一种肌肽-TPGS化合物及其制备方法和用途与流程

本发明公开了一种新型肌肽-tpgs化合物及其制备方法和用途，属于药物化学及材料化学技术领域。该化合物同时具有抗氧化和抗糖基化的作用，可作为皮肤抗衰老和修复药物使用。此外，该化合物还可以作为骨架材料，包载药物成分形成纳米胶束，用于药品、医疗器械及化妆品领域。

技术背景

糖基化是葡萄糖分子或其它糖类粘贴到了蛋白质上，使蛋白质的空间构型、分子结构改变，从而导致蛋白质失去生理活性，所以糖基化过程就是对蛋白质的破坏过程。糖基化和自由基并列构成了人衰老的基本因素。糖类一旦粘贴到了蛋白质上，就会引起一种褐色褪变的组织变化(老年斑)。糖基化可以使皮肤内的蛋白质与胶原结合，以致皮肤出现萎陷，形成皱纹和沟槽。

肌肽(l-carnosine)，学名β-丙氨酰-l-组氨酸，是由一种由β-丙氨酸和l-组氨酸两种氨基酸组成的二肽，结晶状固体。肌肉和脑部的组织含有很高浓度的肌肽。肌肽已被证实可清除在氧化应激过程中使细胞膜的脂肪酸过度氧化而形成的活性氧自由基(ros)以及α,β不饱和醛。肌肽能够在碳基化蛋白质之间起到隔断作用，使这些蛋白质没有活性，从而防止发生交叉连接。

细胞膜主要由蛋白质和脂肪构成，细胞膜上的脂肪容易和自由基结合，产生丙二醛，这种物质像粘胶一样，能够黏附于蛋白质上，最终产生糖基化终末产物(ages)，而ages又产生大量的自由基，自由基和糖基化互相作用形成了恶性循环，但肌肽能够打破这种恶性循环，肌肽能和丙二醛结合，使它在产生破坏作用之前就失去活性。同时，肌肽能够修复已经被丙二醛破坏的蛋白质。

肌肽属于小分子化合物，分子量只有226，容易被细胞吸收入胞，一旦进入细胞内部，其对细胞膜表面的蛋白和脂质修复作用就会大大减弱。因此，对于作用于皮肤的肌肽，其滞留细胞外的时间越多，对质膜和表面蛋白质的修复能力也将越强。本发明合成了一种新型肌肽-tpgs化合物，使肌肽分子量增加、皮肤滞留性延长，对抗皮肤衰老。此外，该化合物还可以用作骨架材料，包载药物分子，形成纳米胶束，用于药品、医疗器械、化妆品等领域。

技术实现要素：

本发明的目的是合成一种新型肌肽-tpgs化合物，该化合物分子量大，不易跨过细胞膜，从而使分子结构中的肌肽在皮肤滞留时间延长，具有抗氧化和抗糖基化的双重功效，可对抗皮肤衰老，促进皮肤的修复。此外，该化合物还可以用作骨架材料，包载药物分子，形成纳米胶束，用于药品、医疗器械、化妆品等领域。

本发明具体技术方案如下：

一种肌肽-tpgs化合物，其结构如下所示：

其中，r代表-(ch2)m-,-ch＝ch(ch2)m-或者-(ch2)mch＝ch-，m代表0-10的整数，(优选代表1-3)，或者r1代表苯环上的单个或多个取代基，多个取代基时，各取代基相同或者不同，选自h、烷基、烷氧基、羟基、氨基、卤素基团或者硝基，优选代表h、c1-c6的烷基、c1-c6的烷氧基、羟基、氨基、卤素基团或者硝基。

tpgs结构中本发明所述肌肽-tpgs化合物结构中具有聚乙二醇结构，n为聚乙二醇结构的重复单元，n所代表的数可以为现有技术中聚乙二醇重复单元可以选的任意数值，优选n为2-85的整数，更优选代表15-30，进一步优选20-25。

