使用三羟基和四羟基季铵化合物作为电泳分离的拆分剂的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月12日提交的美国临时专利申请号62/617,110的利益和优先权，通过提述将其内容并入本文用于所有目的。

联邦资金声明

不适用。

发明背景

本发明涉及通过将含有分析物的凝胶进行电泳分离来对分析物进行分析的领域。

在电泳中，分析物受到电力的作用，导致分析物迁移通过凝胶。通常，对一种或多种感兴趣的分析物进行标记，以便于在与样品中存在的其他组分分离之后将其检测和定量。

电泳是用于分析样品中存在的各种分析物的一系列技术之一。通常，将包含感兴趣的一种或多种分析物的样品上样到凝胶上，并使样品中的分析物在整个凝胶长度上受到电位的作用，从而使它们移动通过凝胶。电泳分离的多种形式是本领域已知的。这些形式包括但不限于平板凝胶、毛细管电泳(“ce”)、电过滤、差异凝胶电泳(“dige”)、区带电泳、等电聚焦(“ief”)、非变性电泳、二维电泳、免疫化学/免疫固定电泳、固相ph梯度电泳、微芯片、移动界面电泳、等速电泳、脉冲场电泳以及它们的组合。在毛细管电泳中，技术包括基于分子大小来分离分子的毛细管凝胶电泳或“cge”以及基于电荷:质量比来分离分子的毛细管区带电泳或“cze”。

ce、cge和czee在本领域中是熟知的，并且在文献中有广泛教导，包括beckmancoulter的小册子“introductiontocapillaryelectrophoresis”(未注明日期，但在1991-1992年之间)；whatley，h.的“basicprinciplesandmodesofcapillaryelectrophoresis”，petersen和mohammad编辑，“clinicalandforensicapplicationsofcapillaryelectrophoresis”，humanapress,inc.totowa,njtotowa(2001)，和laur和rozing编辑的“highperformancecapillaryelectrophoresis”，第2版，agilenttechnologiesinc.,casantaclara(2014)。数十年来，cge一直用于分离蛋白质和核酸。参见，例如，zhu等人，analchimacta.2012jan4；709:21-31。

可以使用不同的电泳技术来分离各种类型的化合物。通过电泳技术将聚糖相互分离，特别是将n-聚糖分离，相比于蛋白质或核酸的相互分离更具挑战性，这是由于这些类型化合物各自的特征所致。参见，例如，schwarzer等人，“n-glycananalysisbycge-lif；profilinginfluenzaavirushemagglutininn-glycosylationduringvaccineproduction”，electrophoresis2008,29,4203-4214,第4204页。通常，将要通过cge分析的聚糖用带电荧光团或紫外-可见染料标记，以允许通过例如激光诱导荧光(“lit”)或通过uv光进行检测。参见，例如，schwarzer(上文)，reusch等人，“high-throughputglycosylationanalysisoftherapeuticimmunoglobulingbycapillarygelelectrophoresisusingadnaanalyzer”，2014,doi:10.4161/mabs.26712。

用于电泳分离的检测系统可包括吸光度、荧光、质谱、电导率、电位测定法或电流测定法。然而，在进行电泳分离的条件下，样品中与感兴趣的分析物共迁移的其他化合物的存在，会使得准确地检测和定量一种或多种感兴趣的分析物变得困难。减少这种共迁移可提高对分析样品中存在的感兴趣的分析物的分离度。迄今为止，尚未报道用于减少电泳分离中的样品组分的共迁移，并由此提高样品中感兴趣的分析物与其他组分的分离度的组合物和方法。

对于提高在电泳分离(诸如ce或cge)过程中共迁移的分析物和组分特别是聚糖的分离度的组合物和方法仍然存在需求。令人惊讶地，本发明满足了这些需求和其他需求。

发明简述

本发明提供了用于改善标记分析物的电泳分离的组合物、方法、系统和试剂盒。在第一组实施方案中，本发明提供用于分析物的电泳分离的凝胶。所述凝胶包含一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物，其中所述结构1为：

所述结构2为：

在一些实施方案中，所述凝胶包含两种或更多种结构1的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含两种或更多种结构2的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含一种或多种结构1的化合物和一种或多种结构2的化合物。在一些实施方案中，具有结构1的那一种化合物是三(2-羟乙基)甲基氢氧化铵(“thmh”)。在一些实施方案中，thmh被稳定剂稳定化。在一些实施方案中，电泳分离是毛细管电泳。在一些实施方案中，毛细管电泳是毛细管凝胶电泳。在一些实施方案中，毛细管电泳是毛细管区带电泳。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物以凝胶的0.001％wt/wt到5.0％wt/wt的浓度存在。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物以凝胶的0.08％wt/wt到0.15％wt/wt的浓度存在。

在另一组实施方案中，本发明提供了用于感兴趣的分析物的毛细管电泳(ce)分离的卡盒(cartridge)或毛细管，其中所述卡盒或毛细管装载有凝胶，所述凝胶包含一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物，其中所述结构1为：

