菌株及其在防治三七根腐病中的应用的制作方法

本发明涉及一种菌株及其在防治三七根腐病中的应用，属于生物农药领域。
背景技术：
：近年来，随着中药资源需求量的急剧增长，中药野生资源破坏严重，难以满足市场需要，将野生中药材转为栽培成为满足市场需求的必由之路。野生中药材很少发生病害，即使有也不会形成灾害，中药材由野生转为人工栽培后，其生长环境发生变化。在人工营造的农业生态系统中，生物种类单一，植株密度增加，且高水高肥、人为远程调种等，这些管理措施为病害流行创造了条件，使得病害易于在种群内部、田块之间、地区之间蔓延传播，导致人工栽培药材较易感染病害。如大面积人工种植三七就存在此类问题。三七(panaxnotoginseng(burk.)f.h.chen)为五加科人参属多年生草本植物，是我国名贵中药材。三七是多年生宿根植物，喜温暖阴湿环境，由于连年大面积单一种植三七，为病害的发生提供了有利条件。三七主要病害为根腐病，其主要病原菌为：柱孢属真菌(destructans，c.didynum)、腐皮镰孢菌(fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、茎点霉(phomaherbarum)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)、恶疫霉菌(phytophthoracactorum)、假单胞菌(pseudomonasspp.)、根结线虫(meloidogynespp.)等。根腐病可导致三七产量降低5～20％，严重时可达70％以上，根腐病造成的损失占三七各种病害的70～85％，目前已成为三七种植业的重要制约因素之一。目前主要通过喷施化学药剂防治中药材病虫害，化学农药的长期使用会造成环境污染、破坏生态系统、易产生抗药性病原菌，甚至给中药材带来农药残留和重金属污染等危害，因此合理降低农药使用，找到绿色、环境友好型的防控方式，对防治中药材病害有重要的意义。技术实现要素：根据本发明的一个方面，提供了一种菌株。根据本发明的一个方面，提供了一种该菌株在防治三七根腐病中的应用，该菌株用于解决现有技术中人工大面积长期单一种植三七，三七易感根腐病菌，影响三七产量；采用化学农药对三七感染病菌进行防治，易污染环境、破坏生态系统、易产生抗药性病原菌的技术问题。本发明的一方面还提供了一种菌株具有如下所示的核苷酸序列中任意一项：ⅰ、具有seqidno.1所示的核苷酸序列；ⅱ、具有seqidno.1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的菌株，其为普城沙雷氏菌(serratiaplymuthica)。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的菌株保藏编号为cgmccno.18387。在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的菌株为革兰氏染色阴性菌，菌体为杆状；所述菌株的菌落在na平板上呈淡黄色，表面光滑，隆起，边缘整齐为圆形。本发明的一方面还提供了一种上述菌株在防治三七根腐病中的应用。可选地，所述抑制包括：对三七尖孢镰刀菌、三七腐皮镰刀菌、三七恶疫霉菌的菌丝生长、孢子萌发的抑制。可选地，所述三七根腐病为由三七尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌及三七恶疫霉菌引起的三七根腐病。本发明的一方面还提供了一种运用如上述菌株防治三七根腐病的方法，至少包括以下步骤：将所述菌株活化后配置为发酵液；将含有所述菌液的液体灌入三七植株根部。在一具体实施例中，将菌株pblj042接种于na培养基平皿中，28℃下倒置培养2天，挑取菌株接种到1000mlna液体培养液中，置于温度为28℃、转速为200r/min的条件下培养2天得到发酵液。可选地，所述三七植株为苗期和成株期植株。可选地，将所述发酵液稀释20倍后，按每株20ml将发酵液注入植株根部，连续使用2～3次，每次间隔30天。在一具体实施方式中，该菌种的筛选方法包括以下步骤：从云南省丽江市采集健康的重楼块茎，按常规无菌操作，采用质量浓度75％乙醇浸泡该块茎1min，无菌水冲洗3次后，用无菌滤纸吸干表面水分；再以质量浓度0.2％的hgcl2浸泡该块茎3min后，无菌水冲洗10次，无菌滤纸吸干表面水分，完成对该块茎消毒。用无菌解剖刀削去已表面消毒的重楼块茎表皮，切成0.5*0.5cm的正方体小块，置于na培养基平板内，在28℃下培养2天。待平板上有菌长出后，采集菌株，采用平板划线纯化法在28℃下纯化3～5次后，所得纯化菌株编号为菌株pblj042，在各pda培养基上分别接种三七病原菌：孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌，并在各pda培养基的三七病原菌接种点附近划线接种菌株pblj042。