本发明另一目的在于提供上述肌肽-tpgs化合物的制备方法，包括如下步骤：

(a)使用二羧酸化合物，在缩合剂存在下与tpgs发生酯化缩合

(b)加入缩合剂和肌肽，酰化缩合，得到肌肽-tpgs化合物，

其中，r代表-(ch2)m-,-ch＝ch(ch2)m-或者-(ch2)mch＝ch-，m代表0-10的整数，或者r1代表苯环上的单个或多个取代基，多个取代基时，各取代基相同或者不同，选自h、烷基、烷氧基、羟基、氨基、卤素基团或者硝基；

n为2-85的整数。

步骤(a)所述的溶剂选自水、四氢呋喃、吡啶、甲醇、dmso中的一种或几种。

步骤(a)所述的二羧酸化合物选自草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、戊烯二酸、邻二苯甲酸、间苯二甲酸或者对苯二甲酸。

步骤(a)或(b)所述的缩合剂选自dcc、dmap、edc、nhs中一种或几种。

上述制备方法还进一步包括纯化、干燥的步骤。一个具体的操作为在去离子水中透析后冷冻干燥。

本发明另一目的在于提供本发明所述肌肽-tpgs化合物在制备皮肤抗衰老、皮肤修复或者皮肤美白(如祛斑)产品中的应用。所述产品为药物、医疗器械、护肤品或者化妆品。

本发明所述的肌肽-tpgs化合物可以活性成分或者药学上可接受的载体材料用于制备皮肤抗衰老、皮肤修复或者皮肤美白产品。

一个具体的方式为，将本发明所述肌肽-tpgs化合物及作为骨架材料制备纳米胶束，包载但不限于，水杨酸、维生素a、过氧化苯甲酰、壬二酸和果酸等药物，用于皮肤用药物、医疗器械、护肤品、化妆品领域。

本发明与现有技术相比有益效果主要体现在：本发明原料简单易得、制备方法简单、后处理方便。肌肽-tpgs化合物具有抗氧化和抗糖基化双重功效，并且可以作为骨架材料包载药物分子，形成纳米胶束，用于药品、医疗器械、护肤品、化妆品等领域。

附图说明

图1.肌肽-tpgs1000合成路线图。

图2.肌肽-tpgs1000分子的maldi-tof-ms图谱(a、tpgs1000-cooh；b、tpgs1000-肌肽)。

图3成纤维细胞存活率检测结果。

图4.肌肽-tpgs1000的dpph自由基清除能力。

图5.肌肽-tpgs1000的ros清除能力(a.空白对照，b.3％vc，c.0.10％肌肽-tpgs，d.0.25％肌肽-tpgs，e.0.50％肌肽-tpgs，f.1％肌肽-tpgs)。。

图6.肌肽-tpgs1000抗糖基化能力。

图7.肌肽-tpgs1000皮肤切片染色结果(a.水(对照)，b.1％氨基胍，c.0.10％肌肽-tpgs，d.0.25％肌肽-tpgs1000，e.0.50％肌肽-tpgs，f.1％肌肽-tpgs)。

图8.肌肽-tpgs1000胶束透射电镜照片。

图9.三维皮肤细胞球明场照片。

图10.细胞球不同截层的荧光滞留强度。

具体实施方式

实施例1肌肽-tpgs1000化合物的制备

肌肽-tpgs1000由经戊二酸活化的tpgs1000上的羧基和肌肽上的氨基通过酰化缩合，以edc和nhs为反应缩合剂。将10μmolcooh-tpgs1000(n＝20-25)、40μmoledc和70μmolnhs溶解在2ml吡啶-dmso溶液(1/1,v/v)中，将反应液混合物在冰浴下用磁力搅拌器轻轻搅拌30min，加入10μmol肌肽，将反应液混合物在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌12h得粗产物，继而将粗产物转移到再生纤维素透析袋(截留分子量1000da)，在去离子水中透析48h，除去未反应的肌肽，edc，nhs，dmso和吡啶。接下来将反应液冷冻干燥，得到干燥的产物混合物白色粉末。肌肽-tpgs1000合成路线如图1所示，肌肽-tpgs1000分子的maldi-tof-ms图谱如图2所示，(a、tpgs1000-cooh；b、tpgs1000-肌肽)。

