本发明涉生物工程技术领域，尤其涉及一种提高甾药生产菌株活力的甾药前体发酵生产方法。
背景技术：
甾体类药物在化药工业中地位突出,是仅次于抗生素的第二大类药物。甾体类药物对机体起着重要的调节作用,包括改善蛋白质代谢、恢复和增强体力、利尿降压等；河治疗风湿性关节炎、湿疹等皮肤病及前列腺、爱迪森式等内分泌疾病；可用于避孕、安胎及手术麻醉等领域。目前全球生产的甾体类药物已超过300种，其中主要的是甾体激素药物。2016年全球甾体激素药物销售额超过1000亿美金,是仅次于抗生素的第二大类化学药。目前,我国已经把甾体激素药物新资源开发作为医药行业近期发展的方向和重点之一，而激素类原料药和中间体的出口已成为我国原料药走向世界的重要品种。
已知植物甾醇可被许多微生物分解代谢为一系列甾药前体。其中，4-雄甾烯-3,17-二酮(ad)和1,4-雄甾烯-3,17-二酮(add)是合成类固醇药物如孕激素，避孕药和雌激素的主要前体。据报道，快速生长的土壤分枝杆菌具有较强的降解植物甾醇侧链积累ad和add的能力。作为化学合成的替代，生物转化已成为制药工业中生产甾药前体的主要生产方法。但无论是原始菌株还是工程菌株均具有较长的转化周期(≥5天)，且在转化中后期(3天之后)菌株的活力明显下降，并伴随转化效率的急剧降低。这也是造成甾药前体生产成本高昂的原因之一。
技术实现要素：
本发明提出了一种提高甾药生产菌株活力的甾药前体发酵生产方法及其制备工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种提高甾药生产菌株活力的甾药前体发酵生产方法，其特征在于，步骤为：
(1)称取适量的大米放入筛中用蒸馏水冲洗干净，并沥干，随后倒入专用的盛放盆中；
(2)向步骤1中的成放盆中添加营养液并进行搅拌来调节ph值，营养液和大米的质量比为1：3，搅拌时间控制在10-20min,获得第一混合物；
(3)对步骤2中的第一混合物进行分装，将第一混合物分别装入若干个摇瓶中；
(4)步骤3中分装完成的摇瓶放入灭菌装置中进行灭菌；
(5)将步骤4中灭菌完成后的摇瓶取出，然后将每个摇瓶中加入适量的孢子悬液，随后将所有的摇瓶放入摇床中进行培养，培养温度控制在25-28℃，摇床的震荡速度控制在90-120rpm，培养时间控制在20-37h；
(6)将步骤5中摇瓶内培养完成的孢子取出后，进行真空干燥，随后将菌种利用砂土管法进行保存，保存环境的温度控制在0-4℃；
(7)将步骤6中保存的菌种取出后，按照5-10％的接种量将菌种接种到装有培养基的1000l种子发酵罐，ph值控制在6.3-6.7，当ph高于最适ph时，通过添加适量硫酸铵降低ph，当ph低于最适ph时，通过补加氨水升高ph值，培养时间控制在20-25h，温度控制在29-32℃；
(8)按照20-30％的接种量将1000l种子发酵罐的菌种接种到装有培养基的8000l种子发酵罐，ph值控制在6.8-7.3，当ph高于最适ph时，通过添加适量硫酸铵降低ph，当ph低于最适ph时，通过补加氨水升高ph值，在0-45h内维持温度在25℃，然后恒速降温至20℃，并维持175h，最后20h内回复到25℃进行培养。
优选的，步骤1中的米选用优品质新米。
优选的，步骤3中的摇瓶选用容量为250ml的摇瓶，其中每个摇瓶中的第一混合物的体积与摇瓶容量的百分比为16-20％。
优选的，步骤4中的灭菌方式为辐照灭菌。
优选的，步骤7中1000l发酵罐培养基配方为：麦芽糖130-140g/l、硝酸盐2.8-3.2g/l、磷酸盐3.1-4.0g/l等。
