基于SSR标记的‘惠’自花结实性后代的高效选育试剂盒的制作方法

本发明涉及生物育种技术领域，具体涉及一种位于苹果12号染色体上与‘惠’苹果自花结实性状相关的ssr分子标记的开发及其应用。

背景技术：

苹果是我国的第一大水果，具有极高的营养价值，且深受消费者喜爱，但由于苹果自交不亲和性的存在，在实际生产过程中需要配置与主栽品种s基因不同的品种作为授粉品种，并在花期通过访花昆虫授粉或人工授粉才可以保证产量，这样不但增加了生产成本，也增加了管理难度。而培育具有自花结实能力的苹果品种是实现果树轻简化栽培的有效手段之一，现在生产上常见的自花结实苹果品种较少，仅有‘寒富’，‘惠’，‘cau-1’等。以这些品种为基础开发合适的与自花结实性相关的分子标记是提高自花结实性育种效率的有效手段。

ssr标记为第二代分子标记，具有多态性高、信息含量丰富、共显性遗传等优点，被广泛应用于植物的种质鉴定、遗传结构分析、遗传连锁图谱构建、qtl定位等方面。有关苹果ssr相关的研究工作已有开展，但目前尚未见运用ssr标记对苹果自花结实性状进行关联分析的研究。

基于dna测序仪的ssr荧光标记毛细管电泳检测方法可以快速得到定量的dna片段分析数据，从而开发与‘惠’自花结实性有关的ssr标记并在育种中应用。

技术实现要素：

为高效选育自花结实性苹果种质，本发明的目的在于提供一种‘惠’后代自花结实性的ssr分子标记引物。

本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种快速筛选自花结实性苹果品种的方法。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种‘惠’后代自花结实性的ssr分子标记引物，所述ssr分子标记为ch04d02，所对应的ssr分子标记的引物为：

ch04d02f:cgtacgctgcttcttttgct，如seqidno:1所示；

ch04d02r:ctatccaccacccgtcaact，如seqidno:2所示。

所述‘惠’后代自花结实性的ssr分子标记引物在筛选自花结实性苹果品种中的应用。

本发明还提供一种试剂盒，包括所述‘惠’后代自花结实性的ssr分子标记引物。

本发明还提供利用上述ssr分子标记引物快速筛选自花结实性苹果品种的方法，包含如下步骤：

1)提取待检测苹果叶片的dna，

2)以dna为模板，使用用于鉴定‘惠’后代自花结实性的ssr分子标记引物进行pcr扩增，

3)荧光标记毛细管电泳检测，

4)数据分析

用prosize2.0软件生成位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个ssr位点的基因型；分析基因分型与自花结实性的关系。

在上述方案的基础上，若ssr位点的基因型表现为114bp：126bp基因型，‘惠’后代自花结实率高。

附图说明

本发明有如下附图：

图1‘惠’自交后代ch04d02基因分型结果。

具体实施方式

以下结合附图1对本发明作进一步详细说明。

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecularcloning:alaboratorymanual，3nded.(sambrook,2001)currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel，2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：‘惠’自交后代自花结实性ssr位点分析

1.提取‘惠’自交后代基因组dna

1)取约0.1g的苹果叶片用液氮研磨成粉状，然后加入700μl的dna提取缓冲液，65℃水浴30min。或用剪刀剪取适量的组织样品于2ml离心管中，在离心管中加入一颗钢珠，然后再加入预热好的700μl的dna提取缓冲液。经过组织破碎仪剧烈震荡(25hz，1min)后，最终使叶片成粉末状。然后放入到65℃水浴锅中水浴30min，期间拿出样品震荡两到三次，使样品充分与提取缓冲液接触。

2)加700μl的氯仿：异戊醇(24:1)，并混匀，充分萃取其中的一些杂质，然后再室温下静置5min。

3)12000rpm离心5min，将含有dna上清液转移到新的尖底离心管中。加1倍体积预冷的异丙醇或2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，于-20℃放置20-30min。此时离心管中出现白色絮状物。

