来源于根瘤菌种细菌的纳米囊泡及其用途的制作方法

本发明涉及来源于根瘤菌属(genusrhizobium)的细菌的纳米囊泡及其用途，更具体地，涉及通过使用来源于根瘤菌属的细菌的纳米囊泡来诊断胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的方法，以及包含所述囊泡的用于预防、减轻或治疗所述疾病的组合物。

背景技术：

自21世纪初以来，在过去被认为是流行病的急性传染病已变得不那么重要，而由于人类与微生物群落之间的不和谐而导致的伴随免疫功能障碍的慢性炎性疾病已经改变疾病模式，成为决定生活质量和人类寿命的主要疾病。作为21世纪的顽固性慢性疾病，癌症、心血管疾病、慢性肺部疾病、代谢性疾病和神经精神疾病已成为国家公共卫生的重要问题，成为决定人类寿命和生活质量的主要疾病。尤其是，这些顽固性慢性疾病的特征是伴随由病因引起的不正常免疫功能的慢性炎症。

众所周知，人体中共存的微生物数量已达到100万亿，是人体细胞数量的10倍，微生物基因数量是人体基因数量的100倍以上。微生物群或微生物组是指微生物群落，包括存在于给定栖息地中的细菌，古细菌和真核生物。

我们体内共存的细菌和周围环境中存在的细菌会分泌纳米大小的囊泡，以便与其他细胞交换有关基因、低分子化合物、蛋白质等的信息。粘膜形成物理防御膜，尺寸为200纳米(nm)或更大的颗粒无法通过该物理防御膜，因此，共存于粘膜中的细菌不能通过粘膜，但来源于细菌的囊泡的大小为100纳米或更小并通过粘膜相对自由地穿过上皮细胞后被吸收到我们体内。由细菌局部分泌的来源于细菌的囊泡经粘膜上皮细胞吸收，从而引起局部炎症反应，而穿过上皮细胞的囊泡经淋巴管系统吸收，从而分布在各个器官中，并且免疫和炎性反应在分布有囊泡的器官中受到调节。例如，来源于诸如大肠杆菌的致病性革兰氏阴性细菌的囊泡局部引起结肠炎，并且在被吸收到血管中时，通过血管内皮炎症反应促进全身性炎症反应和血液凝固，以及在被吸收到胰岛素作用肌细胞中时引起胰岛素耐受性和糖尿病。另一方面，来源于有益细菌的囊泡可通过控制由致病性囊泡引起的免疫功能障碍和代谢功能障碍来控制疾病。

作为对来源于细菌的囊泡等因子的免疫应答，以白介素(以下称il)-17细胞因子的分泌为特征的th17免疫应答发生，并且在暴露于来源于细菌的囊泡时分泌il-6，从而诱导th17免疫应答。由th17免疫应答引起的炎症的特征在于嗜中性粒细胞浸润，并且在发生炎症的过程中，从炎症细胞(如巨噬细胞)分泌的肿瘤坏死因子-α(以下称为tnf-α)起着重要的作用。

根瘤菌属的细菌是革兰氏阴性细菌，其从土壤中吸收氮，并且将大气中的氮转化为氨，同时在豆类等的根中共生，然后向植物提供例如谷氨酰胺之类的氮化合物。然而，尚未报道根瘤菌属的细菌在细胞外分泌囊泡，特别是没有报道将这种细菌用于难治性疾病，例如癌症、神经疾病或代谢性疾病的诊断和治疗的案例。

技术实现要素：

【技术问题】

通过进行认真研究以解决上述常规问题的结果，发明人证实，通过宏基因组分析，与正常个体相比，在来源于患有胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病和痴呆症的患者的样品中，来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的含量显著降低，从而诊断疾病。此外，已经证实，当从豆科根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)中分离出囊泡以处理巨噬细胞时，由致病性囊泡引起的il-6和tnf-α分泌被显著抑制。因此，完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种提供用于诊断胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的信息的方法。