优选的，步骤8中其中8000l发酵罐培养基配方为：麦芽糖130-140g/l、硝酸盐2.8-3.2g/l、磷酸盐1.0-1.2g/l等。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)通过控制步骤7和步骤8中磷酸盐的含量，在菌体的生长期适当的提高磷酸盐的浓度，在菌体生产期中适当的减少磷酸盐的浓度，可以起促进初级代谢、抑制次级代谢，阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成，抑制次级代谢产物合成中某些关键酶的活性，增加菌体能荷的同时促进初级代谢，从而提高菌体的活性，提高菌体的生产效率；
(2)通过在步骤8中采用变温培养的方式对处于生产期的菌体进行培养，可以使得环境温度能够适应处于菌体生产期不同阶段的需要，进而提高菌体的活性，提高菌体的生产效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种提高甾药生产菌株活力的甾药前体发酵生产方法，其特征在于，步骤为：
(1)称取适量的大米放入筛中用蒸馏水冲洗干净，并沥干，随后倒入专用的盛放盆中，米选用优品质新米；
(2)向步骤1中的成放盆中添加营养液并进行搅拌来调节ph值，营养液和大米的质量比为1：3，搅拌时间控制在10min,获得第一混合物；
(3)对步骤2中的第一混合物进行分装，将第一混合物分别装入若干个摇瓶中，摇瓶选用容量为250ml的摇瓶，其中每个摇瓶中的第一混合物的体积与摇瓶容量的百分比为16％；
(4)步骤3中分装完成的摇瓶放入灭菌装置中进行灭菌，灭菌方式为辐照灭菌；
(5)将步骤4中灭菌完成后的摇瓶取出，然后将每个摇瓶中加入适量的孢子悬液，随后将所有的摇瓶放入摇床中进行培养，培养温度控制在25℃，摇床的震荡速度控制在90rpm，培养时间控制在20h；
(6)将步骤5中摇瓶内培养完成的孢子取出后，进行真空干燥，随后将菌种利用砂土管法进行保存，保存环境的温度控制在0℃；
(7)将步骤6中保存的菌种取出后，按照5％的接种量将菌种接种到装有培养基的1000l种子发酵罐，1000l发酵罐培养基配方为：麦芽糖130g/l、硝酸盐2.8g/l、磷酸盐3.1g/l等。
ph值控制在6.3，当ph高于最适ph时，通过添加适量硫酸铵降低ph，当ph低于最适ph时，通过补加氨水升高ph值，培养时间控制在20h，温度控制在29℃；
(8)按照20％的接种量将1000l种子发酵罐的菌种接种到装有培养基的8000l种子发酵罐，8000l发酵罐培养基配方为：麦芽糖130g/l、硝酸盐2.8g/l、磷酸盐1.0g/l等。
(9)ph值控制在6.8，当ph高于最适ph时，通过添加适量硫酸铵降低ph，当ph低于最适ph时，通过补加氨水升高ph值，在0-45h内维持温度在25℃，然后恒速降温至20℃，并维持175h，最后20h内回复到25℃进行培养。
实施例2
本发明提出了一种提高甾药生产菌株活力的甾药前体发酵生产方法，其特征在于，步骤为：
(1)称取适量的大米放入筛中用蒸馏水冲洗干净，并沥干，随后倒入专用的盛放盆中，米选用优品质新米；
(2)向步骤1中的成放盆中添加营养液并进行搅拌来调节ph值，营养液和大米的质量比为1：3，搅拌时间控制在15min,获得第一混合物；
(3)对步骤2中的第一混合物进行分装，将第一混合物分别装入若干个摇瓶中，摇瓶选用容量为250ml的摇瓶，其中每个摇瓶中的第一混合物的体积与摇瓶容量的百分比为18％；