4)12000rpm离心8min，将dna沉淀，并弃上清液，同时用75％的乙醇洗涤dna沉淀两次。

5)将dna晾干或在抽真空仪中抽干，并溶于100μlddh2o中，震荡后于4℃保存备用。

2.pcr反应体系及反应程序

pcr反应采用10μl反应体系，内含40ng左右的模板dna、

1×pcrbuffer、0.2μm的引物对

(ch04d02f:cgtacgctgcttcttttgct；

ch04d02r:ctatccaccacccgtcaact)、0.1mmdntp以及0.1u/μl的dna聚合酶。其中不同酶具有不同的反应体系，具体见酶的使用说明书。

pcr基本扩增程序一般为预变性94℃、5min左右，然后进入循环过程，分别变性94℃、退火55℃、延伸72℃各30s，循环数30-35，最后再延伸10min即可。其中退火温度跟引物有关，而延伸的时间跟扩增的产物长度有关，一般为1kb/min。不同的酶也具有不同的pcr扩增程序，请参照其使用说明书。

3.荧光标记毛细管电泳荧光检测

吸取32ul1×tebuffer，加入1μlpcr产物，瞬离混匀，于abi3730xldna分析仪上进行毛细管电泳。

4.数据分析

用prosize2.0软件生成位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型，分析基因分型与自花结实性的关系。ssr位点ch04d02在82％的亲和后代中表现为114bp：126bp基因型，表明该标记可在自交后代中作为优先选择自花结实性种质的标记。相较常规杂交育种，可将育种提高1-2倍。

实施例2：‘惠’ב长富2’杂交后代自花结实性ssr位点分析

1.提取‘惠’ב长富2’杂交后代基因组dna

1)取约0.1g的苹果叶片用液氮研磨成粉状，然后加入700μl的dna提取缓冲液，65℃水浴30min。或用剪刀剪取适量的组织样品于2ml离心管中，在离心管中加入一颗钢珠，然后再加入预热好的700μl的dna提取缓冲液。经过组织破碎仪剧烈震荡(25hz，1min)后，最终使叶片成粉末状。然后放入到65℃水浴锅中水浴30min，期间拿出样品震荡两到三次，使样品充分与提取缓冲液接触。

2)加700μl的氯仿：异戊醇(24:1)，并混匀，充分萃取其中的一些杂质，然后再室温下静置5min。

3)12000rpm离心5min，将含有dna上清液转移到新的尖底离心管中。加1倍体积预冷的异丙醇或2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，于-20℃放置20-30min。此时离心管中出现白色絮状物。

4)12000rpm离心8min，将dna沉淀，并弃上清液，同时用75％的乙醇洗涤dna沉淀两次。

5)将dna晾干或在抽真空仪中抽干，并溶于100μlddh2o中，震荡后于4℃保存备用。

2.pcr反应体系及反应程序

pcr反应采用10μl反应体系，内含40ng左右的模板dna、

1×pcrbuffer、0.2μm的引物对

(ch04d02f:cgtacgctgcttcttttgct；

ch04d02r:ctatccaccacccgtcaact)、0.1mmdntp以及0.1u/μl的dna聚合酶。其中不同酶具有不同的反应体系，具体见酶的使用说明书。

pcr基本扩增程序一般为预变性94℃5min左右，然后进入循环过程，分别变性94℃、退火55℃、延伸72℃各30s，循环数30-35，最后再延伸10min即可。其中退火温度跟引物有关，而延伸的时间跟扩增的产物长度有关，一般为1kb/min。不同的酶也具有不同的pcr扩增程序，请参照其使用说明书。

3.毛细管电泳荧光检测

吸取32ul1×tebuffer，加入1μlpcr产物,瞬离混匀，于abi3730xldna分析仪上进行毛细管电泳。

4.数据分析

用prosize2.0软件生成位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型，分析基因分型与自花结实性的关系。ssr位点ch04d02在77％的亲和后代中表现为114bp：126bp基因型，表明该标记可在以惠为母本的杂交后代中作为优先选择自花结实性种质的标记。相较常规杂交育种，可将育种提高1-2倍。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

<110>中国农业大学

<120>基于ssr标记的'惠'自花结实性后代的高效选育试剂盒

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgtacgctgcttcttttgct20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctatccaccacccgtcaact20