PBMC分离装置及方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种pbmc分离装置及方法。

背景技术：

随着肿瘤免疫疗法的兴起，嵌合型抗原受体基因修饰的t细胞（car-t）技术迅速发展，成为肿瘤免疫治疗的新手段之一。car-t技术是通过基因工程方法将人工构建的特异性嵌合抗原受体导入t淋巴细胞，使其能在不受主要组织相容性复合体的限制下，特异性识别并杀死表达相关抗原的肿瘤细胞。

car-t、nk、cik等免疫细胞培养之初，需要从外周血中分离出pbmc。传统的pbmc分离技术，一般依靠细胞培养技术人员手工操作完成，不但步骤繁琐，而且耗时费力。一次pbmc的分离操作通常需要1.5h~2h方能完成。分离过程中常常也会因为技术人员的经验、熟练程度、工作状态等原因使每批次的分离质量存在差异。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种分离效率较高且可靠性较高的pbmc分离装置。

本发明所采用的一种技术方案是：一种pbmc分离装置，其特征在于：它包括控制器、离心桶、用于带动离心桶转动的第一动力机构、设置在离心桶内的活塞、用于带动活塞在离心桶内竖直移动的第二动力机构、血样采集头、分离液废液容器、清洗液采集头、产品收集容器、第一三通阀、第二三通阀、第三三通阀、第一光电对射传感器、第二光电对射传感器、第三光电对射传感器、超声流量传感器以及用于探测离心桶内活塞位置的摄像头，所述血样采集头、分离液废液容器均与第一三通阀连通，清洗液采集头、产品收集容器均与第二三通阀连通，且第一三通阀、第二三通阀以及离心桶均与第三三通阀连通，所述第一光电对射传感器设置在血样采集头与第一三通阀之间，所述第二光电对射传感器设置在第二三通阀与第三三通阀之间，所述第三光电对射传感器设置在第三三通阀与超声流量传感器之间，所述超声流量传感器设置在第三光电对射传感器与离心桶之间，并且第一动力机构、第二动力机构、第一三通阀、第二三通阀、第三三通阀、第一光电对射传感器、第二光电对射传感器、第三光电对射传感器以及摄像头均与控制器信号连接。

作为优选，所述血样采集头与第一三通阀之间还设有观察滴漏。

作为优选，所述观察滴漏内还设有用于过滤血凝块的过滤机构。

作为优选，所述第一动力机构为电机，且离心桶下方设置有旋转平台，离心桶上方设置旋转头，它还包括用于冷却旋转平台与旋转头的冷却机构，所述冷却机构与控制器电连接。

采用以上结构与现有技术相比，本发明具有以下优点：通过上述装置，通过离心原理经过多次分离，可以方便的将pbmc从血样中分离出来，分析准确性较高，并且因为是通过控制器控制自动操作的，所以分离效率也较高。

设置了观察滴漏，这样可以直观的看到血样的加入速度，使得血样可以缓慢加入。

设置了过滤机构，可以防止血凝块进入到离心桶中，影响分离。设置了冷却机构，这样可以防止因为动力机构产生的热量而导致血样损坏。

本发明所采用的另一种技术方案是：根据权利要求1所述的pbmc分离装置，其特征在于：所述第一动力机构为电机，且离心桶下方设置有旋转平台，离心桶上方设置旋转头，它还包括用于冷却旋转平台与旋转头的冷却机构，所述冷却机构与控制器电连接。

本发明所采用的另一个技术方案是：一种pbmc分离方法，它包括以下步骤：

s1、将采血袋以及清洗液袋分别连接到血样采集头以及清洗液采集头上，同时将分离液注入到分离液废液容器中；

s2、离心桶以600-1000xg的离心力转动，同时将分离液废液容器内的分离液注入离心桶；

s3、待分离液全部注入离心桶后，将采血袋内的血样缓慢的注入分离室，注入速度为10ml/min至40ml/min，同时通过第三光电传感器、超声流量传感器以及摄像头进行监控测量；

s4、待血样全部注入分离室后，离心10-15min；

s5、通过离心桶中活塞的移动，同时通过第三光电传感器、超声流量传感器以及摄像头的检测，首先将血浆层挤压至采血袋中，然后将残留的部分血浆、pbmc和少量分离液挤压至产品收集容器中，最后将剩余的分离液和红细胞挤压至分离液废液容器中；