(4)步骤3中分装完成的摇瓶放入灭菌装置中进行灭菌，灭菌方式为辐照灭菌；
(5)将步骤4中灭菌完成后的摇瓶取出，然后将每个摇瓶中加入适量的孢子悬液，随后将所有的摇瓶放入摇床中进行培养，培养温度控制在25.5℃，摇床的震荡速度控制在105rpm，培养时间控制在30h；
(6)将步骤5中摇瓶内培养完成的孢子取出后，进行真空干燥，随后将菌种利用砂土管法进行保存，保存环境的温度控制在2℃；
(7)将步骤6中保存的菌种取出后，按照7％的接种量将菌种接种到装有培养基的1000l种子发酵罐，1000l发酵罐培养基配方为：麦芽糖135g/l、硝酸盐3.0g/l、磷酸盐3.5g/l等。
ph值控制在6.5，当ph高于最适ph时，通过添加适量硫酸铵降低ph，当ph低于最适ph时，通过补加氨水升高ph值，培养时间控制在,22h，温度控制在30℃；
(10)按照25％的接种量将1000l种子发酵罐的菌种接种到装有培养基的8000l种子发酵罐，8000l发酵罐培养基配方为：麦芽糖135g/l、硝酸盐3.0g/l、磷酸1.1g/l等。
ph值控制在6.5，当ph高于最适ph时，通过添加适量硫酸铵降低ph，当ph低于最适ph时，通过补加氨水升高ph值，在0-45h内维持温度在25℃，然后恒速降温至20℃，并维持175h，最后20h内回复到25℃进行培养
实施例3
本发明提出了一种提高甾药生产菌株活力的甾药前体发酵生产方法，其特征在于，步骤为：
(1)称取适量的大米放入筛中用蒸馏水冲洗干净，并沥干，随后倒入专用的盛放盆中，米选用优品质新米；
(2)向步骤1中的成放盆中添加营养液并进行搅拌来调节ph值，营养液和大米的质量比为1：3，搅拌时间控制在20min,获得第一混合物；
(3)对步骤2中的第一混合物进行分装，将第一混合物分别装入若干个摇瓶中，摇瓶选用容量为250ml的摇瓶，其中每个摇瓶中的第一混合物的体积与摇瓶容量的百分比为20％；
(4)步骤3中分装完成的摇瓶放入灭菌装置中进行灭菌，灭菌方式为辐照灭菌；
(5)将步骤4中灭菌完成后的摇瓶取出，然后将每个摇瓶中加入适量的孢子悬液，随后将所有的摇瓶放入摇床中进行培养，培养温度控制在28℃，摇床的震荡速度控制在120rpm，培养时间控制在37h；
(6)将步骤5中摇瓶内培养完成的孢子取出后，进行真空干燥，随后将菌种利用砂土管法进行保存，保存环境的温度控制在4℃；
(7)将步骤6中保存的菌种取出后，按照10％的接种量将菌种接种到装有培养基的1000l种子发酵罐，1000l发酵罐培养基配方为：麦芽糖140g/l、硝酸盐3.2g/l、磷酸盐4.0g/l等。
ph值控制在6.7，当ph高于最适ph时，通过添加适量硫酸铵降低ph，当ph低于最适ph时，通过补加氨水升高ph值，培养时间控制在25h，温度控制在32℃；
(8)按照30％的接种量将1000l种子发酵罐的菌种接种到装有培养基的8000l种子发酵罐，8000l发酵罐培养基配方为：麦芽糖140g/l、硝酸盐3.2g/l、磷酸盐1.2g/l等。
ph值控制在7.3，当ph高于最适ph时，通过添加适量硫酸铵降低ph，当ph低于最适ph时，通过补加氨水升高ph值，在0-45h内维持温度在25℃，然后恒速降温至20℃，并维持175h，最后20h内回复到25℃进行培养。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。