一种伯克氏农业生防菌株Ba1及其用途的制作方法

本发明涉及一种防治枯萎病的菌株及其应用，具体涉及一种防治植物枯萎病的伯克氏菌菌株ba1及其应用。

背景技术：

枯萎病是植物十大真菌病害之一。油桐枯萎病(俗称“桐瘟”)，自1939年在广西柳州被首次发现以来，已在全国8个省份90多个县市发生病害，对油桐产业产生毁灭性破坏，经济损失巨大，严重威胁着全国近百万公顷的油桐林。

油桐枯萎病是一种土传的真菌病害，2009年开始，相继在广西百色田林县油桐枯萎病病发区(近1000亩)和贵州黔南独山县油桐枯萎病病发区(1000余亩)分离鉴定枯萎病病原菌为专化型尖孢镰刀菌(fusariumoxysporumf.sp.fordii)(fof)(袁志林等,2011；杨素素等，2014)。该病菌是弱寄生菌，在土壤或病株残体中存活，在适宜的条件下，病菌主要从须根侵入，也可以从根部和根茎伤口侵入，沿木质部导管向上蔓延，使根部腐烂、枝干黑褐色、叶片黄化，造成油桐半株或全株枯萎，主要危害三、四年生以上的三年桐。感染率基本都在90％以上，而抗病千年桐低于1％的感病率。

植物枯萎病目前尚无有效的防治手段。

burkholderiaarboris属于伯克氏菌群，伯克氏菌群是一类非常具有应用前景的植物根际促生菌，在农业生物防治发挥重要作用，比如伯克氏菌群能用于对水稻纹枯病、黄瓜根线虫、苹果灰霉病、梨青霉病和桃褐腐病等的防治，还具有解磷、解钾、固氮和促进植物生长的作用)。伯克氏菌可产生吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、cepaciamidea、cepacidinea等多种次生代谢物质而发挥生防作用。

哌嗪二酮类化合物(diketopiperazines，dkps)上要是由微生物产生的，特别是近年来国内外科学家相继从来源海洋的细菌、放线菌和真菌中分离到大里具有dkps结构的活性天然产物；吡咯并吡嗪酮类化合物具有消炎、抗肿瘤活性，但是目前没有伯克氏菌群与dkps及吡咯并吡嗪酮类化合物关联性的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种防治植物枯萎病的伯克氏菌菌株ba1及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种防治植物枯萎病的伯克氏菌菌株ba1，为burkholderiaarborisba1，其保藏号为：cgmccno:16905。

本发明还同时提供了上述伯克氏菌菌株ba1在防治植物(油桐)枯萎病中的应用。

本发明还同时提供了一种防治植物(油桐)枯萎病的制剂：为利用伯克氏菌菌株ba1制备而得的液体菌剂或固体菌剂。

本发明还同时提供了上述制剂的制备方法：将伯克氏菌菌株ba1经菌种活化、液体发酵或固体发酵，从而制备获得液体菌剂或固体菌剂。

作为本发明的制剂的制备方法的改进：还包括种子培养(菌种培养)；

即，所述制备方法为：将伯克氏菌菌株ba1经菌种活化、种子培养(菌种培养)、液体发酵或固体发酵，从而制备获得液体菌剂或固体菌剂。

作为本发明的制剂的制备方法的进一步改进：液体发酵时采用的培养基(液体发酵培养基)为：玉米浆10-15g/l，甘油10ml/l，nacl1.00g/l，kh2po40.50g/l，ph值7.00；

液体发酵条件：接种量2％(体积％)，25～28℃，(200±20)r/min，培养(24±2)h。

作为本发明的制剂的制备方法的进一步改进：固体发酵时采用的固体培养基(固体发酵培养基)为：玉米浆干粉10-15g，葡萄糖3-4g，nacl1g，kh2po40.50g；

固体发酵条件为：按照5-10％(质量％)的接种量，(25±1)℃发酵48-72h，发酵过程中翻料从而控制物料的中心温度≤35℃。

本发明还同时提供了上述伯克氏菌菌株ba1的用途：制备哌嗪二酮类化合物dkps、吡嗪酮类化合物。

作为本发明的伯克氏菌菌株ba1的用途的改进：制备消炎、抗肿瘤药物。

本发明的菌株ba1为burkholderiaarboris，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmccno:16905，保藏时间2018年12月07日。

