本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于调控水稻硝酸还原酶活性的nia1磷酸化位点及其应用。
背景技术：
水稻(oryzasatival.)是我国的第一大粮食作物，约占粮食总产的40％。氮素对水稻的影响仅次于水，是构成水稻生产成本的主要部分[1]。在合理范围内，氮素施用量与作物产量呈正相关，而过量施用氮肥不仅会阻碍作物产量的提高，同时氮肥流失会引发一系列的环境问题[2,3]。目前我国水稻保持高产的直接原因是大量施入氮肥。我国水稻种植面积约占世界水稻种植面积的22％，而氮肥施用量占全球水稻氮肥施用量的37％，但稻田氮肥吸收利用率仅为30～35％，存在严重的氮肥资源浪费[4,5]。因此，在降低氮素施用同时稳定产量的基础上，提高水稻对氮素的吸收利用效率就成为关键因素。
硝酸还原酶(nitratereductase,nr)是高等植物氮素同化的限速酶，可直接调节硝酸盐的还原。磷酸化是真核生物nr化学修饰的主要形式，磷酸化与去磷酸化为真核生物的氮代谢提供了调节机制。利用遗传转化研究烟草的nr活性调控，将nia基因编码区融合组成性表达启动子，能够解除nr转录水平上的控制；通过定向突变磷酸化位点ser521残基为天冬氨酸残基(asp，d)，可解除nr丝氨酸残基磷酸化/去磷酸化翻译后修饰[6]；解除转录水平控制对氮代谢没有太大的影响，而翻译后修饰的解除对氮代谢水平有深刻的影响，表现在野生型nr由光向暗迅速失活，而磷酸化位点定向突变的nr(s521d)呈现组成型活性[7]。目前，水稻硝酸还原酶nia1活性的磷酸化调控及其对水稻生长发育的影响未见报道。
上述涉及的参考文献如下：
[1]vlekp,byrnesbh.theefficiencyandlossoffertilizerninlowlandrice[j].fertilizerresearch,1986(9):131-147；
[2]李世娟,李建民.氮肥损失研究进展[j].农业环境保护,2001,5(20):377-379；
[3]wangdj,liuq,linjh,etal.optimumnitrogenuseandreducednitrogenlossforproductionofriceandwheatintheyangtsedeltaregion[j].environmentalgeochemistryandhealth,2004,26(2):221-227；
[4]彭少兵,黄见良,钟旭华,等.提高中国稻田氮肥利用率的研究策略[j].中国农业科学,2002(9):1095-1103；
[5]liyl,zhangyl,huj,etal.contributionofnitrificationhappenedinrhizosphericsoilgrowingwithdifferentricecultivarstonnutrition[j].biologyandfertilityofsoils,2007,43(4):417-425；
[6]leaus,leydeckerm,quilleréi,etal.posttranslationalregulationofnitratereductasestronglyaffectsthelevelsoffreeaminoacidsandnitrate,whereastranscriptionalregulationhasonlyminorinfluence[j].plantphysiology,2006,140(3):1085-1094；
[7]lilloc,leaus,leydeckerm,etal.mutationoftheregulatoryphosphorylationsiteoftobacconitratereductaseresultsinconstitutiveactivationoftheenzymeinvivoandnitriteaccumulation[j].theplantjournal,2003,35(5):566-573。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题在于提供一种用于调控水稻硝酸还原酶活性的nia1磷酸化位点及其应用，以解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
用于调控水稻硝酸还原酶活性的nia1磷酸化位点是位于nia1氨基酸序列532位的丝氨酸残基，丝氨酸残基位于nia1氨基酸序列的保守基序上，具体基因序列seqidno.1:rststpfm。
将用于调控水稻硝酸还原酶活性的nia1磷酸化位点应用在水稻定向突变株系上，具体步骤如下：
1)总rna提取
选用水稻品种kitaake作为rna的提取材料，待水稻幼苗生长至约20d，取叶片液氮冻存；而后取部分液氮冻存叶片，用研钵研碎，按照rnapreppure植物总rna提取试剂盒说明提取水稻叶片总rna，再利用nanodropnd2000超微量核酸蛋白分析仪对其浓度和质量进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；