所述结构2为：

在一些实施方案中，凝胶包含两种或更多种结构1的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含两种或更多种结构2的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含一种或多种结构1的化合物和一种或多种结构2的化合物。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物是三(2-羟乙基甲基氢氧化铵(“thmh”))。在一些实施方案中，thmh被稳定剂稳定化。在一些实施方案中，凝胶进一步包含聚环氧乙烷。在一些实施方案中，感兴趣的分析物是标记的聚糖。在一些实施方案中，所述卡盒或毛细管是卡盒。在一些实施方案中，所述卡盒或毛细管是毛细管。在一些实施方案中，毛细管具有内腔，该内腔具有未涂覆的壁。在一些实施方案中，毛细管具有内腔，该内腔具有涂覆有涂层的壁，所述涂层(a)不干扰所述感兴趣的分析物的ce，并且(b)调理在各次运行之间不对毛细管进行调理的条件下，在至少5次运行的过程中防止所述分析物的分离度下降。在一些实施方案中，所述涂层不干扰感兴趣的分析物的ce，并且调理在各次运行之间不对毛细管进行调理的条件下，在至少10次运行的过程中防止所述分析物的分离度下降。在一些实施方案中，壁的涂层是聚乙烯醇。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物以凝胶的0.001％wt/wt到5.0％wt/wt的浓度存在于凝胶中。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物以凝胶的0.08％wt/wt到0.15％wt/wt的浓度存在于凝胶中。

在另一组实施方案中，本发明提供了用于分析物的电泳分离的系统，所述系统包括(a)用于实施电泳分离的设备，以及(b)在其中实施电泳分离的凝胶，所述凝胶包含一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物，其中结构1为：

所述结构2为：

在一些实施方案中，凝胶包含两种或更多种结构1的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含两种或更多种结构2的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含一种或多种结构1的化合物和一种或多种结构2的化合物。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物是三(2-羟乙基)甲基氢氧化铵(“thmh”)。在一些实施方案中，将thmh用稳定剂稳定化。在一些实施方案中，电泳分离是毛细管电泳。在一些实施方案中，毛细管电泳是毛细管凝胶电泳。在一些实施方案中，毛细管电泳是毛细管区带电泳。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物以凝胶的0.001％wt/wt到5.0％wt/wt的浓度存在于凝胶中。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物以凝胶的0.075％wt/wt到0.2％wt/wt的浓度存在于凝胶中。

在又另一组实施方案中，本发明提供了用于实施标记分析物的电泳分离的方法，所述方法包括(a)将所述分析物上样到凝胶上，其中凝胶包含有效量的一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物，其中所述结构1为：

所述结构2为：

并且使凝胶中的标记分析物受到电势的作用，从而实施标记分析物的电泳分离。在一些实施方案中，凝胶包含两种或更多种结构1的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含两种或更多种结构2的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含一种或多种结构1的化合物和一种或多种结构2的化合物。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物是三(2-羟乙基)甲基氢氧化铵(“thmh”)。在一些实施方案中，thmh被稳定剂稳定化。在一些实施方案中，电泳分离是毛细管电泳。在一些实施方案中，毛细管电泳是毛细管凝胶电泳。在一些实施方案中，毛细管电泳是毛细管区带电泳。在一些实施方案中，标记分析物是标记的聚糖。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物以凝胶的0.001％wt/wt到5.0％wt/wt的浓度存在于所述凝胶中。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物以凝胶的0.075％wt/wt到0.15％wt/wt的浓度存在于所述凝胶中。在一些实施方案中，标记的聚糖是用具有多个磺酸模块的染料标记的。在一些实施方案中，标记的聚糖是用apts、ants或instantq^tm标记的。

在又另一组实施方案中，本发明提供了用于实施电泳分离的试剂盒，所述试剂盒包括(a)容纳凝胶的容器，其中凝胶包含有效量的一种或多种结构1的化合物、或一种或多种结构2的化合物、或一种或多种结构1的化合物与一种或多种结构2的化合物的混合物，其中结构1为：

结构2为：

和(b)缓冲液。在一些实施方案中，凝胶包含两种或更多种结构1的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含两种或更多种结构2的化合物。在一些实施方案中，凝胶包含一种或多种结构1的化合物和一种或多种结构2的化合物。在一些实施方案中，一种或多种结构1的化合物是三(2-羟乙基)甲基氢氧化铵(“thmh”)。在一些实施方案中，thmh被稳定剂稳定化。在一些实施方案中，容纳所述凝胶的容器是卡盒或毛细管。在一些实施方案中，所述卡盒或毛细管是卡盒。在一些实施方案中，所述卡盒或毛细管是毛细管。在一些实施方案中，毛细管具有这样的内腔，所述内腔有未涂覆的壁。在一些实施方案中，毛细管具有这样的内腔，所述内腔有经涂覆的壁。在一些实施方案中，毛细管的壁涂层是聚乙烯醇。

附图简要说明

图1a和1b。图1a和1b是电泳图，比较了对自依那西普(一种融合蛋白生物治疗剂)释放的apts标记的聚糖分离度。图1a。图1a是显示使用标准凝胶的apts标记的聚糖的分离度的电泳图。箭头指向的峰中的分离未能将man5从与man5紧密共迁移的其他聚糖——apts标记的a1f、g0和g0f-n中拆分出来。图1b.图1b的电泳图显示使用相同的试剂，但其中凝胶还包含0.1％的示例性季铵化合物thmh，分离apts标记的聚糖的分离度。如箭头所示，在图1b中，apts标记的man5的峰与alf、g0和g0f-n的峰分开。gu＝葡萄糖单位。rfu＝相对荧光单位。

图2a和2b。图2a和2b是电泳图，比较了在首次注入样品之后(图2a)以及在随后注入相同的样品之后(图2b)，从人igg释放然后用instantq^tm标记的聚糖在毛细管中的分离度，毛细管的内部涂覆有聚乙烯醇。毛细管在每次运行之前，装载新鲜凝胶，凝胶中添加有0.1％wt/wt的示例性季铵化合物thmh，但在任何两次运行之间均不对毛细管进行调理(conditioning)。gu＝葡萄糖单位。rfu＝相对荧光单位。