本发明的防治植物枯萎病的伯克氏菌株ba1，由于该菌株本身分离自植物根，根际定制能力强，生防效果良好，尤其对植物枯萎病病原菌的拮抗能力强，能用于防治植物枯萎病。

具体来说，本发明中的液体菌剂可以通过以下工艺流程获得：菌种ba1活化(即一级种子培养)→菌种培养(即二级种子培养，可选)→液体发酵(发酵罐，无菌空气，培养液)→液体菌剂。

优选的液体培养基为：玉米浆13.88g/l，甘油10ml/l，nacl1.00g/l，kh2po40.50g/l，ph值7.00；接种量2％，25～28℃，200r/min，培养24h。

具体来说，本发明中的固体菌剂可以通过如下工艺流程获得：菌种ba1活化(即一级种子培养)→菌种培养(即二级种子培养，可选)→固体发酵(固体培养基质)→发酵饼→干燥粉碎，与吸附载体按1：1或者其它比例混合，混匀后适当干燥，制成固体菌剂。其中吸附载体可为非耕作层土、高岭土等多种载体。

固体发酵时采用的固体培养基优选为玉米粉干粉10-15g，葡萄糖3-4g，nacl1g，kh2po40.50g。

上述制剂能用于防治植物枯萎病。

本发明中的制剂在防治植物枯萎病时，可以将液体菌剂或固体菌剂与普通有机肥按2∶100的重量比混合拌匀后作为底肥施用，每个定植穴施1-2公斤，在植物种植前施用；也可以在植物种植后的生长期，将液体菌剂或者固体菌剂以稀释5-10倍的比例加入到溶解的常规肥料中，对油桐植株进行浇灌施肥；或者可以通过将液体菌剂稀释成2-5倍或根据需要进行稀释后液灌根或浇施于植株基部，或于植物苗移栽前浸根。

本发明具有如下的技术优势：

(1)本发明以伯克氏菌ba1作为拮抗菌株，其对植物枯萎病菌抑制作用强，对植物枯萎病具有良好的防治效果；

(2)本发明的制剂对植物具有促生长作用；

(3)本发明伯克氏菌菌株ba1培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，有着良好的开发应用前景；

(4)本发明制防治植物枯萎病的剂制备方法工艺简单，发酵培养基无需贵重原料，成本低，容易推广。

(5)本发明提供了一种产生天然哌嗪二酮类化合物和吡咯并吡嗪酮类化合物的方法。

综上所述，本发明的伯克氏菌菌株ba1能够有效抑制植物多种病原菌的生长，造成病原菌菌丝异常，对植物常见镰刀菌引起的真菌病害均有显著抑制活性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是伯克氏菌ba1的系统进化图(伯克氏菌分子系统进化树)；

图2是伯克氏菌ba1菌株对多种病原真菌的抑制效果；

a为油桐枯萎病尖孢镰刀菌菌的对峙实验结果；

b为黄瓜枯萎病尖孢镰刀菌菌的对峙实验结果；

c为小麦赤霉病禾谷镰刀菌的对峙实验结果；

d为桃褐腐病病原菌果生链盘菌的对峙实验结果；

上述a～d中，左侧为没有接种拮抗菌情况下的病原菌菌落生长情况，右侧为接种ba1后的菌落生长情况。

图3是伯克氏菌ba1菌株抑制油桐和黄瓜枯萎病菌菌丝、孢子异常的显微镜图片；

a为ba1对峙条件下油桐枯萎病菌的显微镜图片；

b为对照油桐枯萎病菌的显微镜图片；

c为ba1对峙条件下黄瓜枯萎病菌的显微镜图片；

d为对照黄瓜枯萎病菌的显微镜图片；

上述a～d中，左侧和右侧为重复。

图4是ba1液体培养基提取物化合物分析结果；

9个结构式为哌嗪二酮类化合物和吡咯并吡嗪酮类化合物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

实施例1、菌株的分离和鉴定

从贵州抗病油桐根中分离获得拮抗菌株，提取基因组dna，经16s核糖体rnapcr扩增，经测序鉴定为伯克氏菌属；进一步利用its构建系统进化树(图1)，确定该菌株为burkholderiaarboris(ba1)，进行了保藏，保藏信息如下：