其中cooh-tpgs1000是通过将tpgs1000的末端羟基与戊二酸的羧基进行酯化缩合，并以dcc和dmap为该反应缩合剂。将0.2mmol戊二酸和0.1mmoldmap溶解于2mldmso中，在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌30min，加入0.24mmoldcc在n2的保护下，室温用磁力搅拌器轻轻搅拌2h，再加入0.04mmoltpgs1000，将反应液混合物在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌24h得粗产物，继而将粗产物转移到再生纤维素透析袋(截留分子量1000da)，在去离子水中透析48h，除去未反应的戊二酸，dcc和dmap。接下来将反应液冷冻干燥，得到干燥的产物混合物白色粉末。

实施例2肌肽-tpgs2000化合物的制备

肌肽-tpgs2000由经丙二酸活化的tpgs2000上的羧基和肌肽上的氨基通过酰化缩合，以nhs为反应缩合剂。将10μmolcooh-tpgs2000、70μmolnhs溶解在2ml吡啶溶液中，将反应液混合物在冰浴下用磁力搅拌器轻轻搅拌20min，加入10μmol肌肽，将反应液混合物在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌12h得粗产物，继而将粗产物转移到再生纤维素透析袋(截留分子量2000da)，在去离子水中透析48h，除去未反应的肌肽，nhs，吡啶。接下来将反应液冷冻干燥，得到干燥的产物混合物白色粉末。

实施例3肌肽-tpgs1000体外活性评价研究

1.成纤维细胞存活率检测

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200μl(96孔板)，铺板使待测细胞调密度至5000个/孔，边缘孔用无菌pbs填充。5％co2，37℃孵育，至细胞生长至一定密度，换液加入不同浓度梯度的待测样品，以不含待测药品的培养液为对照。5％co2，37℃孵育24小时，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h。使药物与mtt充分反应，可先离心后弃去培养液，小心用pbs冲2-3遍后，再加入含mtt的培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od值490nm处测量各孔的吸光值。细胞活率＝(测定孔od值-空白对照od值)/(细胞对照组od值-空白对照od值)×100％。结果如图3所示，肌肽-tpgs的细胞毒性非常小，具有良好的安全性。

2.抗氧化自由基实验

(1)dpph自由基清除能力检测

取等体积的待测液与2×10^-4mol/l的dpph溶液混匀(a1管)；取等体积的水与2×10^-4mol/l的dpph溶液混匀(a2管)；取等体积的无水乙醇与待测液混匀(a3管)；反应30min后，在517nm下测a1，a2和a3管的吸光度值。dpph自由基清除率＝[(a2+a3)-a1]/a2×100％。结果如图4所示。结果显示，与空白对照组(水)相比，0.1％-1％的肌肽-tpgs化合物具有显著的dpph自由基清除能力，且呈现出浓度依赖型，其中1％浓度的肌肽-tpgs化合物的dpph自由基清除能力已接近阳性对照组(3％vc)。

(2)活性氧(ros)含量检测

采用活性氧检测试剂盒进行测试。取适当浓度的样品，作用于成纤维细胞24h后，去除细胞培养液。加入稀释好的dcfh-da，于37℃培养箱中孵育20min。用无血清培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。使用488nm激发波长，525nm发射波长检测样品荧光强度。结果如图5所示(a.空白对照，b.3％vc，c.0.10％肌肽-tpgs，d.0.25％肌肽-tpgs，e.0.50％肌肽-tpgs，f.1％肌肽-tpgs)。结果显示与dpph自由基清除能力类似，肌肽-tpgs可以有效清除ros，其中1％浓度的肌肽-tpgs化合物的清除能力已接近阳性对照组(3％vc)。