图2a。图2a是电泳图,显示从人igg释放的instantq^tm标记的聚糖在这些聚糖的首次运行中的分离情况(由于注入1为阶梯标准品，该注入标记为“注入2”)。

图2b。图2b是电泳图，显示从人igg中释放的instantq^tm标记的聚糖在同一pva包被的毛细管中再经过234次分离之后的分离情况(如前面指出的，由于首次注入的是阶梯标准品，这一次是“注入235”)。在两次运行之间在毛细管中装载新鲜凝胶，但在图2a所示的运行和图2b所示的运行之间未进行调理。

发明详述

在许多情况下，确定样品中存在哪些分析物是重要的。例如，确定糖缀合物(如糖蛋白)连接的是哪种糖类(又称“聚糖(glycans)”)对于理解糖蛋白的药代动力学、免疫原性和潜在的治疗效果是重要的。因此，改善样品中存在感兴趣的分析物(例如聚糖)的检测，是值得期望的。

通常，样品中存在的分析物是通过电泳分离，然后检测分离的分析物来检测的。如“

背景技术：
”中所述，许多电泳分离技术是本领域已知的。这些技术包括但不限于平板凝胶(slabgel)、毛细管电泳(“ce”)、电过滤、差异凝胶电泳(“dige”)、区带电泳、等电聚焦(“eef”)、非变性电泳、二维电泳、免疫化学/免疫固定电泳、固相ph梯度电泳、微芯片、移动界面电泳、等速电泳、脉冲场电泳，以及它们的组合。在毛细管电泳中，包括基于分子大小来分离分子的毛细管凝胶电泳(又称“cge”)，以及基于电荷:质量比来分离分子的毛细管区带电泳(又称“cze”)等技术。

虽然电泳技术通常对许多分析物的分离良好，但某些分析物，尤其是聚糖，会彼此共迁移，从而难以确定哪些分析物存在以及以多少量存在。减少给定样品中存在的分析物(例如标记的聚糖)的共迁移将会提高样品中存在的分析物的分离度。不幸的是，迄今为止，用于减少分析物例如标记的聚糖的共迁移从而提高分析物的分离度的组合物和方法几乎阙如。

令人惊讶地，我们发现，若凝胶中存在低浓度的三(2-羟乙基)甲基氢氧化铵(cas号33667-48-0，该化合物有时在本文中称为“thmh”或“temah”，以往主要用于清洗半导体)，可显著提高用某些标记物标记的分析物在该凝胶中电泳分离时的分离度。例如，当电泳过程中凝胶中存在少量thmh时，通过cge可以更好地分离由下述标记物标记的聚糖等分析物：apts(8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐，cas名称/编号：8-氨基-1,3,6-芘三磺酸三钠盐196504-57-1)；如美国专利号8,124,792和8,445,292教导的apts活化形式；或者具有多个磺酸部分的其他标记物。在构成本发明基础的研究中，凝胶中thmh的存在扩大了分离范围，并提高了cge分离中分析物的分离度。构成本发明基础的一些研究使用apts测试了thmh对man5(在本文中有时也称为“man-5”或“man-5聚糖”)分离的影响，man5是一种在cge分离中有时特别难分离的聚糖，apts本身不能充分分离凝胶中的man5。研究表明，thmh有助于在凝胶分离全过程中保持man5的峰形，而且经过多次运行之后仍然如此。如本领域技术人员将理解的那样，在分析物的分离中保持峰形是期望的，因为其有助于防止紧密共迁移的各分析物的峰相互重叠，如果在过程中峰变宽就会发生这种峰重叠的情况。

考虑到所有电泳技术都依赖于分析物在电场的影响下穿过凝胶的移动，相信在使用cge系统的研究中获得的结果在其他形式的使用凝胶的电泳中，尤其是在微流体环境中进行电泳分离的实施方案中也成立。此外，由于感兴趣的化合物在电场的影响下穿过凝胶的移动是电泳技术的一个特点，而与被分析化合物的类型无关，因此相信，虽然提高聚糖的分离度是优选的实施方案，但是使用本文讨论的thmh和其他化合物也将提高其他标记的糖类和含有它们的化合物的分离度。

thmh是在一些实施方案中使用的季铵化合物的优选实施方案。然而，相信在提高电泳分离中分析物的分离度方面，使用含有甲基和三个末端羟基，其中甲基不像thmh那样直接连接于氮，而是通过1至5个碳的烷基接头附接的其他季铵化合物，将获得相似结果。因此，在这些实施方案中，三羟基季铵化合物具有结构1所示的结构。结构1：

结构1的化合物有时在本文中被称为“三羟基季铵化合物”。

进一步相信，使用以第四羟基代替thmh的甲基的四羟基季铵化合物，其中，第四羟基可以直接或通过1至5个碳的烷基接头与氮连接，在提高电泳分离中分析物的分离度方面将获得相似结果。因此，在这些实施方案中，四羟基季铵化合物具有结构2所示的结构。

结构2：

结构2的化合物在本文中有时被称为“四羟基季铵化合物”。在优选实施方案中，结构2的化合物的羟基直接键合于氮。在一些实施方案中，结构2的化合物在羟基和氮之间有1个碳。在一些实施方案中，结构2的化合物在羟基和氮之间有2个碳。在一些优选实施方案中，结构2的化合物在羟基和氮之间有3个碳。在一些优选实施方案中，结构2的化合物在羟基和氮之间有4个碳。在一些优选实施方案中，结构2的化合物在羟基和氮之间有5个碳。

