一株可高温发酵生产DHA的菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一株可高温发酵生产dha的菌株及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，dha)，是一种重要的ω-3长链多不饱和脂肪酸，俗称“脑黄金”，是备受瞩目的功能性油脂之一。dha主要存在于人体大脑的神经元表层，对细胞突出的再生有着极为重要的作用。研究表明，dha能够促进神经系统发育，有效抑制老年痴呆的发病机率，减少动脉硬化和血栓形成的机率，并有抑癌抗炎提高水产存活率等生理功能。

dha的主要来源有深海鱼油与产油微生物，由于微生物发酵生产油脂具有不受季节气候影响等优点，故微生物发酵产dha得到了广泛的应用。在全世界范围内，商业化微生物发酵生产dha的菌株主要由有寇氏隐甲藻、破囊壶菌和裂殖壶菌三种。其中裂殖壶菌的油脂含量高可达到细胞干重的50％，dha占总脂肪酸的含量更高达40％～60％。此外，该菌株还具有易培养、生长速度快，发酵周期短等优点，是目前工业化生产中最理想的dha菌株。

但现有方法中，裂殖壶菌发酵产dha的适宜温度一般为25-30度，发酵温度超过30℃，裂殖壶菌会受到生长抑制，dha产量明显降低，且其发酵生产成本高，市场价格昂贵，因此利用微生物生产的dha油脂商业化应用范围仍受到限制。中国专利cn104974944a公开了一种产dha的裂殖壶菌基因工程菌及其构建方法和应用，通过基因工程的手段进行菌株改造，获得的裂殖壶菌在20～30℃条件下生长；中国专利cn102888348a公开了一种裂殖壶菌及利用其高密度发酵生产dha油脂的方法，当温度在25～28℃时，裂殖壶菌的生长量最大，但当温度高于30℃时，裂殖壶菌的生物量和油脂含量均迅速下降，且油脂中dha含量低。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株可高温发酵生产dha的菌株，该菌株可实现在高温环境下高产dha。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株可高温发酵生产dha的菌株，分类命名为裂殖壶菌(schizochytriumsp.)ale-ht，保藏编号为gdmccno：60885。

本发明的另一目的在于提供上述菌株在发酵生产dha中的应用。

本发明提供了一种具体的应用方式，包括：将所述菌株进行种子培养和发酵培养，获取产物。

进一步的，发酵培养的温度为30～35℃。

进一步的，所述种子培养的方式为：将菌株以1％接种量接种至种子培养基活化培养，进行三代活化。每代种子活化的时间为24～48h。

进一步的，种子培养的培养基成分为：葡萄糖30～60g/l，酵母粉3～5g/l，mgso4·7h2o4～6g/l，na2so43～5g/l、(nh4)2so44～6g/l，kh2po42～4g/l，kcl1～2g/l，谷氨酸钠18～20g/l。

进一步的，发酵培养的培养基成分为：葡萄糖80～100g/l，酵母粉4～6g/l，mgso4·7h2o3～5g/l，na2so46～9g/l、(nh4)2so42～4g/l，kh2po42～4g/l，kcl0.1～0.5g/l，nacl5～8g/l，谷氨酸钠18～20g/l。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明的菌株具有在高温下快速生长、快速积累dha的能力，驯化后的菌株在高温环境下进行补料发酵，生物量、油脂含量、dha产量分别是原始菌株的1.88、2.73、2.59倍，表明驯化菌株在高温培养条件下，展现了更佳的生长能力和油脂积累能力。

(2)本发明获取的经连续高温驯化后的裂殖壶菌，菌种的生长速度大幅度提升。在正常温度下进行分批发酵，细胞生长速度提高了75.43％，在高温条件下发酵周期缩短25h，细胞生长速度是原始菌株的2.10倍。同时，该菌株的β-胡萝卜素产率提高了57.75％。

(3)在工厂生产中，7-8月份一般都是停产状态，不能生产，温度很难控制在30度，此外高温条件下进行生产，需要大量的冷却手段，能耗高，采用本发明的菌株进行发酵生产可大量降低能耗，降低发酵成本，适合工业化生产。

附图说明

图1是原始菌株和驯化菌株发酵性能对比；图中a：原始菌株；b：驯化菌株。

本发明所述的生物材料，其分类命名为裂殖壶菌(schizochytriumsp.)ale-ht，已于2019年10月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60885，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

具体实施方式

实施例涉及的原始菌株为schizochytriumsp.hx-308，由实验室自主筛选获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：m209059。

实施例1

本实施例具体说明本发明菌株的筛选方法。

(1)在30℃下对原始裂殖壶菌菌种进行活化；将原始菌株活化3代，每代时间为24-48小时。

(2)将经过活化的种子以1％(v/v)的接种量接入种子培养基中，培养温度为32℃、34℃、34.5℃和35℃，可根据菌种的生长情况进行升温驯化，例如菌种在32℃生长良好时，下一代驯化温度可设置为34℃，以此类推，转速170rpm，摇床培养至菌株对数生长期转接下一代；