实施例4肌肽-tpgs1000体内活性评价研究

1.抗糖基化实验

雄性昆明小鼠30只，体重30±5g，小鼠分笼饲养，自由进食和饮水，室温维持在20-25℃，每日光照12h。在适应性饲养1周后，采用随机数字法将小鼠随机分为对照组、d-半乳糖组、d-半乳糖+肌肽tpgs1000化合物组，每组10只。其中后两组连续8周背部皮下注射d-半乳糖1g/kg，每天一次。8周后，小鼠背部注射区域脱毛，将肌肽-tpgs化合物均匀涂抹于脱毛区域，每天一次，连续4周。4周后，脱颈处死小鼠，迅速切取小鼠涂抹区域皮肤。分别取各组小鼠皮肤组织约200mg，预冷的pbs清洗，除去皮下脂肪及其他结缔组织，加入9倍量的预冷pbs，制备成10％组织匀浆液，4℃10000rpm，离心10min，吸取上清液至新的离心管中，利用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)检测各组小鼠皮肤组织中晚期糖基化终产物(ages)的含量，严格按照说明书操作进行，具体过程如下：

(1)标准品的稀释：根据说明书将标准品稀释成5个浓度梯度。

(2)加样：①空白孔：空白对照孔内不加样品、生物素标记的抗体、链霉亲和素-hrp，只加显色剂a和b以及终止液。②标准品孔：加入生物素抗体标记的标准品50μl，链霉亲和素-hrp50μl。③待测样品孔：加入样品40μl，生物素标记的抗体10μl，链霉亲和素-hrp50μl，盖上封板膜轻轻震荡混匀，37℃孵育1h。

(3)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体甩干，每孔加满稀释后的洗涤液，静置30s后弃去，重复洗涤5次后拍干。

(4)显色：每孔加入显色剂a和b各50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。

(5)终止：每孔加入终止液50μl，此时蓝色转为黄色，反应终止。

(6)测定：终止10min以内，以空白孔调零，酶标仪在450nm波长下检测吸光度(od值)。

(7)计算：根据梯度浓度标准品的od值，绘制标准曲线，得到曲线回归方程，根据回归方程计算各组样品中ages的含量。

结果如图6所示。结果显示，不同浓度的肌肽-tpgs均表现出显著的抗糖基化能力，且与浓度呈正相关，其中1％的肌肽-tpgs抗糖基化能力已接近阳性对照组(1％氨基胍)。

2.皮肤切片染色实验

小鼠处死后取涂抹区域皮肤，用4％多聚甲醛中固定24-48h，梯度乙醇溶液脱水：70％乙醇1h、80％乙醇1h，95％乙醇1h，无水乙醇2h，二甲苯i和ii分别透明15min，石蜡包埋。置于石蜡切片机中进行切片，厚度在5μm左右，石蜡切片置60℃恒温烤箱中烘烤30min后使用。利用he染色检各组小鼠皮肤结构改变，切片置于二甲苯i和ii脱蜡，每次15min，梯度乙醇溶液水化：无水乙醇2min、95％乙醇1min、80％乙醇1min、70％％乙醇1min，蒸馏水冲洗；harris苏木精染液染色5min，流水洗去苏木素液；l％盐酸乙醇分化30s，流水冲洗；1％氨水反蓝液3min，流水冲洗；伊红染液染色2min，流水冲洗；梯度乙醇溶液脱水：80％乙醇1min，95％乙醇1min，无水乙醇2min；二甲苯i和ii分别透明2min，切片晾干，中性树胶封片，光镜下观察组织学改变。结果如图7所示(a.水(对照)，b.1％氨基胍，c.0.10％肌肽-tpgs，d.0.25％肌肽-tpgs，e.0.50％肌肽-tpgs，f.1％肌肽-tpgs)。结果显示，不同浓度肌肽-tpgs化合物均为显示出对皮肤的毒副作用，具有良好的安全性。