之后在28℃下培养3天。采用对峙法测试菌株pblj042对三七各病原菌的拮抗性。本发明能产生的有益效果包括：1)本发明所提供的菌株，对三七孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌同时具有抑制作用。2)本发明所提供的菌株，可以有效防治由三七尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌及三七恶疫霉菌引起的三七根腐病，且能有效降低化学农药的使用，实现环境友好，避免抗药性病原菌产生。3)本发明所提供的菌株可运用于防治三七根腐病中的应用。生物保藏说明：生物材料：菌株pblj042，分类命名为普城沙雷氏菌(serratiaplymuthica)，于2019年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号cgmccno.18387。附图说明图1为本发明提供的菌株pblj042菌落形态示意图；图2为本发明提供的菌株pblj042的16snj系统进化树示意图；图3为本发明提供的菌株pblj042分别与恶疫霉菌、腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌进行平板对峙实验结果示意图；其中，a)为恶疫霉菌对照组菌落照片；b)为恶疫霉菌处理组菌落照片；c)为腐皮镰刀菌处理组菌落照片；d)为腐皮镰刀菌对照组菌落照片；e)为尖孢镰刀菌处理组菌落照片；f)为尖孢镰刀菌对照组菌落照片；图4为菌株pblj042的扫描电子显微镜结构照片。具体实施方式下面结合实施例详述本发明，但本发明并不局限于这些实施例。实施例如无特别说明，本发明的实施例中的原料、病菌及试剂均通过商业途径购买。实施例1本发明提供菌株的分离和筛选从云南丽江采集健康的重楼块茎，按常规无菌操作，采用质量浓度75％乙醇浸泡该块茎1min，无菌水冲洗3次后，用无菌滤纸吸干表面水分；再以质量浓度0.2％的hgcl2浸泡该块茎3min后，无菌水冲洗10次，无菌滤纸吸干表面水分，完成对该块茎消毒。用无菌解剖刀削去已表面消毒的重楼块茎表皮，切成0.5*0.5cm的正方体小块，置于na培养基平板内，在28℃下培养2天。待平板上有菌长出后，采集菌株，采用平板划线分离纯化法在28℃下纯化3～5次后，所得纯化菌株编号为菌株pblj042。在各pda培养基上分别接种三七病原菌：孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌，并在各pda培养基的三七病原菌接种点附近划线接种菌株pblj042。之后在28℃下培养3天。采用对峙法测试菌株pblj042对三七各病原菌的拮抗性，结果显示该菌株对三七孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌均有拮抗作用(见图3)。实施例2菌株鉴定1.形态特征观察菌落形态特征：将菌株pblj042接种在na平板上后，在28℃培养2天得到菌落。菌株pblj042形成的菌落如图1所示，菌落在na平板上呈淡黄色，表面光滑，隆起，边缘整齐，圆形。菌体形态特征：按现有革兰氏菌鉴定方法，对菌株pblj042进行染色后，显示红色，为革兰氏染色阴性菌。扫描电子显微镜显示菌株pblj042，所得结果参见图4，菌株pblj042的菌体为杆状，大小(0.32～0.64)μm×(0.84～1.30)μm。2.16s序列分析采用液氮研磨法提取菌株基因组dna后，采用引物：27f5'-agagtttgatcctggctcag3'；1492r5'-tacggctaccttgttacgactt-3'进行pcr扩增。凝胶电泳后送生物工程(上海)有限公司测序，序列全长为1387bp(见seq)。将所得序列提交到genbank数据库进行blast分析比对，发现与pblj042同源性较高的菌株(同源性可达99.86％)属于沙雷氏菌serratiasp.strainrl17-369-bif-c(ncbi编号：mk373734)。以16s序列构建nj系统进化树，如图2所示，菌株pblj042与普城沙雷氏菌serratiaplymuthica在同一分支。根据以上形态特征分析、its分析及nj系统进化树，初步鉴定菌株pblj042为普城沙雷氏菌。实施例3菌株pflj04对三七病原菌的抑菌活性测定在na培养基上28℃下培养菌株pblj0422天，以三七根腐病中常见的病原菌尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌作为病原靶标菌，采用对峙培养法测试菌株pblj042的抑菌活性，以空白组作为对照组，处理组为在病原靶标菌旁划线接种菌株pblj042，并在相同条件下(在na培养基上28℃下培养2天)进行培养。