本发明的组合物和方法特别适合于针对分析物的大小分离的使用凝胶的电泳分离，包括杂交技术。在一些实施方案中，使用凝胶的电泳分离是毛细管电泳。在一些实施方案中，毛细管电泳是毛细管凝胶电泳。

上述三羟基季铵化合物或四羟基季铵化合物可以单独使用，或以三羟基季铵化合物或四羟基季铵化合物两者的混合物、或两种三羟基季铵化合物的混合物或两种四羟基季铵化合物的混合物的形式使用。对于任何特定的三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或它们的混合物，可以如下所述容易地测试确定其是否可提高一种或多种感兴趣的分析物的分离度：将待分离的分析物样品或分析物引入含有待测化合物或化合物的混合物的第一凝胶(凝胶1)中，并且将重复样品引入没有测试化合物的第二凝胶(凝胶2)中，将凝胶1中分离的测试样品与凝胶2中分离的测试样品相比，以确定所选分析物的分离度是否(a)提高、(b)相同或(c)更差。例如，如果感兴趣的分析物是用例如ants、apts或instantq^tm(prozyme,inc.,hayward,ca)标记的man5、a1f和g0f-n聚糖，则可以将其在含有测试量的测试化合物或混合物的第一凝胶中进行cge分离，看与在第二凝胶中(与第一凝胶的唯一区别时没有测试化合物或混合物)进行的cge分离相比，不同的感兴趣的标记聚糖是否相互分离得更好。

通常，为了方便，将化合物或混合物以溶液形式引入凝胶组合物中，但是可以将其作为粉末混合到用于凝胶基质的缓冲液中，或者通过本领域已知的其他方便方式引入。三羟基季铵化合物或四羟基季铵化合物的溶液可进一步包含少量抗菌剂。例如，thmh可从tciamerica(portlandor)以浓度为40-50％的水溶液、用试剂mehq(4-甲氧基苯酚，cas号150-76-5)稳定化的形式购买。相信在作为本公开基础的用thmh进行的研究中，获得的良好结果是由于thmh的存在，而不是由于研究中使用的thmh中存在少量mehq。

制备用于不同电泳应用的凝胶的配方是本领域熟知的。预期本领域技术人员将熟悉适合用于分析一种或多种感兴趣的分析物的特定电泳技术的配方。在一些优选实施方案中，凝胶配方是用于毛细管电泳的凝胶。在一些优选实施方案中，凝胶配方是用于毛细管凝胶电泳的凝胶。三羟基季铵化合物或四羟基季铵化合物、或三羟基季铵化合物或四羟基季铵化合物两者的混合物、或两种或更多种三羟基季铵化合物或两种或更多种四羟基季铵化合物的混合物优选以0.005％至5％、0.0075％至4％、0.01％至3％、0.025％至2％、0.025％至1％、0.05％至0.75％、0.05％至0.60％、0.075％至0.50％、0.075％至0.4％、0.075％至0.3％、0.075％至0.2％、0.075％至0.15％、0.08％至0.125％、0.85％至0.125％、0.09％至0.120％、0.09％至0.115％、0.09％至0.11％和0.1％的量添加至选择的凝胶配方中。发现0.1％是将man5与其他紧密共迁移的聚糖分离的最佳百分比。预期对于分离不同的感兴趣的聚糖最有效的一种或多种季铵化合物的百分比可能不同于所发现的对于分离man5与其他聚糖的最有效百分比，但仍在前述的百分比范围之内，并且使用本公开所教导的测定法可以容易地确定对于任何特定聚糖或其他标记糖类最有效的百分比或浓度。百分比可以基于wt/wt或基于v/v计算。两种计算方式非常相似，但是化合物的最佳浓度可能因使用哪种计算方式而略有不同。在本工作的研究中，使用了两种计算方式来制备混合物，未发现功能上的差异。

为了制备电泳凝胶而加入配方中的少量thmh、其他三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物、或它们的混合物，可能难于通过移液或其他方式操作而加入到凝胶配方中。因此，有时首先将包含thmh或其他三羟基季铵化合物或四羟基季铵化合物的溶液稀释2至10倍，以加大含有要加入的化合物的溶液的量。例如，可用含有mehq的水将thmh储备溶液(45-50％w/w)稀释10倍，达到约5％的工作浓度。然后将这一工作浓度的thmh加入到凝胶混合物中，以形成具有终浓度0.05-0.5％thmh的凝胶。在一些实施方案中，期望通过省略中间溶液来提高最终溶液的精度。在这些实施方案中，可以称量要添加到配方中的thmh或其他三羟基季铵化合物或四羟基季铵化合物或这些化合物的混合物(“添加物”)，计算出将添加物稀释至期望浓度所需的凝胶溶液的重量，将添加物放入适合于容纳要用于稀释添加物的量的凝胶的容器中，并且将凝胶溶液直接添加至容器中的添加物。优选地，然后通过实验室中使用的混合粘稠溶液的技术将凝胶溶液和添加物混合，例如，通过将容器放置在旋转平台上或通过使用磁力搅拌器。

可以容易地测试如此得到的凝胶中存在的三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或其混合物的任何特定浓度，以检查该浓度是否导致电泳仪中的电流超过推荐使用的量；如果属实，则该特定三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或其混合物的特定浓度不是优选的。优选将三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或其混合物添加于所选凝胶配方的其余组分并搅拌，以获得三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或其混合物在凝胶中的均匀分布。