实施例5肌肽-tpgs1000三维皮肤细胞球滞留评价

1.以肌肽-tpgs1000的空白胶束

精密称取tpgs和肌肽-tpgs1000(1:1，molarratio)适量作为空白胶束的制备材料，置于茄形瓶中，溶解于适当体积的甲醇中，通过旋转蒸发仪36℃真空除去甲醇，在茄形瓶底部和内壁形成一层薄膜。加入适量heps缓冲液(10mm，ph7.4，150mmnacl)在60℃水浴水化30min，冷却至室温，用0.2μm聚碳酸酯膜过滤，即得透明的空白胶束。利用透射电镜观测，结果如图8所示。结果显示，该胶束外形圆整，粒度均匀，粒径在20nm左右。

2.含药和荧光标记物的胶束

同法精密称取tpgs和肌肽-tpgs1000适量制备材料，与适量的水杨酸、维生素a、过氧化苯甲酰、壬二酸和果酸中的一种药物(药脂比为1:50，w/w)，以及适量香豆素(药脂比1:200，w/w)。溶解于适当体积的甲醇中，通过旋转蒸发仪36℃真空除去甲醇，在茄形瓶底部和内壁形成一层薄膜。加入适量heps缓冲液在60℃水浴水化30min，冷却至室温，用0.2μm聚碳酸酯膜过滤，即得含药和荧光标记物的胶束。

3.三维皮肤细胞球的建立

将一定量的琼脂糖溶于无血清培养基中，配制浓度为20g/l的琼脂糖凝胶溶液，在80℃的水浴中静置30min，然后采用高压灭菌；将琼脂糖凝胶溶液加入到48孔细胞培养板中，100μl/孔，冷却至室温使之凝固；然后将hacat人永生化表皮细胞以1×10³个/孔的浓度接种至细胞培养板中，培养液体积为100μl。接种完毕后，缓慢摇动细胞培养板3min，然后在5％co2、37℃的条件下培养，每个孔内可形成一个永生化表皮细胞球。三维皮肤细胞球明场照片如图9所示。

4.三维皮肤细胞球滞留评价

为了观察肌肽修饰的胶束对细胞球的穿透和滞留能力，向含hacat人永生化表皮细胞球的48孔细胞培养板中分别加入游离香豆素、香豆素标记的普通胶束、香豆素标记的肌肽修饰胶束，使得终浓度为10μm香豆素；继续培养12h；将这些细胞球转至共聚焦小皿中，每组5个细胞球，用新鲜培养液洗涤三次，最后每个皿中保留100μl新鲜培养液；对于每个细胞球，从细胞球顶部到中央以5μm的间隔进行光切，激发波长353nm，发射波长442nm，获得细胞球不同截层的香豆素荧光强度。结果如图10所示。结果显示，肌肽-tpgs1000制备的胶束(肌肽修饰胶束)具备明显的滞留能力，可以增加在皮肤细胞球中的穿透和滞留能力。

实施例6肌肽-tpgs1000抗衰老修复霜的制备

配方(重量％)：微晶石蜡1，蜂蜡2，羊毛脂2，液体石蜡20，异三十烷10，山梨糖醇酐倍半油酸酯4，聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯1，肌肽-tpgs10002，丙二醇7，精制水51，香料适量，防腐剂适量。

制备方法：肌肽-tpgs1000、丙二醇溶于热水，保持70度(水相)；其他成分混合，加热溶解，保持70度(油相)。在搅拌下，慢慢将水相加入油相，有均质器乳化，然后搅拌冷却至30度，即得肌肽-tpgs1000抗衰老修复霜。

实施例7维生素a肌肽-tpgs1000胶束的制备

采用薄膜水化法制备胶束。将20mg的维生素a和80mg的肌肽-tpgs1000分别溶于3ml乙腈中，然后加入到25ml圆底烧瓶中，混合均匀；37℃下抽真空旋蒸除去乙腈，制得均一的含维生素a和肌肽-tpgs1000的混合薄膜；加入10ml超纯水，热水浴中振摇，制得澄清透明溶液，使用0.22μm微孔滤膜趁热过滤溶液，除去游离的维生素a，即得装载维生素a的肌肽-tpgs1000胶束溶液；真空冷冻干燥，得白色粉末状固体，密封保存于20℃，以备后续使用。