此外，本发明的另一个目的是提供用于预防、减轻或治疗胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的组合物，其包含作为活性成分的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡。

然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员根据以下描述可以清楚地理解未提及的其他问题。

【技术方案】

为了实现上述本发明的目的，本发明提供了一种提供用于诊断胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取dna；

(b)使用基于在16srdna中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述dna进行聚合酶链式反应(pcr)以获得每种pcr产物；以及

(c)通过对所述pcr产物的定量分析将其中来源于所述根瘤菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况分类为胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症。

另外，本发明提供了一种诊断胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取dna；

(b)使用基于在16srdna中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述dna进行聚合酶链式反应(pcr)以获得每种pcr产物；以及

(c)通过对所述pcr产物的定量分析将其中来源于所述根瘤菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况确定为胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症。

作为本发明的一个示例性实施方案，步骤(a)中的样品可以是血液或尿液。

作为本发明的另一个实施方案，步骤(b)中的成对的引物可以是seqidno.1和seqidno.2的引物。

此外，本发明提供了用于预防或治疗胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的药物组合物，其包含作为活性成分的来源于所述根瘤菌属的细菌的囊泡。

另外，本发明提供了一种用于预防或减轻胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的食品组合物，其包含作为活性成分的来源于所述根瘤菌属的细菌的囊泡。

此外，本发明提供了一种预防或治疗胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的药物组合物，该方法包括以下步骤：向受试者施用包含作为活性成分的来源于所述根瘤菌属的细菌的囊泡的药物组合物。

此外，本发明提供了来源于所述根瘤菌属的细菌的囊泡在预防或治疗胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症中的用途。

在本发明的又一实施方案中，囊泡的平均直径可以为10至200nm。

在本发明的另一个实施方案中，囊泡可以从根瘤菌属的细菌中天然或人工地分泌。

在本发明的另一个实施方案中，来源于根瘤菌属的细菌的囊泡可以是来源于豆科根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)的囊泡。

【有益效果】

发明人证实肠道细菌不会通过上皮细胞吸收到体内，但是来源于细菌的囊泡会被吸收，全身分布，然后通过肾脏、肝脏和肺部排泄出体内，以及通过对来源于在患者的血液或尿液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析，也证实了与正常个体相比，来源于在患有胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病和痴呆症的患者的临床样品(例如血液或尿液)中存在的根瘤菌属的细菌的囊泡明显减少。另外，当体外培养作为根瘤菌属的一种细菌的豆科根瘤菌以分离囊泡，然后将所述囊泡体外施用于炎性细胞时，证实了由致病性囊泡介导的炎症介质的分泌被显著抑制。因此，预期来源于根据本发明的根瘤菌属的细菌的囊泡可有效地用于诊断胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的方法，以及用于预防、减轻或治疗这些疾病的组合物。

附图说明

图1a是在对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡(ev)之后按时间捕获细菌和来源于细菌的囊泡(ev)的分布模式的一系列照片，并且图1b是通过在口服施用细菌和囊泡后12小时收集血液、肾脏、肝脏和各种器官来评估细菌和囊泡的体内分布模式的结果。

图2是在对胃癌患者和正常个体的尿液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图3是在对结肠癌患者和正常个体的尿液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图4是在对乳腺患者和正常个体的尿液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图5是在对卵巢癌患者和正常个体的尿液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图6是在对膀胱癌患者和正常个体的尿液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图7是在对前列腺癌患者和正常个体的尿液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图8是在对哮喘患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图9是在对糖尿病患者和正常个体的尿液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图10是在对帕金森氏病患者和正常个体的尿液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图11是在对痴呆症患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布的结果。

图12是在诸如大肠杆菌ev之类的病原性囊泡的处理之前通过来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的预处理评估对由大肠杆菌ev引起的炎性介质il-6和tnf-α分泌的影响，以评估来源于豆科根瘤菌的囊泡的抗炎和免疫调节作用(nc：阴性对照；pc：阳性对照，大肠杆菌ev1μg/ml；lp_1.0：植物乳杆菌ev1.0μg/ml；rl_0.1，1.0，10：豆科根瘤菌ev0.1，1.0，10μg/ml)的结果。

具体实施方式

本发明涉及来源于根瘤菌属的细菌的囊泡及其用途。

发明人通过宏基因组分析证实了，与正常个体相比，在从患有胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病和痴呆症的患者获得的临床样品中，来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少，从而诊断出疾病。另外，通过从豆科根瘤菌分离囊泡并分析其特性，证实了该囊泡可使用于预防、减轻或治疗诸如胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症之类的疾病的组合物。

因此，本发明提供了一种提供用于诊断胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的信息的方法，该方法包括以下步骤：

(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取dna；

(b)使用基于在16srdna中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述dna进行聚合酶链式反应(pcr)以获得每种pcr产物；以及

(c)通过对所述pcr产物的定量分析将其中来源于所述根瘤菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况确定为胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症。

如本文所使用的，术语“诊断”是指广义上在所有方面确定患者的疾病状况。确定的内容是疾病的实体、病因、发病机理、严重程度、疾病的详细方面、是否存在并发症、预后等。本发明中的诊断是指确定胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病和/或痴呆症是否发生，疾病的程度等。

如本文所使用的，术语“纳米囊泡”或“囊泡”是指由从各种细菌分泌的纳米尺寸的膜组成的结构。来源于革兰氏阴性细菌的囊泡或外膜囊泡(omv)具有内毒素(脂多糖)、毒性蛋白、细菌dna和rna，以及来源于革兰氏阳性细菌的囊泡除了蛋白质和核酸之外还具有肽聚糖和脂磷壁酸，它们是细菌的细胞壁成分。在本发明中，纳米囊泡或囊泡是由根瘤菌属的细菌天然分泌的或人工产生的，呈球形，平均直径为10至200nm。

如本文所使用的，术语“宏基因组”还指微生物组，并且是指在诸如土壤和动物肠等独立区域中的包括所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且通常用作基因组的概念，解释通过使用序列分析仪一次鉴定大量微生物以分析未培养的微生物(uncultivatedmicroorganisms)。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指一种混合基因组，作为一种环境单位的所有物种的基因组。当在组学生物学的发展过程中定义一个物种时，该宏基因组就是从形成完整物种的观点衍生的术语，它是由各种彼此相互作用的物种以及一种功能上存在的物种形成的。从技术上讲，宏基因组是技术的目标，该技术通过快速序列分析方法，通过分析无论物种的所有dna和rna来识别一个环境中的所有物种，并研究相互作用和代谢。

在本发明中，样品可以是血液或尿液，但不受限于此。

作为本发明的另一方面提供了用于预防、治疗或减轻胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的组合物，其包含作为活性成分的来源于所述根瘤菌属的细菌的囊泡。该组合物包括食品组合物和药物组合物，并且在本发明中，食品组合物包括健康功能性食品组合物。本发明的组合物可以是口服喷雾剂或吸入剂。

如本文所使用的，术语“预防”是指抑制胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病、痴呆症和/或类似疾病或者通过施用根据本发明的组合物来延迟其发作的所有行为。

如本文所使用的，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物来减轻或有益地改变胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病、痴呆症和/或类似疾病的症状的所有行为。

如本文所使用的，术语“减轻”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数(例如症状的程度)的所有行为。

可通过使用选自离心、超高速离心、高压处理、挤出、超声处理、细胞裂解、均质化、冷冻-解冻、电穿孔、机械分解、化学处理、通过过滤器的过滤、凝胶过滤色谱、自由流动电泳和毛细管电泳的一种或多种方法，从包含根瘤菌属的细菌的培养液中分离囊泡。此外，可以进一步包括诸如用于去除杂质的洗涤和对所获得的囊泡的浓缩之类的过程。

本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且包括生理盐水(saline)、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但不受限于此，并且如果需要，还可包括其他典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等将组合物配制成可注射的制剂，例如水溶液、悬浮液和乳剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，可以优选地通过使用remington’sliterature(雷明顿文献)中公开的方法根据每种成分来配制组合物。本发明的药物组合物的制剂没有特别限制，但可以配制成注射剂、吸入剂、皮肤外用剂、口服剂等。

本发明的药物组合物可以根据所期望的方法口服施用或可肠胃外施用(例如静脉内、皮下、皮内、鼻内或气管内施用)，并且剂量可以根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物制剂以及给药途径和持续时间而变化，但是可以由本领域普通技术人员适当地选择。

根据本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，药学有效量是指足以以适用于医疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据包括患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物的因素，以及其他医学领域众所周知的因素确定。根据本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，可以与相关技术中的治疗剂顺序或同时施用，并且可以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以可以在没有任何副作用的情况下获得最大效果的最小量施用组合物，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。

具体而言，根据本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别和体重而变化，并且通常是每1千克体重施用0.001至150mg该组合物，优选每1千克体重施用0.01至100mg该组合物，可以每天或隔天给药，或者每天给药一次至三次。然而，由于剂量可以根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重或年龄而增加或减少，因此上述剂量并不旨在以任何方式限制本发明的范围。

本发明的食品组合物包括保健功能食品组合物。根据本发明的食品组合物可以通过将活性成分原样添加到食品中来使用，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，但是可以根据典型方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或减轻)适当地确定。通常，当制备食品或饮料时，基于原料计，本发明的组合物的添加量为15重量％以下，优选为10重量％以下。但是，对于出于健康和卫生目的或出于健康控制目的而长期摄入时，所述量可能少于上述范围。

除了本发明的食品组合物包含指定比例的活性成分作为必要成分之外，其他成分没有特别限制，并且本发明的食品组合物可包含各种调味剂、天然碳水化合物等，如同典型的饮料一样，作为附加成分。上述天然碳水化合物的实例包括常规的糖，例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除了上述调味剂以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(甜蛋白(thaumatin)，甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙a、甘草甜素等)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择适当地确定。

除了所述添加剂之外，本发明的食品组合物还可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独使用或以其组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域普通技术人员适当地选择。

在本发明的一个实施方案中，通过对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡并观察该细菌和囊泡的体内吸收、分布和排泄模式，证实了，尽管细菌不是通过肠粘膜吸收的，但是来源于细菌的囊泡在给药后5分钟内被吸收并全身分布，且通过肾脏、肝脏等排泄(参见实施例1)。

在本发明的另一实施方案中，通过使用从正常个体的血液或尿液中分离的囊泡进行细菌宏基因组分析，所述正常个体的年龄和性别与患有胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病和痴呆症的患者匹配。结果证实，与正常个体的样品相比，在患有胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病和痴呆症的患者的临床样品中，来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见实施例3至12)。

在本发明的另一实施方案中，培养了豆科根瘤菌以评估从其分泌的囊泡是否具有免疫调节和抗炎作用，并且通过评估在用不同浓度的来源于豆科根瘤菌的囊泡处理巨噬细胞后，经由作为炎性疾病致病因子的大肠杆菌(e.coliev)的处理来评估炎症介质的分泌，证实了由大肠杆菌囊泡(e.coliev)引起的il-6和tnf-α的分泌被来源于豆科根瘤菌的囊泡有效地抑制(参见实施例13)。

在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。

实施例

实施例1.肠道细菌和来源于细菌的囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析

为了评估肠道细菌和来源于细菌的囊泡是否通过胃肠道被全身吸收，用以下方法进行实验。将50μg剂量的带有荧光标记的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡中的每种通过胃肠道施用至小鼠的胃，并在0分钟、5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠的整个图像的结果，如图1a所示，细菌不被全身吸收，但是在给药后5分钟，来源于细菌的囊泡被全身吸收，并且在给药后3小时在膀胱中观察到强烈荧光，从而可以看出囊泡是排泄到泌尿道。此外，可以看出，囊泡在体内存在直至给药后12小时。

此外，为了评估其中的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡被全身吸收后渗透到各个器官中的模式，以与上述相同的方式施用50μg带有荧光标记的细菌和来源于细菌的囊泡，然后在给药12小时后收集尿液、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪和肌肉。作为观察到的在收集的组织中的荧光的结果，如图1b所示，可以看出来源于细菌的囊泡分布在尿液、心脏、肺、肝、脾、脂肪、肌肉和肾中，但是细菌没有被吸收。

实施例2.临床样品中来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析

在首先将临床样品(例如尿液和血液)放入10ml试管中，并且通过离心(3,500×g，10分钟，4℃)使悬浮物沉降后，仅将上清液转移至新的10ml试管。使用0.22-μm的过滤器除去细菌和杂质后，将它们转移到centriprep管(离心过滤器50kd)中，并在1,500×g和4℃下离心15分钟，弃去小于50kd的物质，将残余物浓缩至10ml。使用0.22-μm的过滤器再次除去细菌和杂质后，通过使用90ti型转子在150,000×g和4℃下进行超高速离心3小时，弃去上清液，并将聚集的团块(pellet)溶解在生理盐水(pbs)中。

将通过上述方法分离的100μl囊泡在100℃下煮沸，从脂质中提取内部dna，然后在冰上冷却5分钟。然后，为了除去残留的悬浮物，将dna在10,000×g和4℃下离心30分钟，仅收集上清液。并且，通过使用nanodrop定量dna的量。此后，为了确认提取的dna中是否存在来源于细菌的dna，用下表1所示的16srdna引物进行pcr，并确认提取的基因中存在来源于细菌的基因。

[表1]

使用16srdna引物对通过上述方法提取的dna进行扩增，然后进行测序(illuminamiseq测序仪)，结果以标准流程图格式(sff)文件输出，使用gsflx软件(v2.9)将sff文件转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量评分文件，然后确认用于阅读的可靠性估计，并且其中窗口(20bps)的平均碱基检出准确性低于99％的部分(phred分数<20)已删除。对于操作分类单元(otu)分析，通过使用uclust和usearch根据序列相似性进行聚类，属、科、目、纲和门分别基于94％、90％、85％、80％和75％的序列相似性进行聚类，在每个out的门、纲、目、科和属级上进行分类，并使用blastn和greengenes(qiime)的16srna序列数据库(108,453个序列)对在该属级上具有97％或更高的序列相似性的细菌进行分析。

实施例3.胃癌患者的尿液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从61例胃癌患者和120例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的尿液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述尿液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的尿液相比，在来自胃癌患者的尿液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表2和图2)。

[表2]

实施例4.结肠癌患者的尿液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从38例结肠癌患者和38例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的尿液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述尿液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的尿液相比，在来自结肠癌患者的尿液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表3和图3)。

[表3]

实施例5.乳腺癌患者的尿液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从127例乳腺癌患者和220例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的尿液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述尿液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的尿液相比，在来自乳腺癌患者的尿液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表4和图4)。

[表4]

实施例6.卵巢癌患者的尿液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从135例卵巢癌患者和136例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的尿液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述尿液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的尿液相比，在来自卵巢癌患者的尿液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表5和图5)。

[表5]

实施例7.膀胱癌患者的尿液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从42例膀胱癌患者和107例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的尿液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述尿液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的尿液相比，在来自膀胱癌患者的尿液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表6和图6)。

[表6]

