高峰。高峰值可达正常值的数百倍。而在感染消除后又急剧下降，一周内即可恢复正常。
crp水平还与感染范围和感染严重程度有一定关系。各种细菌感染均可引起crp水平的升高，10-99mg/l提示局灶性或浅表性感染，≥100mg/l提示败血症或侵袭性感染等严重情况。因此，血清crp水平可以用来预测感染性疾病的严重程度、住院时间的长短、预后及复发。
2)crp可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断。细菌感染时crp水平显著上升，而病毒感染时crp水平多正常或轻度升高，因此crp还可以帮助细菌感染与非细菌感染的鉴别诊断。
3)crp与自身免疫性疾病的早期诊断和预后相关。crp在大多数结缔组织病的活动期均可升高。结缔组织病多为自身免疫病，包括系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等，虽然病因、病理及表现形式和治疗方式各不相同，但自身免疫性炎症在疾病的发生和发展过程中发挥重要作用。crp是类风湿性关节炎早期关节破坏及预后的重要预测指标之一。
4)crp可以反映动脉粥样硬化斑块的成分并预测斑块破裂的可能性，是心血管疾病的独立预测因子。冠心病、急性冠脉综合症患者的crp水平明显升高，其升高水平与冠状动脉硬化阻塞程度、冠心病终末事件的发生及预后、充血性心力衰竭的程度均有显著相关性。
5)crp与肿瘤的鉴别诊断、评估相关。恶性肿瘤患者的crp水平大都增高，crp与afp的联合检测可用于肝癌和肝脏良性疾病的鉴别诊断。crp对于肿瘤的治疗和手术效果的评估具有重要意义，有助于临床评估肿瘤的进程。
6)crp的升高与代谢综合征密切相关。近年来，糖尿病也被认为是一种由细胞因子介导的慢性低度炎症性疾病，crp等许多炎症因子在ⅱ型糖尿病患者中显著升高，血清中的crp水平与人群中ⅱ型糖尿病的发病率增加密切相关，crp基因的多态性也与糖尿病的的发病相关。
鉴于crp在众多领域中的重要作用，crp的检测对于上述疾病的诊断、预后、评估等具有重要的临床意义。目前存在较多crp的测定方法，例如免疫沉淀法、免疫比浊法、标记免疫法等，其中以免疫比浊法最常用。上述常见免疫测定方法都需要用到crp的单克隆抗体。
长期以来，杂交瘤技术生产的鼠单克隆抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗。但由于杂交瘤方式生产采用小鼠腹腔诱生，受小鼠个体影响特别大，生产不稳定、批间差大，小鼠自身抗体纯化难度大，且现有的抗crp抗体由于活性低、亲和力差，无法很好地应用于crp的检测中，因此本领域对于能够特异性结合crp、且活性和亲和力较好的检测抗体存在强烈需求。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明提供一种活性好、亲和力高的包含c反应蛋白(crp)抗原结合结构域的分离的结合蛋白，及其制备方法和应用。
本发明提供包含c反应蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括下述氨基酸序列的至少一个互补决定区；或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同源性；
互补决定区cdr-vh1为g-x1-t-f-t-x2-y-x3-m-n，其中，
x1是y或w，x2是q或n，x3是i、v或l；
互补决定区cdr-vh2为w-x1-n-t-x2-t-g-e-p-t-y-a-x3-x4-f-k，其中，
x1是l、v或i，x2是d、n、e或q，x3是e或d，x4是d或e；
互补决定区cdr-vh3为a-l-s-x1-s-r-l-x2-w-y-x3-d-v，其中，
x1是i或l，x2是n、h或q，x3是y或f；
互补决定区cdr-vl1为r-a-s-x1-s-v-x2-a-s-x3-y-g-x4-m-h，其中，
x1是q或n，x2是s或t，x3是f、w或y；
互补决定区cdr-vl2为y-x1-s-x2-l-e-s，其中，
x1是i、a或l，x2是n或q；
互补决定区cdr-vl3为q-x1-s-w-e-x2-p-x3-t，其中，
x1是h或n，x2是i、v或l，x3是c或s。
进一步的，本发明提供的包含c反应蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中：
所述互补决定区cdr-vh1中，x1是y；
所述互补决定区cdr-vh2中，x4是d；
所述互补决定区cdr-vh3中，x1是l；
所述互补决定区cdr-vl1中，x3是g；
所述互补决定区cdr-vl2中，x2是n；
所述互补决定区cdr-vl3中，x1是h；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x2独立地选自q；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x2独立地选自n；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x3独立地选自i；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x3独立地选自v；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x3独立地选自l；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x1独立地选自l；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x1独立地选自v；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x1独立地选自i；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x2独立地选自d；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x2独立地选自n；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x2独立地选自e；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x2独立地选自q；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x3独立地选自e；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x3独立地选自d；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x2独立地选自n；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x2独立地选自h；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x2独立地选自q；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x3独立地选自y；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x3独立地选自f；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x1独立地选自q；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x1独立地选自n；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x2独立地选自s；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x2独立地选自t；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x4独立地选自f；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x4独立地选自w；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x4独立地选自y；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x1独立地选自i；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x1独立地选自a；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x1独立地选自l；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x2独立地选自i；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x2独立地选自v；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x2独立地选自l；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x3独立地选自c；
在一些实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x3独立地选自s。
在一些实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：
在一些实施方式中，所述结合蛋白与与crp具有kd≤9.66e-09mol/l的亲和力。
在一些实施方式中，所述结合蛋白中包含至少3个cdrs(可选择的，重链的3个cdrs，或者轻链的3个cdrs)。
在一些实施方式中，所述结合蛋白包含至少6个cdrs。
在一些实施方式中，所述结合蛋白为抗体为纳米抗体、f(ab’)2、fab’、fab、fv、scfv(sc＝单链)、双特异抗体(diabodies)或抗体最小识别单位中的一种。
在一些实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如seqidno:1-4所示的轻链骨架区fr-l1、fr-l2、fr-l3及fr-l4，和/或，序列依次如seqidno:5-8所示的重链骨架区fr-h1、fr-h2、fr-h3及fr-h4。
在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。
在一些实施方式中，所述恒定区序列选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd任何其中之一恒定区的序列。
在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在一些实施方式中，所述恒定区来源于鼠。
在一些实施方式中，轻链恒定区序列如seqidno:9所示，重链恒定区序列如seqidno:10所示。
在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。
另一方面，本发明还涉及分离的核酸分子，所述核酸分子为dna或rna，其编码如上所述的结合蛋白。
一方面，本发明还涉及一种载体，其包含本发明所提供的核酸分子。
另一方面，本发明还涉及一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。
在一些实施方式中，所述的宿主细胞包括细菌、真核细胞、酵母和杆状病毒系统。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞，进一步的为哺乳动物细胞。
在本领域中可用于表达的哺乳动物细胞系包括：中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、幼仑鼠肾细胞、ns0小鼠骨髓瘤细胞和许多其它细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为cho细胞。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种生产如上所述的结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
在合适的培养条件中培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如上所述的结合蛋白。
根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备用于诊断的crp水平变化相关的疾病的诊断剂或试剂盒中的应用。
在一些实施方式中，所述的crp水平变化相关的疾病为感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和抑郁症。
在一些实施方式中，所述感染性疾病包括细菌感染、真菌感染或病毒感染。
在一些实施方式中，所述自身免疫性疾病包括系统红斑狼疮、多发性硬化症、i型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎、sjogren综合征、硬皮病、多肌炎、类风湿关节炎、混合性结缔组织病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性溶血性贫血、桥本甲状腺炎、addisons病、白斑、graves病、重症肌无力、强直性脊柱炎、变应性骨关节炎、变应性血管炎、自身免疫性噬中性白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、狼疮性肾炎、慢性萎縮性胃炎、自身免疫性不育、子宫内膜异位症、pasture病、天疱疮、盘状狼疮或致密沉积物疾病。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中的crp抗原的方法，其包括：
a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的crp抗原与本发明中所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；
b)检测所述免疫复合物的存在。
在上述实施方式中，步骤b)中所述免疫复合物的存在指示所述测试样品中所述crp抗原的存在。
在上述实施方式中，所述结合蛋白可以标记显示信号强度的指示剂，以使得所述免疫复合物容易被检测。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；
在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合crp的不同抗原表位；
所述的第二抗体可以标记显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述crp抗原结合；
在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
进一步，本发明的另一方面还涉及一种检测试剂或或试剂盒，其包含如上所述的结合蛋白。
在一些实施方式中，所述试剂或试剂盒还包含缓冲剂、稳定剂、稀释剂或载体中的一种或多种。
本发明所提供的分离的结合蛋白，活性强、与crp(特别是人的crp)具有很高的亲和力，适用于crp的含量检测，特别是人crp的含量检测。同时本发明通过重组方式得到的结合蛋白个体差异小、批间差异小、质量稳定，更利于其质量控制和检测稳定性。且与市面上常见crp抗体相比，具有较好的亲和力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明实施例1中抗人crp的单克隆抗体电泳图。
具体实施方式
本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。
在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。
术语定义
“包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白”、“结合蛋白”泛指包含cdr区的一切蛋白/蛋白片段包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、双特异抗体、抗体最小识别单位、抗体，以及这些抗体和片段的单链衍生物。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段。
通过用蛋白酶(诸如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶)处理ig，可以生产“f(ab’)2”和“fab’”部分，且包括通过在二硫键附近消化免疫球蛋白所产生的抗体片段，所述二硫键存在于2个重链中的每一个内的铰链区之间。例如，木瓜蛋白酶会在存在于2个重链中的每一个内的铰链区之间的二硫键的上游切割igg，以产生2个同源的抗体片段，其中由vl和cl组成的轻链(轻链恒定区)和由vh和chγ区组成的重链片段(在重链的恒定区中)在它们的c端区域通过二硫键相连。这2个同源的抗体片段中的每一个被称作fab’。蛋白酶也会在存在于2个重链中的每一个内的铰链区之间的二硫键的上游切割igg，以产生这样的抗体片段：所述片段稍微大于2个上述的fab’在其中在铰链区处相连的片段。该抗体片段被称作f(ab’)2。
fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(ch1)。fab’片段与fab片段的差别在于，在重链ch1结构域的羧基端处添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’-sh在本文中表示这样的fab’：其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离的巯基。f(ab’)2抗体片段最初被生产为fab’片段对，它们具有在它们之间的铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
“fv”表示含有完整抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。该区域由紧密地非共价或共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成(本领域已经描述了二硫键连接的fv，reiter等人(1996)naturebiotechnology14:1239-1245)。在该构型中，每个可变结构域的3个cdr相互作用，以限定在vh-vl二聚体的表面上的抗原结合位点。来自每个vh和vl链的一个或多个cdr的组合一起赋予抗体抗原结合特异性。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“vh”。轻链的可变结构域可以被称为“vl”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(vl或vh)由被三个称为“互补决定区”或“cdr”的高变区打断的构架区构成。构架区和cdr的范围已被精确定义，例如在kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)，e.kabat等，美国卫生与人类服务部(u.s.departmentofhealthandhumanservices)，(1983))和chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐cdr的作用，所述cdr主要负责与抗原的结合。
尽管fv片段的2个结构域(vl和vh)由单独的基因编码，使用重组方法，通过合成的连接物可以连接它们，所述连接物使它们能够制成单个蛋白链，其中vl和vh区配对形成单价分子(称作单链fv(scfv)，“单链fv”或“sfv”抗体片段包含抗体的vh和vl结构域，在有些实施方案中，所述fv多肽另外包含在vh和vl结构域之间的多肽连接物，其使sfv能够形成抗原结合所希望的结构。
可变结构域的更高度保守的部分被称作“骨架”、“构架”或“fr”。未修饰的重链和轻链的可变结构域各自含有4个fr(fr1、fr2、fr3和fr4)，它们主要采取β-折叠构型，其间散布着3个cdr，所述cdr形成环，并在某些情况下连接β-折叠结构部分。每个链中的cdr被fr保持紧密靠在一起，并与来自其它链的cdr一起，促进抗体的抗原结合位点的形成。
当在本文中使用时，“骨架区”、“构架”或“fr”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为cdr的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被cdr分隔开的毗邻区域(fr1、fr2、fr3和fr4)。
通常情况下，重链和轻链的可变区vl/vh可由以下编号的cdr与fr按如下组合排列连接获得：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
抗体的类型可以选择igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
当在本文中使用时，与蛋白、多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指蛋白、多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。
本发明中使用的术语“亲和力”表示2种试剂的可逆结合的平衡常数，并表示为kd。结合蛋白对配体的亲和力(诸如抗体对表位的亲和力)可以是，例如，约100纳摩尔(nm)至约0.1nm、约100nm至约1皮摩尔(pm)或约100nm至约1飞摩尔(fm)。本文使用的术语“亲合力”表示，2种或更多种试剂的复合物在稀释以后对解离的抵抗力。通过诸如酶联免疫吸附测定(elisa)或本领域技术人员熟悉的任意其它技术等方法，可以测定表观亲和力。
本发明中使用的术语“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性和同一性中的每一个可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列为了比较目的而进行比对。当所比较的序列中的等同位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在此位置是相同的；当等同位置被相同或相似氨基酸残基(例如在空间和/或电子性质方面相似的)占据时，则所述分子可称作在此位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性的百分比表示是指，在所比较的序列共有的位置处的相同或相似的氨基酸的数目的函数。在比较两个序列中，残基(氨基酸或核酸)的缺失或额外残基的存在，也会降低同一性和同源性/相似性。
本发明的示例性实施方案
在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％，85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性。
在一些实施方式中，本申请所述结合蛋白与crp具有kd值≤9.66e-09mol/l的亲和力，kd值也可以选择1.11×10e-10mol/l、2×10-10mol/l、3×10e-10mol/l、4×10e-10mol/l、5×10e-10mol/l、6×10e-10mol/l、7×10e-10mol/l、8×10e-10mol/l、9×10e-10mol/l、1×10e-9mol/l、2×10e-9mol/l、3×10e-9mol/l、4×10e-9mol/l、5×10e-9mol/l、6×10e-9mol/l、7×10e-9mol/l、8×10e-9mol/l、9.66×10e-9mol/l；或者1.11e-10mol/l≤kd≤9.66e-09mol/l；
在一些实施方式中，本申请所述结合蛋白中可以包含3个cdrs、4个cdrs、5个cdrs、6个cdrs，可选的，所述cdrs可以是选自重链cdr区域和/或轻链cdr区域的任意组合。
在一些实施方式中，所述结合蛋白为抗体的“功能片段”，例如纳米抗体、f(ab’)2、fab’、fab、fv、scfv(sc＝单链)、双特异抗体(diabodies)和抗体最小识别单位中的一种。
这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容和本领域的相关技术手段可以推测，本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。
抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如appliedbiosystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。
在一些实施方案中，所述的骨架区序列为人源的骨架序列，以构成人源化抗体。
在另一些实施方案中，已知的人源骨架序列还可以通过本领域已知的方法进行修饰，以变更的一个或多个有关框架氨基酸位置的选择，取决于多种标准。选择用以改变的有关框架氨基酸的一种标准可以是，在供体分子与受体分子之间在氨基酸框架残基中的相对差异。使用该方案来选择用以变更的有关框架位置，具有避免在残基确定中的任何主观偏差或在残基对cdr结合亲和力的贡献中的任何偏差的优势。
在一些实施方式中，本申请的恒定区序列包括重链恒定区，诸如igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd的μ链、δ链、γ链、α链或ε链恒定区。还可以可以包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。
可选的，在另一个实施方案中，在保持所述结合蛋白活性或亲和力的前提下，对恒定区序列可以进行至少一个氨基酸残基的取代。
在一些实施方式中，本申请所述的核酸序列可操作地连接至适当表达载体中的表达控制序列上，并采用该表达载体来转化适当的单细胞宿主。
其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，包含但不限于启动子、增强子和其它的表达调控元件。
在一些实施方式中，本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸dna。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。
多种表达载体组合可以用于表达本发明的核酸序列。有用的表达载体可以是适当的质粒、病毒载体、噬菌体等。合适的载体包括但不限于：sv40和已知的细菌质粒的衍生物，例如，大肠杆菌质粒coli.el、pcr1、pbr322、pmb9和它们的衍生物，质粒诸如rp4；噬菌体dna，例如，噬菌体λ的众多衍生物，例如，nm989和其它噬菌体dna，例如，m13和丝状单链噬菌体dna；酵母质粒诸如2u质粒或其衍生物；可用于真核细胞中的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；源自质粒和噬菌体dna的组合的载体，诸如已经被修饰成采用噬菌体dna或其它表达控制序列的质粒等。
在另一些实施方式中，本发明还包括将包含核酸的载体导入宿主细胞的步骤，所述导入可以采用任何可利用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括，例如，磷酸钙转染、deae葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒(例如，牛痘，或者对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括，例如，氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。本发明中优选的宿主细胞来自哺乳动物的细胞，例如cho细胞。所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。
在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
许多已知的核酸操作技术和方法，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将dna导入细胞中和基因表达以及蛋白的分析，详细描述在：shortprotocolsinmolecularbiology,第2版,ausubel等人编,johnwiley&sons,1992。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种抗c反应蛋白抗体的示例性制备方法。
s1.构建表达质粒：
本实施例中限制性内切酶、primestardna聚合酶购自takara公司；
magextractor-rna提取试剂盒购自toyobo公司；
bdsmarttmracecdnaamplificationkit试剂盒购自takara公司；
pmd-18t载体购自takara公司；
质粒提取试剂盒购自天根公司；
引物合成和基因测序由invitrogen公司完成；
分泌anti-crp7c2单克隆抗体为已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。
s11引物的设计与合成：
扩增重链和轻链的5’race上游引物：
smarteriiaoligonucleotide：
5’>aagcagtggtatcaacgcagagtacxxxxx<3’；
5'-racecdsprimer(5'-cds)：5’>(t)25vn<3’(n＝a,c,g,ort；v＝a,g,orc)；
universalprimeramix(upm)：
5’>ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt<3’；
nesteduniversalprimera(nup)：
5’>aagcagtggtatcaacgcagagt<3’；
miggckr：5’>ctaacactcattcctgttgaagctcttgacaat<3’；
mhr：5’>tcatttaccaggagagtgggagaggc<3’。
s12抗体可变区基因克隆及测序：
从分泌anti-crp7c2单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中rna，用smartertmracecdnaamplificationkit试剂盒及试剂盒中的smarteriiaoligonucleotide和5'-cds引物进行第一链cdna合成，获得的第一链cdna产物作为pcr扩增模板。lightchain基因以universalprimeramix(upm)、nesteduniversalprimera(nup)和miggckr引物进行扩增，heavychain基因以universalprimeramix(upm)、nesteduniversalprimera(nup)和miggchr引物进行扩增。其中lightchain的引物对扩增出0.75kb左右的目的条带，heavychain的引物对扩增出1.4kb左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rtaqdna聚合酶进行加a反应后插入到pmd-18t载体中，转化到dh5α感受态细胞中，长出菌落后分别取heavychain及lightchain基因克隆4个克隆送invitrogen公司进行测序。
s13anti-crp7c2抗体可变区基因的序列分析：
将上述测序得到的基因序列放在imgt抗体数据库中进行分析，并利用vnti11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中lightchain扩增出的基因片段中，vl基因序列为336bp，属于vkii基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；heavychain引物对扩增出的基因片段中，vh基因序列为357bp，属于vh1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
s14重组抗体表达质粒的构建：
pcdnatm3.4
crp-7c2-hf：
5’>cccaagcttgccaccatggaatggagctgggtctttc<3’
crp-7c2-hr：
5’>cccgaattctcattatttaccaggagagtgggagaggctcttctc<3’
crp-7c2-lf：
5’>cccaagcttgccaccatggattcacaggcccaggttctta<3
crp-7c2-lr：
5’>cccgaattctcattaacactcattcctgttgaagctcttgacaa<3。
通过pcr扩增方法扩出0.74kb的lightchain基因片段和1.42kb的heavychain基因片段。heavychain和lightchain基因片段分别采用hindiii/ecori双酶切，3.4a载体采用hindiii/ecori双酶切，将片段和载体纯化回收后heavychain基因和lightchain基因分别连接3.4a表达载体中，分别得到heavychain和lightchain的重组表达质粒。
s2.稳定细胞株筛选
s21重组抗体表达质粒瞬时转染cho细胞，确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
包被液稀释羊抗鼠igg1ug/ml进行微孔板包被，每孔100ul，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(1％酪蛋白)，每孔120ul，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100ul/孔，37℃，30min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120ul，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入1ug/ml的crp抗原(bbi)，每孔100ul，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记hrp羊抗crp多克隆抗体(1:5k)，每孔100ul，37℃，30min；加入显色液a液(50ul/孔)，加入显色液b液(50ul/孔)，10min；加入终止液，50ul/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应od仍大于1.0，未加细胞上清孔反应od小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对crp抗原都有活性。
s22重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂：buffer50ul、dna100ug/管、puvⅰ酶10ul、无菌水补至500ul，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3m醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。s23重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/lmsx96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转tpp保种传代。
s3.重组抗体生产
s31细胞扩培
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
s32摇瓶生产及纯化
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，hyclonetmcellboosttmfeed7a每天流加初始培养体积的3％，feed7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/l。第13天收样。用proteina亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性sds-page，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如图1所示。在还原性sds-page后显示两条带，1条mr为50kd(重链)，另一条mr为28kd(轻链)。
实施例2
抗体亲和力分析及活性鉴定
实施例1中得到的抗体经分析具有序列如seqidno:11所示的轻链以及12所示的重链。
经分析，重链的互补决定区(wt)：
cdr-vh1为g-w(x1)-t-f-t-q(x2)-y-v(x3)-m-n；
cdr-vh2为w-i(x1)-n-t-d(x2)-t-g-e-p-t-y-a-e(x3)-e(x4)-f-k；
cdr-vh3为a-l-s-i(x1)-s-r-l-n(x2)-w-y-f(x3)-d-v；
轻链的互补决定区：
cdr-vl1为r-a-s-n(x1)-s-v-s(x2)-a-s-p(x3)-y-g-w(x4)-m-h；
cdr-vl2为y-a(x1)-s-q(x2)-l-e-s；
cdr-vl3为q-n(x1)-s-w-e-l(x2)-p-c(x3)-t；
其中，x1、x2、x3均为待突变位点。
表1与抗体活性有关的突变位点
基于上述分析得到的wt的cdr序列，对表1中的相应位点进行上述突变，并对突变后的各抗体进行活性测定。
包被液稀释羊抗鼠igg1ug/ml进行微孔板包被，每孔100ul，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(1％酪蛋白)，每孔120ul，37℃，1h，拍干；加入稀释后的crp单克隆抗体，100ul/孔，37℃，30min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120ul，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入1ug/ml的crp抗原(bbi)，每孔100ul，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记hrp的羊抗crp多克隆抗体(1:5k)，每孔100ul，37℃，30min；加入显色液a液(50ul/孔)，加入显色液b液(50ul/孔)，10min；加入终止液，50ul/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。
表2抗体活性分析数据
从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列进行进一步突变和筛选，以获得效价较好的突变序列，部分突变后的位点如表3所示，其相应结合蛋白的亲和力分析结果如表4所示。
表3与抗体亲和力有关的突变位点
亲和力分析
以活性鉴定相同方式酶免间接法做数据，包被做四个梯度2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml；抗体从1000ng/ml开始2倍梯度稀释至0.977ng/ml上样。得出不用包被浓度下不同抗体浓度对应的od值。在同一包被浓度下，以抗体浓度为横坐标，od值为纵坐标，对数作图，根据拟合方程计算出50％最大od值时的抗体浓度；带入公式：k＝(n-1)/(2*(n*ab`-ab))计算出亲和力常数的倒数，其中ab和ab`分别表示对应包被浓度(ag、ag`)下50％最大od值时的抗体浓度，n＝ag/ag`；每两个包被浓度可以组合计算出一个k值，最后可得三个k值，取其平均数值，再求其倒数则为亲和力常数kd。
表4亲和力分析数据
从表4可以看出，表3中列出的突变位点对应的突变序列都具有较好的亲和力。
为验证上述结果，以wt作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。
表5以wt为骨架进行的突变
表6亲和力分析数据
从表5和表6分析，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点对应的突变序列都具有一定的亲和力。
申请人将表4中上述抗体与内部另一株抗体(与原wt序列的抗体配对的抗体)做配对抗体实验验证，抗体性质与wt抗体未发生明显改变，经双抗夹心法配对实验验证，特异性均维持原有高水平，未见明显改变，这说明上述抗体与突变前的wt抗体识别的为相同表位。但由于突变抗体活性和亲和力的升高而表现出了更高的灵敏度。
稳定性分析
将基于突变1的同批次抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测以分析抗体的稳定性，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降越势，说明自产抗体稳定。
进一步地将wt，以及随机抽取的5个突变抗体(wt1-1、wt1-2、wt1-8、wt1-9、突变1-12)进行稳定性检测；将上述抗体在37℃保存72小时，取出后与同批次的4℃保存72小时的抗体在同一检测条件下检测相同的阴、阳性质控样本，检测方法如上述实施例中所采用的抗体活性分析方法，各组抗体的线性均可达99.90％以上，且cv值低于10％，不同温度保存的抗体活性未见统计学差异。这说明上述抗体均具有优秀的稳定性，且位点的突变对稳定性无影响。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
sequencelisting
<110>东莞市朋志生物科技有限公司
<120>一种包含c反应蛋白抗原结合结构域的结合蛋白
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