本发明的菌株ba1为burkholderiaarboris，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmccno:16905，保藏时间2018年12月07日。

实施例2、伯克氏菌ba1对多种病原真菌的抑制效果

设置如下的对峙实验：选取油桐枯萎病病原菌，黄瓜枯萎病病原菌，小麦赤霉病病原菌和桃褐腐病病原菌，每种病原菌株采用打孔器从pda平板上转移出5毫米直径的菌块，置于新鲜配置的pda平板上，分别设置对照组(不接种接抗菌)和实验组(在病原菌四周划线接种ba1)。实验结果为显示ba1对油桐枯萎病病原菌(图2的a)，黄瓜枯萎病病原菌(图2的b)，小麦赤霉病病原菌(图2的c)和桃褐腐病病原菌(图2的d)的生长都有显著的拮抗作用。通过上述对峙实验，发现ba1对油桐枯萎病菌(图2的a)，黄瓜枯萎病菌(图2的b)，小麦赤霉病菌(禾谷镰刀菌)(图2的c)，果生链盘菌(图2的d)等多种病原真菌有明显的抑制效果。进一步显微观察发现伯克氏菌ba1菌株抑制油桐枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌菌丝、孢子异常(图3)。

实施例3-1、ba1液体菌剂及其制备方法

液体发酵时采用的液体发酵培养基为玉米浆13.88g/l，甘油10ml/l，nacl1.00g/l，kh2po40.50g/l，ph值7.0。

液体发酵培养基的制备方法为：在玉米浆13.88g/l、甘油10ml、nacl1.00g、kh2po40.50g中加水定容至1l，均匀混合后调节ph至7.0；经常规的高温灭菌(在1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。

玉米浆例如可选用天津市利发隆化工科技有限公司的国标型th16-972酶解的玉米浆。

ba1液体菌剂的制备方法具体为：

1)、菌种ba1活化：保藏号为cgmcc16905的伯克氏菌株ba1用接种环蘸取后于na固体培养基(na固体培养基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10g、nacl5g、琼脂18g，加水定容至1l，ph7.2，高温灭菌)划线，得活化后菌株；

2)、菌种培养：挑取1-2个活化后菌落接种置于50mlna液体培养基(na液体培养基：牛肉膏3.0g、蛋白胨10g、nacl5g，加水定容至1l，ph7.2，高温灭菌)，25℃，200r/min，培养16h，得种子培养液；

3)、液体发酵：将种子培养液按照2％(体积％)的接种量接种至液体发酵培养基中，25℃，200r/min，培养24h，得ba1液体菌剂。

实施例3-2、ba1固体菌剂及其制备方法

固体培养基(固体发酵培养基)的制备方法为：将玉米浆干粉10-15g、葡萄糖3-4g、nacl1g、kh2po40.50g均匀混合，经常规的高温灭菌(在1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。

玉米浆干粉例如可选用安琪酵母股份有限公司玉米浆干粉cs001。

ba1固体菌剂的制备方法具体为：

1)、菌种ba1活化：保藏号为cgmcc16905的伯克氏菌菌株ba1用接种环蘸取后于na固体培养基划线，得活化后菌株；

2)、菌种培养：挑取1-2个活化后菌落接种置于50mlna液体培养基，25℃，200r/min，培养16h，得种子培养液；

3)、固体发酵：将种子培养液按照5-10％(质量％)的接种量接种至灭菌后的固体培养基中，将接种后的固体培养基以4-7米的厚度平铺于透气的塑料筐内，然后置于固体发酵房内于25℃左右发酵，时常翻料以保持固体培养基的中心温度≤35℃，发酵48-72h，得ba1发酵饼，常规风干36-42小时后粉碎(过80目的筛)后与吸附载体按1：1的重量比或者其它比例混合，混匀后适当干燥(于20-25℃的条件下干燥5小时)，制成固体菌剂。其中吸附载体可为非耕作层土、高岭土等多种载体。