2)水稻基因osnia1的克隆
根据水稻osnia1的全长序列设计两端引物，以步骤1)获得的水稻叶片总rna转录合成的cdna第一链为模版，采用高保真kodfx酶进行pcr扩增，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，将目的基因与pcubi1390-gfp过表达载体进行连接获得表达载体pcubi1390-gfp-osnia1，测序获得水稻基因osnia1的cdna序列；
3)水稻基因osnia1表达载体构建
根据步骤2)获得水稻基因osnia1的cdna序列，利用primer5.0软件分别以osnia1基因的cdna起始密码子atg为f引物起始碱基和基因末端去掉终止密码子开始碱基，即以gaa为r引物的起始碱基设计osnia1基因扩增引物，最后加上pcubi1390-gfp载体接头，即为扩增水稻基因osnia1基因全长引物p1:seqidno.2和p2:seqidno.3；
seqidno.2:5-tctgcactaggtacctgcagatggctgcttccgtgc-3；
seqidno.3：5-atggatccgtcgacctgcaggaacacgatgaaagaattggcc-3；
以步骤2)中获得的表达载体pcubi1390-gfp-osnia1为模版，经pcr扩增后，将osnia1的cdna克隆至载体双元表达载体pcubi1390-gfp中，测序鉴定确保双元表达载体pcubi1390-gfp中编码区阅读框架正确，得水稻基因osnia1过表达载体；
4)水稻硝酸还原酶nia1磷酸化位点s532的预测和鉴定
利用netphos3.1server在线软件预测水稻nia1蛋白上可发生磷酸化作用的氨基酸残基，再将水稻nia1蛋白的氨基酸序列与拟南芥、烟草、棉花、马铃薯和玉米进行比对分析后，推测水稻硝酸还原酶nia1磷酸化位点为第532位的丝氨酸残基，其所处的保守基序序列为seqidno.1；最后利用nr抗体与磷酸化抗体对该位点的磷酸化情况进行检测，得出水稻硝酸还原酶nia1磷酸化位点是位于nia1氨基酸序列532位的丝氨酸残基；
seqidno.1:rststpfm；
5)定向突变目的基因的克隆
在osnia1基因序列中找到磷酸化位点s532的基因序列，根据天冬氨酸和丙氨酸的氨基酸序列进行定向突变，在突变位点前后各加上15个碱基，作为突变天冬氨酸和丙氨酸的正向引物p3:seqidno.4和p4:seqidno.5，其反向互补序列为反向突变引物p5:seqidno.6和p6:seqidno.7；
seqidno.4：5-ctgaagcggagcacggacacgccgttcatgaac-3；
seqidno.5：5-ctgaagcggagcacggcgacgccgttcatga-3；
seqidno.6：5-gttcatgaacggcgtgtccgtgctccgcttcag-3；
seqidno.7：5-tcatgaacggcgtcgccgtgctccgcttcag-3；
以osnia1基因测序正确的质粒pcubi1390-gfp-osnia1为模版，分别以全长引物p1和反向突变引物、正向突变引物及全长引物p2进行pcr扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得突变位点的前段和后段，而后以突变位点的前段和后段等量混合物为模版，以全长引物p1、p2进行pcr扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得已定向突变的目的基因；
6)水稻nia1磷酸化位点定向突变载体构建
将步骤5)中获得的定向突变目的基因克隆至载体双元表达载体pcubi1390-gfp中，测序鉴定确保双元表达载体pcubi1390-gfp中编码区阅读框架正确，得水稻nia1磷酸化位点定向突变载体；
7)转基因植株的获得
将步骤3)获得的水稻基因osnia1过表达载体和步骤6)获得的水稻nia1磷酸化位点定向突变载体分别转入农杆菌，进一步转入粳稻品种kitaake中，转基因植株经pcr和rt-pcr验证获得纯合osnia1过表达株系和nia1磷酸化位点定向突变的过表达株系，对其进行氮素利用效率和抗性评价。
有益效果：本发明在nia1磷酸化位点构建定向突变的目的基因表达载体，再将含该基因的重组表达载体转化目标植物，最后经pcr和rt-pcr验证后进行水稻的氮素利用效率和抗性评价，最终获得具有高氮素利用效率和高抗逆特性的转基因阳性植物，经检验，nia1磷酸化位点定向突变株系在低温和低氮情况下长势优于osnia1过表达株系，其nr活性和氮素利用效率也高于osnia1过表达株系，nia1磷酸化位点的定向突变能够能够提高水稻的氮素利用效率，有效增强水稻对低温和氮饥饿的耐受能力。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
将用于调控水稻硝酸还原酶活性的nia1磷酸化位点应用在水稻定向突变株系上，具体步骤如下：
1)总rna提取
