花青素合成酶抗原表位肽及其抗体与应用的制作方法

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种花青素合成酶抗原表位肽、融合蛋白、花青素合成酶特异性抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

特种有色作物由于其高花青素特征既富含营养又具保健功能，恰好符合大众所追求的“绿色食品”要求。因此，研究植物色素合成途径关键酶可以为植物色素积累机制提供基础生理和分子研究支持，奠定开发高花青素类型作物种质资源的基础。

植物色素生物合成需要类黄酮途径相关酶的结构基因。其中花青素合成酶(ans)是从“无色→有色”过程关键酶。ans催化无色的原花色素氧化产生有色的花青素，生成途径中第一个“有色”化合物。现今ans基因已在水稻、拟南芥、非洲菊等多种植物中克隆得到。相关研究表明，一些植物ans基因表达与花青素和黄酮醇物质积累量呈正相关，表明ans在色素生物合成中存在潜在作用。

由于蛋白质家族的成员众多，所以对植物中花色苷生物合成关键酶分析鉴定主要运用单向/双向电泳技术和液相色谱联合质谱技术。其鉴定仪器贵鉴定技术过程复杂并且繁琐，而在多克隆抗体制备过程中由于多个抗原决定簇的存在，重组蛋白的表达和纯化过程中不可避免的会掺入一些杂蛋白，制备的抗体仍有可能存在交叉反应，从而影响抗体的特异性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种花青素合成酶抗原表位肽、花青素合成酶特异性抗体及其制备方法与应用，本发明发掘了一种花青素合成酶抗原表位肽；该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原；所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本发明的花青素合成酶特异性抗体，该抗体具有很高的灵敏性和特异性。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供一种花青素合成酶抗原表位肽，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

所述的花青素合成酶抗原表位肽可直接通过公司合成得到；或通过构建含有所述氨基酸序列所对应的核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转染进宿主细胞表达得到所述的花青素合成酶抗原表位肽。

本发明的目的之二在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括所述的花青素合成酶ans抗原表位肽和任选的标签序列。

优选地，所述的标签序列为在所述的花青素合成酶抗原表位肽的c端增加的1个半胱氨酸(其氨基酸序列如seqidno：2所示)。

优选地，所述标签序列半胱氨酸cys上的巯基通过偶联剂偶联有载体蛋白。更为优选地，所述载体蛋白为钥孔戚血兰蛋白，所述偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯。

所述的融合蛋白可直接通过公司合成得到或先合成花青素合成酶抗原表位肽经改造后得到；或通过构建含有所述融合蛋白所对应的核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转染进宿主细胞表达得到所述的融合蛋白。

本发明的目的之三在于提供一种花青素合成酶特异性抗体，所述抗体特异性的结合所述的抗原表位肽或所述的融合蛋白，并且所述抗体能够特异性地结合天然的花青素合成酶蛋白和/或突变的花青素合成酶蛋白。

本发明的目的之四在于提供一种花青素合成酶特异性抗体的制备方法，将所述的抗原表位肽或所述的融合蛋白免疫动物，取血清从中分离纯化得到的多克隆抗体即为该花青素合成酶特异性抗体。

本发明的目的之五在于提供所述的花青素合成酶特异性抗体的用途，用于花青素合成酶的检测；或制备检测花青素合成酶的试剂或试剂盒。

具体地，可将所述的花青素合成酶特异性抗体用于有色作物紫薯和红米的花青素合成酶的检测。

本发明具有以下有益效果：

本发明发掘了一种花青素合成酶ans抗原表位肽；该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原；所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本发明的花青素合成酶特异性抗体，该抗体可对特种作物紫薯和有色稻中色素合成关键酶ans进行检测，该抗体具有特异性强、灵敏度高、准确性高、操作简便、结果直观和成本低廉等优点。且制备方法操作简单，具有工业化生产的可行性。

附图说明

图1为本发明花青素合成酶特异性抗体检测花青素合成酶的蛋白免疫印迹结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1候选花青素合成酶ans抗原表位的发掘和多肽抗原的合成

1、以紫薯(ipomoeabatatas(l)lam.)为研究对象，其花青素合成酶lb-ans的基因id是：fj478179，核苷酸序列如seqidno：3所示，编码的氨基酸全长序列如seqidno：4所示。分析氨基酸序列的亲水性、表露性和柔韧性等，在该蛋白的n端选出了一端氨基酸序列agnvqgygsklannasg如seqidno：1所示，该序列位于seqidno：4中的第123-139位氨基酸序列，经过blast对比数据库，确定该段多肽能代表植物花青素合成酶ans(甘薯lb-ans和水稻os-ans)抗原表位。

