一种胞外分泌褐藻胶裂解酶的重组里氏木霉菌及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种胞外分泌褐藻胶裂解酶的重组里氏木霉菌及其应用。

背景技术：

以褐藻胶代表的海洋来源的多糖大分子，具有多种生物活性，在医药、农业、食品领域已经得到了广泛的应用。褐藻胶多糖酶解后生成的一系列不同分子量的寡糖分子，具有多糖所不具备的特殊生物活性，在医药领域具有巨大应用潜力。

专一性水解褐藻胶的褐藻胶酶是制备寡糖的专用酶，也是提取褐藻生物活性物质和开发海藻类产品的必用酶制剂，市场需求潜力很大。但是到目前为止，褐藻胶裂解酶的商业化酶制剂还没有产品问世，其主要原因是缺乏高水平表达褐藻胶裂解酶的重组工程菌。褐藻胶裂解酶的缺乏限制了褐藻寡糖类产品的开发。

cn103695341a公开了一种利用海洋细菌生产的褐藻胶裂解酶的方法所述方法提供了一株新型的褐藻酸裂解酶的菌株cobetiasp.wg-007,利用该菌株发酵可生产高活力的褐藻胶裂解酶。然而该方法分泌的褐藻胶裂解酶的酶活力最高仅150-180u/ml，存在酶活力较低的问题。

cn107904223a公开了一种分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用，本发明通过向宿主细胞导入敲除d-丙氨酸消旋酶基因的第一质粒，进行筛选，获得d-丙氨酸消旋酶基因敲除的枯草芽孢杆菌，向敲除d-丙氨酸消旋酶基因的宿主细胞导入第二质粒，利用lb培养基培养得到高效分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞。此发明中的褐藻胶裂解酶表达水平在20000u/ml，虽然酶产量较高，但粗酶液只含有褐藻胶裂解酶，只能酶解精制褐藻酸钠底物制备褐藻寡糖，且催化反应温度为40℃，酶解设备中容易滋生环境微生物，造成酶解失败；此发明菌株在构建过程中进行多次抗生素筛选造成生产过程繁琐。

里氏木霉菌作为生长迅速、培养条件简单的重要丝状真菌工程菌，是美国fda认证的食品安全级的工业生产菌株,具有强大的蛋白分泌能力，食品和饲料用的纤维素酶和木聚糖酶都来自于里氏木霉菌的发酵。因此，发明一种胞外分泌褐藻胶裂解酶的重组里氏木霉菌，利用粗酶液直接转化底物，简化生产过程，对于褐藻寡糖的制备具有重要的价值和意义。

技术实现要素：

针对现有菌株分泌的粗酶液制备褐藻寡糖较为困难的问题，本发明提供了一种重组里氏木霉菌，通过重组里氏木霉菌发酵的方式实现褐藻胶裂解酶的胞外高水平表达，解决粗酶液制备褐藻寡糖过程中易滋生环境微生物和生产制备过程较为繁琐的问题。

一种胞外分泌褐藻胶裂解酶的重组里氏木霉菌，将褐藻胶裂解酶基因与表达质粒连接，构建重组表达质粒，然后将所述重组表达质粒转入里氏木霉菌中得到重组里氏木霉菌。

将外源的褐藻胶裂解酶编码基因和表达载体连接，构建重组表达质粒后，再导入里氏木霉菌宿主细胞中得到重组里氏木霉菌，里氏木霉菌具有遗传背景清晰，发酵工艺较为成熟的优势。通过重组里氏木霉菌发酵生产褐藻胶裂解酶，是生产食品级的褐藻胶裂解酶酶制剂的最佳选择。

优选的，所述的褐藻胶裂解酶编码基因magl(genbankmg792316)，该基因易于按照里氏木霉菌密码子偏好性进行优化，优化后的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述核苷酸序列编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。

优选的，所述的表达质粒为p1300-c30，p1300-c30质粒在里氏木霉菌细胞内能够强力表达。

优选的，所述的里氏木霉菌菌株为trichodermareeseirut-c30(atcc56765)，该菌株生长迅速，具有强大的蛋白分泌能力。

优选的，所述的重组里氏木霉菌进行发酵，发酵上清液作为褐藻胶裂解酶粗酶用于分解褐藻酸钠或海带泥；或者从发酵上清液中分离纯化出褐藻胶裂解酶用于分解褐藻酸钠。

优选的，所述的海带泥为海带破碎后的泥状物质。

优选的，所述的重组里氏木霉菌发酵条件为：35～37℃条件下，发酵96～120h，离心，分离，获取发酵液上清液。

优选的，所述褐藻胶裂解酶催化温度为45～55℃，基本杜绝环境微生物滋生，保证酶解稳定进行。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过褐藻胶裂解酶基因与表达质粒连接，构建重组表达质粒，然后将所述重组表达质粒转入里氏木霉菌中得到重组里氏木霉菌，重组里氏木霉菌应用于蛋白表达领域，是一种食品级安全的宿主细胞，生长迅速，遗传背景清晰，发酵工艺较为成熟，具有广泛的应用前景；

(2)本发明提供的重组里氏木霉菌自身天然生产纤维素酶和木聚糖酶，发酵上清液同时含有纤维素酶、半纤维素酶(木聚糖酶等)和褐藻胶裂解酶，无需纯化，直接利用粗酶液即可转化海带泥底物制备褐藻寡糖；

(3)本发明提供的重组里氏木霉菌表达褐藻胶裂解酶表达水平在1950u/ml左右，在10％底物含量的褐藻寡糖酶解体系中仅需要添加总体积1％的粗酶液即可高效催化酶解反应；

(4)本发明通过重组里氏木霉菌发酵的方式实现褐藻胶裂解酶的胞外高水平表达，随着发酵周期延长到96h，重组褐藻胶裂解酶的表达量增加，产量可达到745mg/l；

附图说明

图1为p1300-c30-magl质粒图谱。

图2为实施例2阳性克隆菌落pcr筛选电泳图。

图3为实施例4重组里氏木霉表达褐藻胶裂解酶胞外上清电泳图；在不同发酵时间点取样进行电泳，纯化样品作为对照。

图4为实施例5重组褐藻胶裂解酶纯化电泳图。

图5为实施例7褐藻胶裂解酶水解产物tlc图，其中，1,2,3号样品分别代表褐藻寡二糖，寡三糖和寡四糖标准品，4号代表水解寡糖产物。

图6为实施例9酶解海带提取物寡糖产物tlc分析图。1,2,3号样品分别代表水解0h，2h，4h的海带提取物样品。

具体实施方式

实施例1构建重组表达质粒

(1)褐藻胶裂解酶编码基因序列按照里氏木霉菌密码子偏好性优化后全基因合成，然后将优化序列置于质粒上的来自于里氏木霉菌的gap强启动子的启动下，同时在裂解酶基因n端融合里氏木霉菌的纤维素酶的信号肽序列。

(2)根据本实验室克隆的海洋细菌来源的褐藻胶酶编码基因magl(genbankmg792316)，通过里氏木霉偏好密码子优化，基因合成如seqidno.1所示的序列。

根据p1300-c30载体的酶切位点，设计表达引物序列如下：

上游引物：magl-f：5’-atgaccgatcgcattattgctttcctgata-3’；

下游引物magl-r：5’-tcacgattcgatcctcccaatgcca-3’；

(3)将上述设计的引物，以合成褐藻胶裂解酶编码基因magl为模板扩增magl基因片段。扩增条件：使用superpfumix试剂，扩增magl基因片段，pcr扩增体系如下：

表1magl基因pcr扩增条件

pcr的反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸3min，循环数30；72℃延伸10min。

(4)表达质粒p1300-c30经kpni和hindiii双酶切线性化后与同样双酶切之后的magl扩增基因片段，通过t4连接酶连接，构建重组质粒p1300-c30-magl，测序验证，确认重组质粒构建成功，命名为p1300-c30-magl，如图1所示。

实施例2构建重组里氏木霉菌株

将构建好的重组表达质粒p1300-c30-magl，采用电转化原生质体的方法转入里氏木霉菌(trichodermareeseirut-c30，atcc56765)中。具体如下：

(1)采用magl-f和magl-r引物进行菌落pcr，筛选阳性转化子。

菌落pcr扩增条件如下：

表2菌落pcr扩增条件

pcr的反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环数30；72℃延伸10min。

(2)pcr产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。结果显示，1-5号克隆都检测到有800bp目的条带出现，则验证重组里氏木霉菌已经构建成功。

实施例3摇瓶发酵生产褐藻胶裂解酶

(1)将实施例2成功构建的重组里氏木霉菌单菌落接种于种子培养基中，于37℃、220rpm下培养10h，备用。

种子培养基：包括以下质量浓度的组分：k2hpo4·3h2o12.5g/l，硫酸铵1.5g/l，尿素2g/l，葡萄糖1g/l,玉米浆干粉3g/l。

(2)将上述培养好的重组里氏木霉菌的种子液按体积5％接种于液体发酵培养基中，于37℃、220rpm条件下发酵120h，12000rpm离心10min，固液分离，获取发酵液上清液，即为重组褐藻胶裂解酶粗酶液。

发酵培养基包含以下质量浓度的组分：蔗糖50g/l、蛋白胨10g/l、乳糖5g/l、硫酸铵6g/l、酵母粉20g/l、k2hpo4·3h2o12.5g/l、kh2po42.5g/l以及mgso4·7h2o1.5g/l。

实施例4重组褐藻胶裂解酶产量的测定

(1)上述实施例3中得到的发酵液粗酶液，sds-page检测蛋白的表达情况，利用凝胶成像系统的灰度测定软件对重组褐藻胶裂解酶的条带进行分析，结果见图3。由结果可以得知，在发酵的24h重组褐藻胶裂解酶开始分泌表达，随着发酵周期依次延长到48h,72h,96h，重组褐藻胶裂解酶的表达量增加。

(2)经过测定和计算，褐藻胶裂解酶产量可达到745mg/l。结果证明褐藻胶裂解酶编码基因magl，在重组里氏木霉菌实现了胞外分泌表达。

实施例5重组褐藻胶裂解酶的纯化

(1)20ml镍亲和层析介质置于砂芯分液漏斗中，用100mmna2hpo4/nah2po4(ph＝7.0)的缓冲液冲洗2个主体积，以平衡介质。

(2)取100ml上述实施例3中得到的发酵液粗酶液，0.22μm微孔滤膜过滤除去不溶颗粒后，滤清液加入到平衡好的20ml镍亲和层析介质中，轻轻搅拌混匀，静置20min，以保证充分亲和吸附。

(3)打开分液漏斗，释放含有未吸附杂蛋白的流穿液。

(4)分批加入50ml的100mm,200mm,500mm和1m的咪唑溶液洗脱，并单独分批收集每次的洗脱液。

(5)将每批洗脱液置于透析袋中，在100mmna2hpo4/nah2po4(ph＝7.0)的缓冲液体系中透析，除去咪唑。

(6)sds-page检测洗脱样品中目的蛋白的纯度，结果如图4。

实施例6褐藻胶裂解酶的活力和比活力测定

(1)50ml烧杯中，去离子水配制1％(w/v)浓度的褐藻酸钠(青岛明月公司产品，食品级)底物溶液10ml。将实施例5中制备的纯化褐藻胶裂解酶稀释100倍后，取10μl加入到1ml底物溶液中，充分混合均匀后50℃水浴锅静置过夜反应约20min。加入2mldns试剂，混匀后100℃水浴10min，再加入7ml去离子水。混匀后，540nm波长测定光吸收值。每0.05个od值定义为1个活力单位u。

(2)将实施例5中制备的纯化褐藻胶裂解酶稀释100倍后，取100μl，加入500μl考马斯亮蓝试剂，混匀后静置20min，595nm波长下测定光吸收值。每0.1个od值定义为0.8mg/ml的蛋白浓度。

(3)测定结果纯化褐藻胶裂解酶的酶活力单位数为1950u/ml,比活力为30000u/mg蛋白。

实施例7重组褐藻胶裂解酶水解褐藻酸钠的寡糖产物薄层层析(tlc)测定

(1)实施例5中制备的纯化褐藻胶裂解酶(活力约1950u/ml)稀释100倍后，取100μl加入到10ml、1％褐藻酸钠的底物溶液中，搅拌均匀后50℃水浴锅静置过夜反应约10h。

(2)取1μl反应产物液，点tlc薄层硅胶板(青岛黄海公司产品)，展开剂展开后，喷适量显色剂，130℃干燥箱烘干显色。褐藻寡二糖，寡三糖和寡四糖(青岛博智汇力公司产品)作为标准品。

展开剂：甲醇:水＝8:2

显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸

配制方法：2％苯胺丙酮溶液:2％二苯胺丙酮溶液:85％磷酸按照体积比5:5:11的比例混合后，静置待用。

(3)tlc结果如图5所示。

由tlc结果可知，纯化重组褐藻胶裂解酶水解褐藻酸钠底物，终产物主要是聚合度为2,3,4的寡糖。

实施例8褐藻胶裂解酶制备褐藻寡糖

将实施例5中制备的纯化褐藻胶裂解酶(活力约1950u/ml)用于褐藻寡糖的制备，步骤如下：

(1)25l玻璃反应釜，配制8％(w/v)浓度的褐藻酸钠底物胶体溶液。

在釜中先加入10l去离子水，加入800g食品级褐藻酸钠(青岛明月公司产品)。底物褐藻酸钠需要分批缓慢加入，伴随不间断搅拌，速度在60rpm，水温控制在40-50℃。底物总加入的时间约为60min。底物加入完毕后，保持搅拌2h。

(2)反应釜中加入纯化褐藻胶裂解酶2ml(总活力数约3000u)，搅拌均匀。

(3)反应釜温度调整至50℃，搅拌转速设置为100rpm，保温反应4h。

(4)使用北京荣恒公司的8040纳滤膜包系统处理反应液以除去盐离子，同时将10l反应液浓缩成2l，再使用冷冻干燥机将2l发酵液冻干为粉末固体褐藻寡糖，总质量为784g。

实施例9重组褐藻胶裂解酶粗酶直接酶解海带泥制备海带提取物

步骤如下：

(1)100l不锈钢桶，加入干海带5kg，去离子水50l，室温静置溶胀4h。

(2)将溶胀好的海带捞出，用自来水洗涤泥沙后，称重定量50kg，投入100l不锈钢反应釜中，再加入10kg去离子水。

(3)反应釜温度设置为45℃，搅拌转速为120rpm，持续搅拌2h，至海带挤压成均匀泥状。

(4)向总体积约50l的海带泥中缓慢加入500ml粗酶液，保持反应釜温度设置为45℃，搅拌转速为120rpm，反应4h。

(5)收集反应釜中全部液体水解产物，使用截留直径为1微米的滤袋过滤，利用重力过滤不溶残渣后，获得的上清液即为海带水解提取物。

实施例10海带提取物中的寡糖产物分析

(1)取海带水解提取物取1μl反应产物液，点tlc薄层硅胶板(青岛黄海公司产品)，展开剂展开后，喷适量显色剂，130℃干燥箱烘干显色。褐藻寡二糖，寡三糖和寡四糖(青岛博智汇力公司产品)作为标准品。

展开剂：甲醇:水＝8:2

显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸

配制方法：2％苯胺丙酮溶液：2％二苯胺丙酮溶液：85％磷酸按照体积比5:5:11的比例混合后，静置待用。

tlc结果如图6所示，从tlc结果可以看出，酶解海带提取物还有大量的主要聚合度在2-4的低分子量寡糖。

序列表

<110>杭州师范大学

<120>一种胞外分泌褐藻胶裂解酶的重组里氏木霉菌及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>846

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgatctctaagaagaacatcttgacttctatcactgttgcttctttgttgatctcttct60

ttcggtatggctcaaacttctgacaagaaggacaaggctccattcgacttgactcactgg120

aaggttactatcccagaaggtaacccaacttctaacggttacccagaaatcttgggttac180

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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