实施例8.前列腺癌患者的尿液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从55例前列腺癌患者和159例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的尿液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述尿液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的尿液相比，在来自前列腺癌患者的尿液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表7和图7)。

[表7]

实施例9.哮喘患者的血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从160例哮喘患者和114例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自哮喘患者的血液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表8和图8)。

[表8]

实施例10.糖尿病患者的尿液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从60例糖尿病患者和134例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的尿液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述尿液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的尿液相比，在来自糖尿病患者的尿液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表9和图9)。

[表9]

实施例11.帕金森氏病患者的尿液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从39例帕金森氏病患者和76例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的尿液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述尿液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的尿液相比，在来自帕金森氏病患者的尿液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表10和图10)。

[表10]

实施例12.痴呆症患者的血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析

从60例痴呆症患者和74例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液样品中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于根瘤菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自痴呆症患者的血液中的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表11和图11)。

[表11]

实施例13.来源于豆科根瘤菌的囊泡的抗炎作用

根据以上实施例的结果，培养了属于根瘤菌属的豆科根瘤菌菌株，然后分离了其囊泡。在脑心浸液(bhi)培养基中培养豆科根瘤菌菌株，直至在37℃的厌氧室中的吸光度(od600)达到1.0至1.5，然后继代培养。之后，收集不含菌株的培养基上清液，在10,000g和4℃下离心15分钟，然后通过0.45-μm过滤器过滤。由此获得的上清液使用quixstand台式系统(gehealthcare，英国)用100kda中空滤膜，通过超滤浓缩至200ml的量。随后，将浓缩的上清液再次用0.22-μm的过滤器过滤，并在150,000g和4℃下超速离心3小时，然后将团块悬浮在dpbs中。然后，使用10％、40％和50％的optiprep溶液(axis-shieldpocas，挪威)进行密度梯度离心，并且为了制备低密度溶液，在使用之前，将optiprep溶液用hepes缓冲盐水(20mmhepes，150mmnacl，ph7.4))稀释。在200,000g和4℃的条件下离心2小时后，将以1ml的等体积从顶层分馏的每种溶液在150,000g和4℃的条件下另外超速离心3小时。之后，使用双辛可宁酸(bca)测定法对蛋白质进行定量，并对如上所述获得的囊泡进行实验。

为了检查来源于豆科根瘤菌的囊泡对炎症细胞分泌炎症介质的作用，用来源于豆科根瘤菌的囊泡以不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)处理小鼠巨噬细胞系(raw264.7细胞)，并且通过处理来源于大肠杆菌(e.coliev)的囊泡(其是炎性疾病发病机理的囊泡)来测量炎症介质(il-6和tnf-α)的分泌量。更具体地说，将raw264.7细胞以每孔1×10⁵的密度接种到24孔细胞培养板中，并在dmem中孵育24小时。之后，将培养上清液收集在1.5ml试管中，以3000g离心5分钟，从而收集上清液。将上清液在4℃下保存，然后进行elisa。结果，当对来源于豆科根瘤菌的囊泡进行预处理时，证实了由大肠杆菌ev导致的il-6和tnf-α的分泌被显著抑制(参见图12)。该结果表明由致病性囊泡(如来源于大肠杆菌的囊泡)诱导的炎性反应能被来源于豆科根瘤菌的囊泡有效地抑制。

提供本发明的上述描述是出于说明的目的，并且本发明所属领域的普通技术人员应理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面仅进行了说明，而不是限制性的。

【工业适用性】

由于根据本发明的来源于根瘤菌属的细菌的囊泡可用于诊断胃癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、哮喘、糖尿病、帕金森氏病或痴呆症的方法以及用于预防、减轻或治疗所述疾病的组合物，预期它们将有效地用于相关的医学领域和食品工业领域中。

<110>md保健株式会社

<120>来源于根瘤菌种细菌的纳米囊泡及其用途

<130>mpo20-050cn

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<151>2018-02-28

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<213>人工序列（artificialsequence）

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