类似地，可以容易地通过下述方式来测试任何特定的三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或它们的混合物的任何特定浓度对于提高一种或多种感兴趣的分析物的分离度中的作用：将所述分析物的测试样品在含有测试浓度的所述一种或多种化合物的第一凝胶(凝胶1)中、以及没有所述测试化合物的第二凝胶(凝胶2)中分离，将凝胶1中分离的测试样品与凝胶2中分离的测试样品相比，确定所选分析物的分离度是否提高、相同或更差。例如，如果感兴趣的分析物是本领域称为man5、alf和go，并用例如ants、apts或instantq^tm(prozyme,inc.,hayward,ca)标记的聚糖，则可以用测试量的测试化合物或混合物对它们实施cge，以查看凝胶是否成功地使不同的感兴趣的标记聚糖相互分离。用ants、apts或instantq^tm以外的标记物标记的分析物同样可以用来确定特定量的特定三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或其混合物相比于在不存在该三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或其混合物的情况下进行的相同分离是否成功提高了特定分析物的分离度。在给定凝胶配方中，提高所选分析物的分离度、但不导致用于进行电泳分离的设备过热的特定三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或其混合物的量被认为是三羟基季铵化合物、四羟基季铵化合物或其混合物的有效量。

定义

如本文中使用的，短语“凝胶”、“凝胶基质”和“筛分基质”是同义词。

在进行电泳分离的语境中，例如在通过cge或使用凝胶的混合ce程序进行电泳分离的语境中，术语“分离度”是指区分在用于分离它们的分析系统中本来会共迁移的两种分析物的能力。为了参考方便，除非上下文另外要求，否则本文中使用的术语“cge”包括使用凝胶的混合ce程序(hybridceprocedures)。

术语“标记物”，就“标记感兴趣的分析物”而言，是指将荧光模块或紫外可见染料以化学方式附接至该感兴趣的分析物。

短语“分析物已通过与某种具名化合物反应而被标记”的意思是：被标记的分析物上所附接的标记物，是让该分析物与该具名化合物在允许该具名化合物以荧光模块或紫外可见染料标记该分析物的条件下接触之后所保留的标记物。

man5

哺乳动物抗体和融合蛋白是重要的且非常昂贵的治疗剂类群，通常在商业发酵系统中生产。在抗体或融合蛋白生产过程中，监测称为“man5”(甘露五糖-二-(n-乙酰基-d-氨基葡萄糖)或“寡甘露糖-5聚糖”)(cas号66091-47-2，也称为“man-5”或“man-5聚糖”)的聚糖水平，可以将其用作发酵系统受到压力并允许干预的标志，从而有希望及时节省生产批次。man-5聚糖的以下结构来自sigma-aldrich网站(sigma-aldrich,st.louis,mo)：

ce和cge

毛细管电泳和cge已经被用于分离各种分析物已超过二十年。因此，可以预期本领域技术人员是熟悉本领域中使用凝胶进行cge和混合ce方法所使用的各种方案和试剂的，且此处无须详细讨论这些方案和试剂。例如，在下列文献中详细讨论了一般的ce，尤其是cge：“capillaryelectrophoresismethodsforpharmaceuticalanalysis,”第9卷，ahuja和jimidar编辑，elsevier,london(2008),“capillaryelectrophoresisguidebook:principles,operation,andapplications,”(methodsinmolecularbiology),altria编辑，humanapress,totowa,nj(2010)，和“capillaryelectrophoresis:methodsandpotentials,”engelhardt等人编辑，friedr,vieweg&sohn,braunschweig/wiesbaden(1996)，等等。特别是在许多文献中还教导了糖类的ce，这些文献包括“capillary'electrophoresisofcarbohydrates”(methodsinmolecularbiology,第213卷),thibault和florida编辑，humanapressinc,totowa,nj(2003),“capillaryelectrophoresisofcarbohydrates:frommonosaccharidestocomplexpolysaccharides,”volpi编辑，humanapress,totowa,nj(2011)和“carbohydrateanalysis:highperformanceliquidchromatographyandcapillary'electrophoresis,”elrassi编辑，elsevierscienceb.v.,amsterdam,thenetherland(1995)等。上述最后一篇参考文献的第8章讨论了分析糖类和糖缀合物的多种ce技术(包括cze和cge)的用途。

凝胶、卡盒、毛细管和标记物

用于各种分析物的电泳分离的凝胶在本领域中是熟知的，这些凝胶具有不同组成，可由本领域技术人员在选择的特定电泳技术中针对感兴趣的分析物的性质加以调整。我们预期，本领域技术人员会熟悉现有技术中用于通过选定的电泳分离技术对感兴趣的特定分析物进行电泳分离的凝胶，包括针对聚糖和其他含有糖类的化合物的凝胶和技术。