2、依据以上序列分析的抗原决定簇的预测结果，在花青素合成酶ans特异性抗原决定簇多肽序列的c端加上一个半胱氨酸残基(cysteineresidue，cys)，通过9-芴甲氧羰基保护α-氨基进行固相合成抗原序列(seqidno：2)，并经由琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯为偶联剂偶联一个大分子载体匙孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin，klh)形成抗原，冻干保存在-80℃。

实施例2花青素合成酶特异性抗体anti-ans的制备

免疫动物选择年龄为3个月左右、体重2kg以上的健康新西兰大白兔。对兔子进行免疫前诱导，通过四肢、腋下及背部皮下注射0.5ml弗氏完全佐剂，刺激局部免疫反应。7天后进行首次免疫，同时对首次免疫前兔子耳静脉取血作为阴性对照。首次免疫试剂为上述抗原用pbs(137mmnacl，2.7mmkcl，10mmna2hpo4，2mmkh2po4，ph7.4)稀释，取500μl的1mg·ml^-1抗原(即0.5mg)，然后加入1400μl的弗氏完全佐剂(首次免疫)或700μl弗氏不完全佐剂(第二次至第四次免疫)，并在涡旋仪上混匀和乳化。对兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射，每隔两周免疫一次。从兔子颈部动脉取血，每只兔子的取血量为50-100ml，待纯化。

通过cnbr-sepharose4b和上述多肽抗原制备亲和层析柱进行纯化抗体。将20ml血清用tbs缓冲液稀释，用混合纤维素膜(孔径为0.45μm)过滤。将过滤后溶液加入层析柱内，需连续上柱两次。用tbs清洗层析柱至洗脱液a280nm＜0.008后，用洗脱缓冲液(50mm甘氨酸，ph2.7)以相同的速度洗脱目的蛋白并收集，中和缓冲液调至ph7.3以防止抗体变性，同时加入等体积的甘油，保存在-20℃条件下，既得纯化好的特异性抗体anti-ans。经检测纯化抗体的最高浓度为2mg/ml，20ml血清共纯化出25mg抗体，表明多克隆抗体的得率高。

免疫动物血清的elisa检测：将seqidno：2所述的融合蛋白稀释至1μg/ml，每孔100μl包被96孔酶联板，4℃过夜。用tbst洗涤3次，封闭2h，将上述的血清中的纯化抗体进行梯度稀释，37℃反应1h，(同时取免疫前的血清作为阴性对照)；用tbst洗涤3次后二抗孵育；用tbst洗涤后加入tmb显色；终止反应后用酶标仪检测a450值，以p/n≥2.1的抗体最大稀释度作为效价终值。间接elisa方法检测结果为所述纯化好的特异性抗体anti-ans的效价1×10⁵。且实验组显色，阴性对照组(免疫前的血清)不显色，表明本发明的seqidno：2所述的融合蛋白作为抗原具有良好的免疫原性和抗原性。

实施例3花青素合成酶特异性抗体anti-ans的应用

分别提取水稻籽粒、紫薯块根、水稻叶片和紫薯叶片等特种作物总蛋白。以紫薯为例，取紫薯组织材料于预冷的瓷研钵中，在液氮下用研钵磨成粉末。取0.5g粉末与1ml裂解液(含7.0m尿素、4％chaps、2.0m硫脲、65mmdtt)充分混匀，16000×g离心1h后取上清为蛋白提取液。

抗体anti-ans在检测关键酶ans含量时，可采用蛋白免疫印迹方法。蛋白提取液进行sds-page电泳分离并经槽式转印系统快速转印至硝酸纤维素膜上。使用实施例2中制备的特异性抗体anti-ans，用含有0.05％tween-20的封闭液以1:2000的比例稀释后，将硝酸纤维素膜置入孵育1h。用ap标记的山羊抗兔二抗(北京康为世纪，cw0111)，将硝酸纤维素膜置入孵育1h。硝酸纤维素膜使用碱性磷酸酶缓冲液(0.1mtris–hcl，0.5mmmgcl2，0.33μg·ml^-1nbt，0.165μg·ml^-1bcip，ph9.5)中显色。

结果如图1所示，抗体在经1:2000稀释后仍能检测到水稻籽粒、紫薯块根中的花青素合成酶ans，说明制备得到的抗体效价高，亲和力强。且水稻籽粒、紫薯块根的泳道有目标条带且只有一条主带，分子量约为40kd，与目标结果一致；而水稻叶片和紫薯叶片的泳道无目标条带。表明本发明的花青素合成酶特异性抗体anti-ans具有很高的特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>花青素合成酶抗原表位肽及其抗体与应用

<160>4

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