空白组中菌落图片如图3中a)、d)、f)所示，三七恶疫霉菌空白组菌落图片如图3中a)，菌落边缘完整，对称，整个培养基上覆盖菌丝，恶疫霉菌处理组如图3中b)所示，在病原靶标菌旁划线培养菌株pflj04后，恶疫霉菌受到抑制，病原菌菌落不对称，颜色相对空白组偏淡，与菌株pflj04菌落之间形成明细抑菌带。三七腐皮镰刀菌空白组菌落图片如图3中d)所示，空白组中菌落边缘完整，覆盖培养基中心区域菌落整体颜色透入培养基中。处理组如图3中c)所示，处理组中，在病原靶标菌旁划线培养菌株pflj04后，腐皮镰刀菌的生长受到抑制，所形成菌落不对称，靠近菌株pflj04菌落的一侧形成明显抑菌带，病原菌菌落颜色相对空白组偏淡。三七尖孢镰刀菌空白组菌落图片如图3中f)，空白组中菌落边缘完整，覆盖培养基中心区域，菌落整体对称。处理组如图3中e)所示，处理组中，在病原靶标菌旁划线培养菌株pflj04后，三七尖孢镰刀菌的生长受到抑制，所形成菌落不对称，靠近菌株pflj04菌落的一侧形成明显抑菌带。由图3可见，在对峙实验中，菌株pflj04对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、恶疫霉菌均具有明显的抑制生长、抑制发育、抑制增殖的效果。对图3中a)～f)中菌落尺寸进行测量并按下式计算抑菌率：抑制率(％)＝(对照组靶标菌落半径—处理组靶标菌落半径)/对照组靶标菌落半径×100％对照组靶标菌落半径为三七根腐病菌的生长半径，处理组靶标菌落半径为三七根腐病菌中心点到沙雷氏菌线中心之间的三七根腐病菌生长半径。结果见表1。表1菌株pblj042对三七病原菌的抑菌活性由表1可见，菌株pblj042对恶疫霉菌抑菌圈直径最小，抑菌率可达79.1％；对腐皮镰刀菌的抑菌圈直径最大，抑菌率可达88.7％；对表1中3中病原菌的抑制率，最低也可达77.3％。实施例4菌株pblj042发酵液制备将菌株pblj042接种于na培养基平皿中，28℃下倒置培养2天，活化菌株后，挑取菌株接种到1000mlna液体培养液中，置于温度为28℃、转速为200r/min的条件下培养2天，得到菌株pblj042发酵液。实施例5菌株pblj042发酵液对三七腐皮镰刀菌的防治效果鉴定1.三七根腐病致病菌三七腐皮镰刀菌菌液制备：在pda培养基上活化腐皮镰刀菌后，用刀片刮下菌丝体，将菌丝体加入液体pda培养基中培养(条件200r/min，28℃)7天，得到三七腐皮镰刀菌菌液。2.菌株pblj042发酵液稀释20倍后备用。3.灌根实验：实验原料：1年生三七苗；实验设：ck组，以接种无菌蒸馏水为对照，在三七苗根部接种无菌蒸馏水10ml/株，施用1次；si组，在三七苗根部接种三七腐皮镰刀菌菌液20ml/株，施用1次；di组：在三七苗根部接种三七腐皮镰刀菌菌液和菌株pblj042发酵液的混合液40ml/株，施用1次。三七腐皮镰刀菌菌液和菌株pblj042发酵液按体积比为1:1混合。每处理组重复3次，每个重复接种20株三七苗。30天后统计发病率、病情指数及防治率。4.病情指数和防效计算观察各处理中，三七苗生长情况，并按下表对病级进行分级打分。病级标准：0级：根无病；1级：病斑占根表面积的20％以下；2级：病斑占根表面积的21％～40％；3级：斑占根表面积的41％～65％，外观受严重影响；4级：病斑占根表面积的66％以上或完全腐烂。根据统计结果，按下式分别计算各对照、处理组发病率：发病率(％)＝已发病植株数量/各组中实验植株总数×100％；根据统计结果，按下式分别计算各对照、处理组病情指数：病情指数＝σ(各级病株数×该病的级数)/(调查总株数×最高病级的级数)×100％根据统计结果，按下式计算防效：防治率(％)＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数×100％，此处的处理组包括si组和di组。对照、处理组的防治率、病情指数结果列于表2中。表2菌株pblj042对三七腐皮镰刀菌的防治效果表处理组发病率病情指数防治率ck组0％--si组95.6％47.8-di组56.2％24.648.5％由表2可见，对照组由于未感染病菌，故发病率为0。si组中发病率95.6％，说明灌根病菌液对植株具有极高的染病性。di组发病率相对si组降低了50％，说明菌株pblj042对三七腐皮镰刀菌的生长具有较好的抑制作用，能防止病菌在植株内生长，降低染病几率，达到防病的效果。di组的病情指数显著低于si组，说明di组中发病植株的病级较低，说明菌株pblj042对三七腐皮镰刀菌的生长具有较好的抑制作用，能防止感染病菌的植株，病情加重。di组的防治率接近50％，说明该菌株对三七腐皮镰刀菌具有较好的治疗效果。由表2可知，该菌株在三七苗期能具有较好的防治病害作用。实施例6成株期三七防治实验取感染三七腐皮镰刀菌的成株期三七60株，均分为3组，每组20株作为一个重复。每个重复按以下步骤施用实施例4中所得发酵液。