s6、向离心桶中加入清洗液，然后将清洗液通过活塞挤出清洗液至分离液废液容器中；

s7、重复步骤s6一次；

s8、将产品收集容器中的细胞悬液加入离心桶，并将清洗液加入产品收集容器，然后再将产品收集容器中的所有液体加入离心桶；

s9、离心桶离心，8-12min后通过活塞的移动将离心桶内的大部分液体挤至分离液废液容器中；

s10、向离心桶内加入清洗液，继续离心5-10min后，将离心桶内的大部分液体挤至分离液废液容器中；

s11、向离心桶内再次加入清洗液，然后将离心桶内的所有液体挤压至产品收集容器中；

s12、重复步骤s11一次；

s13、取下产品收集容器，分离完成。

步骤s5中：第三光电对射传感器用于检测离心桶与第三三通阀之间透明导管中的液体颜色，进而判断透明导管内流动的物质；

摄像头用于拍摄离心桶的照片，然后得到活塞的位置，进而判断离心桶内剩余液体的容量；

超声流量传感器，用于检测管路流量速度及不同阶段双向流量。

采用以上方法与现有技术相比，本发明具有以下优点：通过多次分离，可以方便的将血样中的pbmc分离出来，并且都是通过控制器以及传感器自动判断的，所以分离准确度也较高，并且因为不需要用户手工操作，所以分离效率也较高。

附图说明

图1为本发明pbmc分离装置的结构示意图。

如图所示：1、离心桶；2、电机；3、活塞；4、气泵；5、血样采集头；6、分离液废液容器；7、清洗液采集头；8、产品收集容器；9、第一三通阀；10、第二三通阀；11、第三三通阀；12、第一光电对射传感器；13、第二光电对射传感器；14、第三光电对射传感器；15、摄像头；16、观察滴漏；17、旋转平台；18、旋转头；19、冷却机构；20、超声流量传感器。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明做进一步描述，但是本发明不仅限于以下具体实施方式。

具体实施例一：一种pbmc分离装置，它包括控制器、离心桶1、用于带动离心桶1转动的第一动力机构、设置在离心桶1内的活塞3、用于带动活塞3在离心桶1内竖直移动的第二动力机构、血样采集头5、分离液废液容器6、清洗液采集头7、产品收集容器8、第一三通阀9、第二三通阀10、第三三通阀11、第一光电对射传感器12、第二光电对射传感器13、第三光电对射传感器14、超声流量传感器20以及用于探测离心桶1内活塞3位置的摄像头15，所述血样采集头5、分离液废液容器6均与第一三通阀9连通，清洗液采集头7、产品收集容器8均与第二三通阀10连通，且第一三通阀9、第二三通阀10以及离心桶1均与第三三通阀11连通，所述第一光电对射传感器12设置在血样采集头5与第一三通阀9之间，所述第二光电对射传感器13设置在第二三通阀10与第三三通阀11之间，所述第三光电对射传感器14设置在第三三通阀11与超声流量传感器20之间，所述超声流量传感器20设置在第三光电对射传感器14与离心桶1之间，并且第一动力机构、第二动力机构、第一三通阀9、第二三通阀10、第三三通阀11、第一光电对射传感器12、第二光电对射传感器13、第三光电对射传感器14以及摄像头15均与控制器信号连接，其中：

离心桶1包括中间的容置腔、下部的旋转平台17以及上部的旋转头18，整体可以在动力机构的带动下进行离心式旋转；

第一动力机构，可以采用电机2，通过电机2带动旋转平台17转动，进而实现带动离心桶1整个转动；

活塞3，设置在离心桶1的容置腔内，可以在容置腔内滑动；

第二动力机构，可以采用气泵4，通过气泵4来带动活塞3在容置腔内滑动；

血样采集头5、清洗液采集头7，用于插入容器或者袋中，均为现有技术常规技术，所以在此不详细展开；

分离液废液容器6以及产品收集容器8，都为普通容器，只是分离液废液容器6还有加液口，加液口上设置有无菌过滤器；

第一三通阀9、第二三通阀10以及第三三通阀11，都是可以通过控制器控制的三通阀，可以实现各路的导通与断开，也属于现有技术，所以在此也没有详细展开；

光电对射传感器，包括发射端与接收端，主要是检测处于发射端与接收端的液体的颜色或者透明度，方便分析导管中流的液体是什么液体，因为分离后的血样的各组分颜色均不相同，并且与清洗液以及分离液的颜色也不一样，所以通过光电对射传感器可以大致判断出具体是哪一种；