实施例4、ba1对植物枯萎病田间防治效果

选育120株油桐苗，设置两种施加菌剂的方案：

实验组一为用ba1液体发酵液(ba1液体菌剂)浸泡油桐种子2-3小时，然后进行播种，统计萌发率，待萌发后生长至4-6片叶子，再进行病原菌侵染实验(接种油桐枯萎病病原菌，计算致病率)；以水侵泡油桐种子作为对照；

实验组二为在每株油桐幼苗根部施加ba1液体发酵液(ba1液体菌剂)5ml，待油桐生长1个月后，再进行病原菌侵染实验；以未施加菌剂作为对照组；

所得结果如表1所述，本发明筛选出的保藏号为cgmcc16905的菌株对枯萎病有良好的防治效果，其菌剂能够有效防治油桐枯萎病的发生。

油桐枯萎病病情指数分级标准：

0级：无病症；

1级：叶片出现轻度萎蔫；

2级：叶片出现中度萎蔫和轻度黄化，茎秆一侧出现浅褐色病斑；

3级：叶片出现中高度萎蔫和黄化，茎秆一侧出现深褐色病斑或两处及以上褐色病斑；

4级：叶片高度萎蔫和黄化，部分叶片脱落，茎秆出现萎蔫及多处褐色病斑；

5级：叶片萎蔫黄化脱落，茎秆萎蔫变黑，根腐烂，整株坏死；

防治效果计算方法：病情指数＝∑(发病株数×该发病株级值)/(总调查株数×最高级值)×100；

防治效果(％)＝(调查时病情指数-初始病情指数)/调查时病情指数×100。

表1、ba1液体发酵液侵泡油桐种子或施加到幼苗根部

实施例5、ba1可以产生哌嗪二酮类化合物(diketopiperazines，dkps)和吡咯并吡嗪酮类化合物。

分别用不同的液体培养基对ba1进行液体发酵，有机提取浓缩后进行超高效液相串联飞行时间质谱鉴定化合物，并经过标样进行进一步确认，鉴定具体化合物为哌嗪二酮类化合物和吡咯并吡嗪酮类化合物。

具体为进行如下步骤：

1)、利用na液体培养基(牛肉膏3.0g、蛋白胨10g、nacl5g，加水定容至1l，ph7.2，，高温灭菌)对伯克氏菌ba1进行发酵培养，25℃，200r/min，培养16h，得到发酵液(种子培养液)；

2)、发酵液进行有机萃取：

将发酵液8000r/min离心20min，取上清；在分液漏斗(烘干后的)中，倒入等体积的乙酸乙酯(萃取剂)和伯克氏菌上清液，震荡后静置分层，下层液体从下口流出，上层液体从上口倒出，将下层液体倒回分液漏斗中，再用新的萃取剂萃取，菌液萃取三次，将上层液体收集合并，所得提取液进行进一步浓缩：用旋转蒸发仪(温度50℃、转速90r/min)，将伯克氏菌菌液蒸干，蒸发瓶底部得到干物质；用乙酸乙酯溶解干物质，用超声波清洗器清洗蒸发瓶；将溶液收集到离心管中，用氮吹仪吹干。最后获得的浓缩提取物，进行超高效液相串联飞行时间质谱鉴定化合物，并且利用标品进一步确定。

所得结果具体为：可以产生9种化合物，属于哌嗪二酮类化合物(diketopiperazines，dkps)和吡咯并吡嗪酮类化合物，具体结果如图4。

说明：也可以用kingb培养基(蛋白胨20g,k2hpo4·3h2o1.5g,mgso4.7h2o1.5g,ph7.2±0.2，调完ph加10ml的甘油，加水定容至1l，高温灭菌)或者fe³⁺kingb培养基(蛋白胨20g,k2hpo4·3h2o1.5g,mgso4.7h2o1.5g,fe³⁺0.27g，ph7.2±0.2，调完ph加10ml的甘油，加水定容至1l，高温灭菌)替代上述na液体培养基，也能获得类似结果。

对比实验、将目前现有的类似菌株(如下表2所述)以及本发明在发明过程中筛选到的其他菌株(如下表2所述)，按照上述实施例4(菌株发酵液浸泡油桐种子，病原菌侵染实验中，接种油桐枯萎病/黄瓜枯萎病病原菌)和实施例5所述方法进行实验，所得结果与本发明的伯克氏菌菌株ba1的对比如下表2所述。

表2

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。