稀释发酵液20倍后，按20ml/株对各重复中植株进行灌根处理，每次处理间隔30天，每个处理中各植株灌根2次，60天后统计植株染病治愈情况。本实施例中所得效果与实施例5相似，说明该菌株对成株期三七具有相同的疗效。在本说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”、“优选实施例”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本发明概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本发明公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本发明公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。sequencelisting<110>云南大学<120>菌株及其在防治三七根腐病中的应用<130>1<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1387<212>dna<213>普城沙雷氏菌（serratiaplymuthica）<400>1tgcagtcgagcggaagcacaggagagcttgctctctgggtgacgagcggcggacgggtga60gtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaatacc120gcataacgtctacggaccaaagtgggggaccttcgggcctcacgccatcagatgtgccca180gatgggattagctagtaggtggggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtct240gagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagca300gtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaag360gccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaagggttcagtgttaatagcactgtg420cattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatac480ggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaa540gtcagatgtgaaatccccgcgcttaacgtgggaactgcatttgaaactggcaagctagag600tcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaa660taccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtgggg720agcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgatttggaggttg780tgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggc840cgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtt900taattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttccagaga960tggattggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtt1020gtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcgatt1080cggtcgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtca1140agtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgtatacaaagaga1200agcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagtacgtcgtagtccggattggagtctg1260caactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaat1320acgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggtgcaaaagaagta1380ggtagct1387当前第1页1 2 3