种子培养基成分为：葡萄糖30～60g/l，酵母粉3～5g/l，mgso4·7h2o4～6g/l，na2so43～5g/l、(nh4)2so44～6g/l，kh2po42～4g/l。

(3)待步骤(2)中的菌种培养至对数生长期，即完成第一代驯化，对种子液进行转接，温度设置与步骤(2)中相同，此即为第二代驯化，以此类推，进行十代驯化；

(4)在驯化温度为35℃时，每第十代驯化菌进行单菌落平板划线分离，挑选生长占优势的单菌落进行种子性能测试；进行后续升温传代培养，直至获得在35℃下生长性能稳定的菌株，保藏最终获得的35℃驯化菌株。

实施例2

本实施例具体说明本发明利用裂殖壶菌发酵产dha的方法。

(1)种子培养

种子培养基成分为：葡萄糖30～60g/l，酵母粉3～5g/l，mgso4·7h2o4～6g/l，na2so43～5g/l、(nh4)2so44～6g/l，kh2po42～4g/l，kcl1～2g/l，谷氨酸钠18～20g/l。

将菌种以1％接种量接入种子培养基，培养时间为24-48小时，转速为170转/min，即完成第一代活化，用相同的方法进行第二代种子活化，以此活化三代，获得种子。

(2)发酵培养

发酵培养基成分为：葡萄糖80～100g/l，酵母粉4～6g/l，mgso4·7h2o3～5g/l，na2so46～9g/l、(nh4)2so42～4g/l，kh2po42～4g/l，kcl0.1～0.5g/l，nacl5～8g/l，谷氨酸钠18～20g/l。

将种子液以10％(v/v)接种量接入发酵培养基中，发酵温度为30～35℃，转速为170rpm，当发酵培养基中的葡萄糖耗尽时停止发酵。

实施例3

本实施例具体说明驯化菌株与原始菌株的摇瓶发酵性能对比

挑选出35℃下生长优良的菌种，采用实施例2的发酵方法，分别在在28℃、31℃和35℃下进行发酵，以比较不同驯化菌株和原始菌株在正常温度下的发酵性能(dha生产能力)。记录发酵时间，发酵完毕后分别测定细胞干重，脂肪酸产量以及dha含量等。不同驯化菌株和原始菌株的发酵参数对比见表1。

表1原始菌株与驯化菌株在不同温度下的发酵参数对比

由表中数据显示：在一定的初糖条件下，随着温度的升高，原始菌株的发酵时间逐渐延长。其中，35℃条件下的发酵时间延长至73小时。驯化后的菌株在正常28度发酵条件下，细胞生长速度大幅度提升，提高了75.43％，β-胡萝卜素积累速率提高了57.75％；在35度高温条件下，周期缩短25h，细胞生长速度是原始菌株的2.10倍，dha产量提高了38.58％。油脂积累方面，随着温度的升高，出发菌株的油脂产量逐渐降低。28℃的油脂积累速率为0.380g/(l·h)，是35℃的2.70倍。然而驯化后的菌株在不同温度条件下的油脂积累速率都稳定于0.4左右，说明驯化菌株油脂合成更为稳定。

实施例4

补料发酵效果对比

在实施例2摇瓶发酵的基础上进行葡萄糖补料发酵。发酵温度为28℃和35℃，转速为170rpm，配制600g/l的葡萄糖溶液于三角瓶中，灭菌后作为补料液，发酵过程保持葡萄糖的浓度在1～10g/l。发酵参数对比如图1、表2所示。

表2原始菌株与驯化菌株补料发酵参数对比

发酵条件为28℃时，驯化菌株的最终生物量、油脂含量分别为82.3g/l、40.2g/l，比原始菌株提高了11.82％、11.05％，dha含量从原始菌株的17.83g/l提高至19.49g/l。发酵条件为35℃时，驯化菌株的生物量、油脂含量、dha产量分别是原始菌株的1.88、2.73、2.59倍，表明驯化菌株在高温培养条件下，展现了更佳的生长能力和油脂积累能力。

可以看出，本发明的菌株不仅可在高温下生长，且生长速度大幅提升，并缩短了发酵周期，其原理可能在于，在生物体内，有系列热激蛋白，可在高于正常生长温度刺激下，诱导合成新蛋白。功能上防止蛋白变形，使其恢复原有的空间构象和生物活性。在连续高温刺激下，细胞被迫高表达大量的热激蛋白以适应恶劣的环境，同时只有表达量高的菌株才能在高温下存活，因此，同时达到筛选高产dha菌株的目的。