超声流量传感器20，通过超声波来检测检测管路流量速度及不同阶段双向流量；

摄像头15，用于拍摄离心桶1的照片，然后就可以通过照片来进行图像处理以及分析，得到离心桶1内活塞3的位置，进而得到离心桶1内溶液的量；

控制器，可以采用pc电脑或者智能终端，主要是用于控制各个部件按照设定程序工作，并且根据光电对射传感器、超声流量传感器20以及摄像头15反馈回来的信息，进行处理分析，然后得到一个处理结果，并且根据得到的处理结构来控制各个部件进行工作。

具体实施例二，与具体实施例一的区别在于，具体实施例二中还包括了冷却机构19，主要是在旋转头18与旋转平台17上设置冷却块，冷却对应的区域。

具体实施例三，与具体实施例一的区别在于，具体实施例三中血样采集头5与第一三通阀9之间还设置了观察滴漏16，方便用户观察血样采集情况，并且观察滴漏16中还设置了用于过滤血凝块的过滤机构。

上述装置的控制方法，它包括以下步骤：

s1、将带有100ml血样的采血袋以及带有500ml清洗液的清洗液袋分别连接到血样采集头以及清洗液采集头上，同时将100ml分离液注入到分离液废液容器中；其中分离液为ficoll（品牌为ge，货号为17-1440-03），清洗液为生理盐水；

s2、离心桶以800xg的离心力转动，同时将分离液废液容器内的分离液注入离心桶，此处主要通过活塞下移的吸力将分离液从分离液废液容器中吸到离心桶中；

s3、待分离液全部注入离心桶后，将采血袋内的血样缓慢的注入分离室，注入速度为10ml/min至40ml/min，同时通过第三光电传感器、超声流量传感器以及摄像头进行监控测量，需要将血样全部加入到离心桶，血样是依靠自身重力与活塞吸力慢慢流入到离心桶内；

s4、待血样全部注入离心桶后，保持800xg离心力离心10-15min（最优为15min）；其中，离心完成后分，离心桶的页面从内到外依次血浆层、pbmc所在层、分离液层以及红细胞层；

s5、通过离心桶中活塞的移动，同时通过第三光电传感器、超声流量传感器以及摄像头的检测，首先将血浆层挤压至采血袋中，（即通过控制活塞上移，将中间的血浆层先挤出大部分），然后将少部分血浆、pbmc和少量分离液挤压至产品收集容器中，最后将剩余的分离液和红细胞挤压至分离液废液容器中；

s6、向离心桶中加入100ml清洗液，然后将清洗液通过活塞挤出至分离液废液容器中；

s7、重复步骤s6一次；

s8、将产品收集容器中的细胞悬液（主要包括血浆、pbmc以及分离液）加入离心桶，并将100ml清洗液加入产品收集容器，然后再将产品收集容器中的所有液体加入离心桶（此举为了清洗产品收集容器，防止有残留的pbmc在产品收集容器内）；

s9、离心桶离心，8-12min（最优10min）后通过活塞的移动将离心桶内的大部分液体挤至分离液废液容器中，最终离心桶内会留存10ml液体；此处主要是通过摄像头、流量计以及光电对射传感器三者一起来判断，这样判断准确性较高；

s10、向离心桶内加入100ml清洗液，继续离心5-10min后，将离心桶内的大部分液体挤至分离液废液容器中，最终离心桶内会留存10ml液体；此处主要也是通过摄像头、流量计以及光电对射传感器三者一起来判断，这样判断准确性较高；

s11、向离心桶内再次加入20ml清洗液，然后将离心桶内的所有液体挤压至产品收集容器中；

s12、重复步骤s11一次；

s13、取下产品收集容器，分离完成。

上述不同容器或者袋与离心桶之间的通断主要通过控制三个三通阀来实现，在此不详细展开。

分离原理是：血样中pbmc的密度和分离液的密度相当，而血样中的红细胞密度大于分离液，血浆密度小于分离液。将血样加入到分离液上层，通过离心后，由于红细胞、pbmc、血浆和分离液的密度不同，则不同成分会进行分层，将pbmc和部分血浆所占的层吸取出来，再通过清洗去除血浆即可得到pbmc。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的技术人员应当理解，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换；而这些修改或者替换，并不使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神与范围。