1.一种bcr高通量测序文库的构建方法,其特征在于:其方法基于对bcr的重链igg及两条轻链igl及igk,各自设计了一套引物集合,能扩增目前已发现的所有igg,igl,igk的不同等位基因,同时在扩增时各自加入一套内参序列,经过后期使用内参的校正,能真实的还原bcr的真实情况而建立的高通量测序文库的构建方法。
2.根据权利要求1所述的bcr高通量测序文库的构建方法,其特征在于:其方法包括以下步骤:
s1、cdna模板制备:包括细胞rna提取、组织rna提取,起始量为大于1mg,对mrna进行质量鉴定及浓度检测,rna总量大于100ng,进行混合合成,且按一定要求配置混合体系,并在pcr仪上进行反应,形成产物cdna模板a;
s2、纯化好的cdna模板a中加入内参0.1ul的内参序列,进行pcr反应,形成产物b;
s3形成产物b连接高通量测序接头得到最终的测序文库。
3.根据权利要求2所述的一种bcr高通量测序文库的构建方法,其特征在于:所述的步骤s2加入的引物序列共349条,如序列表所示。
4.根据权利要求2所述的一种bcr高通量测序文库的构建方法,其特征在于:所述的s1的cdna模板制备包括以下:
(1)细胞rna提取:细胞来源为人的外周血分离得到的淋巴细胞,细胞个数为大于500个,加入细胞裂解液进行裂解,使用rna提取试剂盒进行rna的抽提;
(2)组织rna提取:组织来源为人手术下来的肿瘤组织与正常组织,起始量为大于1mg,采用液氮研磨后加入裂解液进行裂解,使用rna提取试剂盒进行rna的抽提;
(3)对mrna进行质量鉴定及浓度检测,要求mrna的结果完整,rna总量大于100ng;
(4)为了提高cdna的产量,我们在合成cdna是做了前期优化处理,按照下表配置混合体系,并在pcr仪上进行反应,反应程序为:70℃,1min,反应程序结束后立马把产物放于冰上3min;
(5)配置下表的混合体系,与步骤(4)的产物混合后放在pcr仪上进行反应,反应程序为:42℃,90min,75℃,15min,4℃,∞,反应后的产物即为合成好的cdna模板a,将用于下一步;
5.根据权利要求4所述的bcr高通量测序文库的构建方法,其特征在于:所述的s2具体包括以下:
(1)将cdna模板a加入内参0.1ul的内参序列,内参序列是根据igg,igk及igl的v基因的表达量多少按相应的比例混匀后加入,根据扩增的需要每次只加入对应的内参序列,如需要扩增igg,则加入igg对应的内参,混匀后成cdna模板a,作为模板进行pcr反应,按照表下配制反应体系;
(2)再次pcr反应程序如下表:
(3)反应完成后,对该产物进行纯化,最后用30ulnuclease-freewater进行洗脱,得到产物b。
6.根据权利要求2、3、4或5所述的一种bcr高通量测序文库的构建方法,其特征在于:所述引物序列要求如下:
当受体为人bcrigg重链时:步骤2中的产物cdna模板a中的内参序列包含或由seqidno:1-seqidno:100组成;
当受体为人bcrigk重链时:步骤2中的cdna模板a中的内参序列包含或由seqidno:101-seqidno:200组成;
当受体为人bcrigl重链时:步骤2中的cdna模板a中的内参序列包含或由seqidno:201-seqidno:300组成;
当受体为人bcrigg重链时:步骤2中的primer1的核苷酸序列包含或由seqidno:301-seqidno:327组成;
当受体为人bcrigk轻链时:步骤2中的primer1的核苷酸序列包含或由seqidno:328-seqidno:336组成;
当受体为人bcrigl轻链时:步骤2中的primer1的核苷酸序列包含或由seqidno:337-seqidno:346组成;
当受体为人bcrigg重链时:步骤2中的primer2的核苷酸序列包含或由seqidno:347组成;
当受体为人bcrigk轻链时:步骤2中的primer2的核苷酸序列包含或由seqidno:348组成;
当受体为人bcrigl轻链时:步骤2中的primer2的核苷酸序列包含或由seqidno:349组成。