选用水稻品种kitaake作为rna的提取材料，待水稻幼苗生长至约20d，取叶片液氮冻存；而后取部分液氮冻存叶片，用研钵研碎，按照rnapreppure植物总rna提取试剂盒说明提取水稻叶片总rna，再利用nanodropnd2000超微量核酸蛋白分析仪对其浓度和质量进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；
2)水稻基因osnia1的克隆
根据水稻osnia1的全长序列设计两端引物，以步骤1)获得的水稻叶片总rna转录合成的cdna第一链为模版，采用高保真kodfx酶进行pcr扩增，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，将目的基因与pcubi1390-gfp过表达载体进行连接获得，测序获得水稻基因osnia1的cdna序列；
3)水稻基因osnia1表达载体构建
根据步骤2)获得水稻基因osnia1的cdna序列，利用primer5.0软件分别以osnia1基因的cdna起始密码子atg为f引物起始碱基和基因末端去掉终止密码子开始碱基，即以gaa为r引物的起始碱基设计osnia1基因扩增引物，最后加上pcubi1390-gfp载体接头，即为扩增水稻基因osnia1基因全长引物p1:seqidno.2和p2:seqidno.3；
seqidno.2:5-tctgcactaggtacctgcagatggctgcttccgtgc-3；
seqidno.3：
5-atggatccgtcgacctgcaggaacacgatgaaagaattggcc-3；
以步骤2)中获得的表达载体pcubi1390-gfp-osnia1为模版，经pcr扩增后，将osnia1的cdna克隆至载体双元表达载体pcubi1390-gfp中handiii和bamhi酶切位点，测序鉴定确保表达载体pcubi1390-gfp-osnia1中编码区阅读框架正确，得水稻基因osnia1过表达载体；
4)水稻硝酸还原酶nia1磷酸化位点s532的预测和鉴定
利用netphos3.1server在线软件预测水稻nia1蛋白上可发生磷酸化作用的氨基酸残基，再将水稻nia1蛋白的氨基酸序列与拟南芥、烟草、棉花、马铃薯和玉米进行比对分析后，推测水稻硝酸还原酶nia1磷酸化位点为第532位的丝氨酸残基，其所处的保守基序序列为seqidno.1；最后利用nr抗体与磷酸化抗体对该位点的磷酸化情况进行检测，得出水稻硝酸还原酶nia1磷酸化位点是位于nia1氨基酸序列532位的丝氨酸残基；
seqidno.1:rststpfm；
5)定向突变目的基因的克隆
在osnia1基因序列中找到磷酸化位点s532的基因序列，根据天冬氨酸和丙氨酸的氨基酸序列进行定向突变，在突变位点前后各加上15个碱基，作为突变天冬氨酸和丙氨酸的正向引物p3:seqidno.4和p4:seqidno.5，其反向互补序列为反向突变引物p5:seqidno.6和p6:seqidno.7；
seqidno.4：5-ctgaagcggagcacggacacgccgttcatgaac-3；
seqidno.5：5-ctgaagcggagcacggcgacgccgttcatga-3；
seqidno.6：5-gttcatgaacggcgtgtccgtgctccgcttcag-3；
seqidno.7：5-tcatgaacggcgtcgccgtgctccgcttcag-3；
以osnia1基因测序正确的质粒pcubi1390-gfp-osnia1为模版，分别以全长引物p1和反向突变引物、正向突变引物及全长引物p2进行pcr扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得突变位点的前段和后段，而后以突变位点的前段和后段等量混合物为模版，以全长引物p1、p2进行pcr扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得已定向突变的目的基因，即天冬氨酸基因序列osnia1s532-d和丙氨酸基因序列osnia1s532-a；
6)水稻nia1磷酸化位点定向突变载体构建
将步骤5)获得的定向突变目的基因(天冬氨酸基因序列osnia1s532-d和丙氨酸基因序列osnia1s532-a)克隆至载体双元表达载体pcubi1390-gfp中handiii和bamhi酶切位点，测序鉴定确保双元表达载体pcubi1390-gfp中编码区阅读框架正确，得水稻nia1磷酸化位点定向突变载体；
7)转基因植株的获得
将步骤3)获得的水稻基因osnia1过表达载体和步骤6)获得的水稻nia1磷酸化位点定向突变载体分别转入农杆菌，进一步转入粳稻品种kitaake中，转基因植株经pcr和rt-pcr验证获得纯合osnia1过表达株系和nia1磷酸化位点定向突变的过表达株系，经检验，nia1磷酸化位点定向突变株系在低温和低氮情况下长势优于osnia1过表达株系，其nr活性和氮素利用效率也高于osnia1过表达株系，nia1磷酸化位点的定向突变能够能够提高水稻的氮素利用效率，有效增强水稻对低温和氮饥饿的耐受能力。