在用于分离聚糖的一些实施方案中，本发明方法和组合物中使用的凝胶，特别是用于cge分离的凝胶，与美国专利no.8,163,152(以下简称“专利152”)第90页第12列第15-23行所教导的一样。在一些优选实施方案中，按照专利152第12列第25-35行列出的配方制备凝胶，但有以下改良：(1)配方中列出的7000000mwtg/mol的聚环氧乙烷(“peo”)被8000000mwtg/mol的peo代替，因为7000000分子量的peo目前不能商购；(2)省去了etbr(这种改良配方有时在本文中称为“改良的peo凝胶”)。在一些实施方案中，配方中列出的较大和较小peo的mwtg/mol可以各自独立地为所述mwtg/mol值的±20％。并且，无论使用的peo的大小如何，优选省去凝胶中的etbr。将152专利通过提述完整并入本文，并且特别地将上面引用的部分通过提述并入本文。正如技术人员所知，“peo”和“聚乙二醇”或“peg”在化学上是同义的，但是“peg”通常用于指低于20,000g/mol的聚合物，而“peo”通常用于指高于这个点的聚合物。

在感兴趣的分析物为聚糖的一些实施方案中，凝胶可以由用于聚糖的毛细管凝胶电泳的非peo的化合物，如羟丙基甲基纤维素(hpmc)所构成。虽然peo是特别优选的凝胶，但是可以使用其他中性亲水性聚合物，如烷基纤维素、聚乙烯醇、葡聚糖或聚丙烯酰胺。

可以通过本领域已知的任何手段产生用于电泳分离的凝胶。为了方便，可在形成凝胶之前，将结构1、结构2的化合物或其混合物添加至试剂，以便结构1、结构2的化合物或其混合物在凝胶内均匀分布。在许多仪器中，将凝胶装在一种或多种容器中，将毛细管的末端引入凝胶中，凝胶便被驱赶到毛细管中(通常在大气压的作用下)。

在一些实施方案中，可以将凝胶布置在卡盒中并且驱动到流体地连接至卡盒的毛细管中，以便于在样品分析之间更换毛细管中的凝胶。通常将卡盒设计为用于配置为接受它们的分析仪器中，例如配置为与gl1000聚糖分析仪((biopticinc.,newtaipeicity,taiwan,china)一起使用的凝胶筒，并且优选可以快速更换凝胶，从而加快一系列分析。通常，大批量地制备凝胶，分装到卡盒中，然后由意图使用该卡盒从业者购买，并在配置为安装所述卡盒的仪器中实施cge分离。

对于聚糖分析，适合的标记物包括apts和instantq^tm(prozyme,inc.,hayward,ca)。也可以使用ants(通常以8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐，水合钠盐，cas号5398-34-5的形式购买)以及用于聚糖的其他聚磺酸盐标记物。相信在用于标记感兴趣的分析物的标记物包含多个磺酸模块的情况下，结构1、结构2的化合物或其混合物在电泳分离中特别有用。

man-5聚糖与其他聚糖的分离

如前一部分所述，发酵罐中man5水平的变化可指示发酵反应中的压力，这样的压力可能导致有价值的治疗剂(比如某一种经fda批准为抗癌治疗剂的抗体)的一次生产运行全部损失。因此，确定系统中存在的man5的量已经具有重要意义。不幸的是，通过cge监测man5的量向来是一个难题，因为可能有其他聚糖在使用常规cge凝胶时与man5共迁移。当用apts标记聚糖时，与man5共迁移的聚糖是a1f、g0和g0f-n。当用instantq^tm标记聚糖时，与man-5聚糖共迁移的聚糖是g0f-n和a1f。如前一部分报告的，作为本公开基础的研究表明，当用apts标记man-5聚糖时，示例性季铵化合物thmh提高了man-5聚糖与其他紧密共迁移的聚糖的分离度。具体而言，在分离全过程中，apts标记的man-5聚糖的峰形得以保持，从而使man-5聚糖与g0f-n、g0和a1f的区分更容易。

未涂覆和涂覆的毛细管

如上所述，作为本公开基础的研究发现，在毛细管电泳全程中示例性季铵化合物thmh的存在引起一些难分离聚糖的分离度显著提高。由此可见，在分析物的ce分离中季铵化合物的存在是有利的，而且在感兴趣的分析物和与之共迁移的其他分析物原本难以区分的情况下，可以用来提高对样品中感兴趣的分析物的存在的分析能力。在一些优选实施方案中，所述季铵化合物是thmh。在一些优选实施方案中，所述分析物是聚糖，并且所使用的凝胶适合用于分析聚糖。

大多数现有的ce仪器被设计成在两次样品运行之间洗涤毛细管并将新鲜凝胶引入毛细管中。这样的洗涤称为“再生”或“调理”毛细管，在许多ce程序中被用于提高再现性。例如，在d.heiger,highperformancecapillaryelectrophoresis,anintroduction(agilenttechnologies,publication5968-9963e,germany,2000)(“heiger”)第92页指出，可以通过用强碱、强酸、有机化合物(比如甲醇或dmso)或洗涤剂洗涤毛细管然后用冲洗液洗涤，来调理毛细管。

虽然在两次运行之间通过洗涤来调理毛细管确实可以保持其分离度，但是当必须实施多次分析时，这种做法也增加了相当长的时间。洗涤、漂洗和用新鲜凝胶再充填毛细管的步骤是耗时的，可能导致完成分析所需的时间至少加倍。通过减少在每次运行之间调理毛细管的需求，省略或减少多次运行所需的时间，可能是理想的。

prozyme的gly-q^tm聚糖分析系统可以在每次运行之间无须调理毛细管的条件下提供可再现的结果。当将示例性季铵化合物thmh添加至系统中使用的凝胶时，显著提高了样品中标记的man5和原本会与之共迁移的其他标记的聚糖分离的能力。然而，在多次运行之后，这种能力下降了。通常，20-50次运行后，代表标记的聚糖的峰就会变宽并可能发生重叠，降低了将样品中标记的man5和与之紧密共迁移的其他标记聚糖分离的能力。

在作为本公开基础的研究中，用酸溶液(在研究中为乙酸)或低ph值溶液(在研究中为0.1mmes，2-(n-吗啉代)乙磺酸，ph为3.5)洗涤毛细管，然后用水漂洗，加入含有示例性季铵化合物的新鲜凝胶，保持了毛细管分离用作示例性分析物的聚糖的绝佳能力。不希望受理论的束缚，我们认为，在没有进行调理的情况下，在同一毛细管中实施多次分离后的分离度降低可能是由于季铵化合物的胺与毛细管壁之间的相互作用所致，而在调理毛细管之后，这种相互作用被消除。我们预期，当使用其他常规用于调理毛细管的试剂时，将获得相同的结果。因此，本发明的组合物和方法适用于在每次运行之间根据调理毛细管的标准方案洗涤毛细管的仪器。

虽然洗涤毛细管为使用thmh来提高man5与其他紧密迁移的聚糖的分离度提供了可能，但也降低了gly-q^tm聚糖分析系统通过省略用于分析的毛细管所需的调理时间来减少聚糖分析总时间的能力。为了减少当凝胶中存在thmh时调理毛细管的需要，采用了另一种策略。

在本节前面段落中报道的研究是使用其内部未涂覆的毛细管进行的。(如本领域技术人员所理解的那样，大多数——哪怕不是全部——的毛细管的外部都被涂覆以降低其脆性)。在其内部涂覆有许多涂层中的任何一种的毛细管是可商购的，通常用于防止分析物与壁相互作用。我们不知晓有涂层被用于改善诸如季铵化合物之类的凝胶添加物的性能。

在作为本公开基础的研究中，对涂覆有永久附着涂层的市售毛细管进行了改良以适用于该系统，并测试了当凝胶中存在示例性季铵化合物thmh时，涂层的存在是否影响分析物的分离度。该测试使用聚糖作为示例性分析物，使用难分离的聚糖man5作为期望与其他紧密迁移的聚糖分离的聚糖。所有测试的毛细管均从agilenttechnologies公司(santaclara,ca)获得。下面讨论的涂层名称是agilent在其网站上提到的那些涂层。

测试了五种不同类型的涂覆毛细管：涂覆有聚乙烯醇或“pva”、μsil-wax、db-1、μsil-dna或cep的毛细管。agilent网站将μsil-wax涂层描述为“一种改性的聚环氧乙烷亲水涂层”。db-1被描述为是二甲基聚硅氧烷。agilent网站将μsil-dna描述为一种专有的氟碳聚合物，并将cep描述为一种永久键合的聚合物涂层，其可遮蔽毛细管表面的硅烷醇官能并有助于防止样品吸附。

如以下实施例3所示，用聚乙烯醇或“pva”涂覆的毛细管显示对存在thmh时的聚糖分离度没有干扰，在多次运行样品和标准品，且各次运行之间没有调理的情况下，将man5与其他聚糖分离的能力没有下降。已发现测试的其他两种类型的涂覆的毛细管，即涂覆有μsil-wax或db-1的毛细管，未降低thmh-凝胶将man5与其他紧密迁移的聚糖分离的能力。虽然至本公开为止尚未在多次运行中测试这些涂层，但这些涂层中的任何一种都至少可以用于单次运行应用(例如，使用ce仪器，在每次运行之间洗涤毛细管并更换凝胶，如上所述)，并且也可能适于多次使用的应用。

测试的最后两种涂覆的毛细管，μsil-dna和“cep”，破坏了作为示例性分析物的聚糖的分离。因此，当感兴趣的分析物是聚糖时，涂覆有μsil-dna或cep的毛细管不是优选使用的。

在pva涂覆的毛细管中，或在其内部涂覆有其他防止分离度下降且本身不干扰分析物ce的涂层的毛细管中，能够在同一毛细管中进行分析物多次运行而没有分离度下降，因而能够避免多次运行中的调理步骤。这使得实施分析物分析的时间减少了至少一半，相比于依赖每次运行之间重新调理毛细管来提高再现性的现有仪器和方案，提供了显著优势。

可以容易地测试用作为本公开基础的研究中所测试的之外的任何特定涂层涂覆在其内部的毛细管，以确定该涂层是否防止任何特定的季铵化合物或此类化合物的混合物的分离度下降，并且本身不干扰感兴趣的分析物的ce。例如，可以将两个毛细管(其中一个涂覆有感兴趣的涂层而另一个未涂覆)用包含特定的讨论中的季铵化合物或其混合物的相同凝胶充填，注入用可检测标记物标记的感兴趣的分析物(例如，用apts标记的man5)以及其他分析物(也用可检测标记物标记，预期与感兴趣的分析物紧密共迁移，例如g0f-n和a1f)，进行电泳，由此实施运行并确定(a)经过第一次运行，与未涂覆的毛细管中的分析物的分离度相比，涂层的存在对将感兴趣的分析物与预期与之共迁移的其他分析物分离的能力是否有不利影响，如果没有，则第二，(b)进行多次这样的运行，如5次运行、10次运行、15次运行、20次运行、50次运行、75次运行、100次运行、150次运行或200次运行，在每次运行之间不调理毛细管，并分析经过期望的运行数之后该涂层是否防止了分离度的下降，与仅在较小运行数中防止下降的涂层相比，在更多次运行中防止分离度下降的涂层是更优选的。如上所述，当在运行之间无调理的毛细管中测试时，pva涂覆的毛细管在200多次运行中未显示出分离度下降，是特别优选的。

试剂盒

在一些实施方案中，可以将本发明的凝胶提供在用于进行毛细管电泳的试剂盒中。试剂盒可包括：容纳有适合进行ce的凝胶的容器，所述凝胶包含结构1的化合物、结构2的化合物、或具有结构1和结构2的一种或多种化合物的混合物；以及容纳有适合在进行ce中使用的缓冲液的容器。在优选实施方案中，具有结构1、结构2或两者的一种或多种化合物以0.05％wt/wt至0.5％wt/wt的浓度(或总浓度，如果存在多于一种这样的化合物的话)存在，更优选为0.075％wt/wt至0.150％wt/wt。适合的缓冲剂，如mes，在本领域中是熟知的。在一些实施方案中，容纳凝胶的容器可以是配置成将凝胶引入到一种或多种毛细管中的卡盒，或者可以是一个毛细管或多个毛细管。一种或多种毛细管在其内部可以涂覆有不干扰感兴趣的分析物的ce的涂层，并且优选是防止分析物分离度的改善在多次运行(比如50、100、200次运行)之后下降的涂层。在一些优选实施方案中，涂层可以是聚乙烯醇。

实施例

实施例1

本实施例给出了在附图中演示的研究中用于聚糖样品的ce分离的方案。该方案中列出的商标试剂和仪器是prozyme公司(hayward,ca)的产品。

所有样品均使用市售试剂盒用apts或instantq^tm标记。使用以下器材在gly-q^tm聚糖分析系统上进行实验：

a.分离毛细管-在每个实验中使用以下三者之一：

i.gly-q^tmg1卡盒(标准凝胶，使用未涂覆的毛细管)；

ii.gly-q^tmg1卡盒(与(i)相同的凝胶，但以0.1％wt/wt添加thmh，使用未涂覆的毛细管)，或

iii.gly-q^tmg1卡盒(与(i)相同的凝胶，但添加thmh，使用pva涂覆的毛细管)。

b.分离缓冲液：gly-q^tm分离缓冲液

c.校准标准品：gly-q^tmgu阶梯

d.校准标准品注入：2kv，持续2秒

e.迁移标准品：gly-q^tm迁移标准品(上和下)

f.迁移标准品注入：2kv，持续2秒

g.样品注入：2kv，持续2秒

h.分离：10kv，持续120秒

使用gly-q^tmmanager软件进行数据分析。结果以葡萄糖单位(gu)值表示。

为了校准的目的，所有分析均以校准标准品的注入(“注入1”)开始。因此，在所有研究中，“注入2”是感兴趣的样品的首次注入和分析。

实施例2

本实施例提供了下述研究的结果：该研究比较了当使用通常与gly-q^tmg1卡盒配售的凝胶、以及当使用加入了0.1％的示例性季铵化合物thmh的此类凝胶时，man5与紧密共迁移的聚糖a1f和gof-n的分离度。

又称依那西普，是一种抑制肿瘤坏死因子的融合蛋白生物制剂，其在美国已获准用于治疗几种形式的关节炎。通过酶消化从依那西普释放出聚糖，用apts标记，然后进行ce。图1a是显示释放的标记聚糖在与gly-q^tmg1卡盒配售的凝胶上分离的电泳图。箭头指向包含man5、a1f和g0f-n的峰，后两者是另外两种与man5紧密共迁移的聚糖。可见，此凝胶中的ce未导致man5与其他紧密共迁移的聚糖分离。图1b是显示使用相同试剂，但其中凝胶还包含0.1％的示例性季铵化合物thmh，在相同平台上的相同apts标记聚糖的分离度的电泳图。如图1b中箭头所示，apts标记的man5的峰与alf和g0f-n的峰分开了。

实施例3

本实施例提供了两个电泳图，比较了通过酶消化从人igg释放、且用染料instantq^tm标记的聚糖在内部涂覆有聚乙烯醇的毛细管中ce后的分离度。

图2a是显示从人igg中释放的instantq^tm标记的聚糖在样品首次注入pva涂覆的毛细管中后的分离情况的电泳图，该毛细管中装载有添加了0.1％wt/wt的示例性季铵化合物thmh的标准凝胶(由于首次注入是阶梯标准品的注入，因此将该注入标记为“注入2”)。

图2b是显示从人igg释放的instantq^tm标记的聚糖在相同pva涂覆的毛细管中的相同样品，在又经过历时四天的234次分离之后的分离情况(如上所述，由于首次注入是阶梯标准品的注入，因此本次注入标记为“注入235”)，所述分离包括用不同的标记物标记的聚糖和另外的阶梯标准品的分离。在每次注入和电泳之后，在毛细管中装载新鲜凝胶，但在图2a中显示的运行和图2b中显示的运行之间的234运行中，在任何两次之间均未进行调理。图2a和2b的比较显示，虽然两个电泳图中某些峰的高度发生了变化，但每个组分的峰仍然清晰可辨。可见，在毛细管中使用pva涂层，可以为使用包含示例性季铵化合物的凝胶实施的聚糖分离提供优秀的再现性，而无需在每次分离之间调理毛细管，也省去了这两次分离之间调理毛细管超过200次所需的时间。

可以理解的是，在本文中描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，本领域技术人员有动机根据它们进行各种修改或改变，这些修改或改变将被包括在本申请的内涵和外延之内，并落入所附权利要求书的范围。将本文中引用的所有出版物、专利和专利申请通过提述完整并入本文用于所有目的。