分解含反式脂肪酸油脂的新型脂肪酶

1.本公开涉及分解含反式脂肪酸油脂的新型脂肪酶、和其应用(例如排水处理、油处理)。在另一方式中，本公开涉及在高温下也能分解油脂的新型脂肪酶和其应用。


背景技术：

2.作为普通家庭、餐饮业、工业用设备等所产生的污垢的代表例子，可列举油垢。油垢是产生于厨房、水槽、厨房、管道、排水沟、换气扇、洗涤等场景中的难以洗涤的污垢。油垢成为恶臭、害虫的产生源，还可能引起环境污染，因此从公共卫生和环境这两方面都迫切希望建立油处理中的革命性技术。
3.考虑到通过固液分离来除去餐饮业的厨房排水中包含的油分的处理设备即油脂捕集器是恶臭、害虫的产生源、并且所分离出的油的回收和运输、清洗等维护中需要花费体力和成本等，以餐饮业为首的业界迫切希望建立一种使油脂捕集器内的油消失的革命性技术。


技术实现要素：

4.用于解决问题的方案
5.本发明的发明人们进行了深入研究，结果发现了分解含反式脂肪酸油脂的脂肪酶。还发现该脂肪酶具有在高温下也能分解油脂的能力、热稳定性优异。本公开还涉及本公开的脂肪酶的应用、例如油处理等。
6.因此，本公开提供以下方案。
7.(项目1)
8.一种多肽，其为：
9.(a)包含序列号4、11、16或18所示的氨基酸序列的多肽；
10.(b)包含在(a)的氨基酸序列中含有1个以上氨基酸的置换、添加、缺失或它们的组合的氨基酸序列且具有生物学活性的多肽；
11.(c)与(a)或(b)所示的氨基酸序列具有至少70％以上的序列同一性、且具有生物学活性的多肽；
12.(d)包含由序列号1、7、15或17所示的核酸序列编码的氨基酸序列的多肽；
13.(e)由在(d)所示的核酸序列中含有1个以上核苷酸的置换、添加、缺失或它们的组合的核酸序列编码且具有生物学活性的多肽；
14.(f)由与(d)或(e)所示的核酸序列具有至少70％以上的序列同一性的核酸序列编码且具有生物学活性的多肽；
15.(g)由与包含(d)～(f)中的任一者所示的核酸序列或其互补序列的多核苷酸在严谨条件下发生杂交的核酸序列编码且具有生物学活性的多肽；
16.(h)由(d)～(g)中的任一核酸序列的等位基因突变体编码且具有生物学活性的多肽；或
17.(i)包含(a)～(h)所示的氨基酸序列的片段的多肽。
18.(项目2)
19.根据项目1所述的多肽，其中，上述生物学活性为与同化含反式脂肪酸油脂有关的能力、或分解含反式脂肪酸油脂的能力。
20.(项目3)
21.根据项目1或2所述的多肽，其中，45～70℃为分解油脂的能力的最适温度。
22.(项目4)
23.根据项目1～3中任一项所述的多肽，其中，35～55℃为分解油脂的能力的最适温度。
24.(项目5)
25.根据项目1～4中任一项所述的多肽，其在65℃以上且优选85℃以下具有热稳定性。
26.(项目6)
27.根据项目1～5中任一项所述的多肽，其在75℃以上且优选80℃以下具有热稳定性。
28.(项目7)
29.根据项目1～6中任一项所述的多肽，其在15℃具有分解油脂的能力。
30.(项目8)
31.根据项目1～7中任一项所述的多肽，其为来自森林伯克霍尔德菌(burkholderia arboris)的多肽。
32.(项目9)
33.一种多核苷酸，其为：
34.(a)包含序列号1、7、15或17所示的核酸序列的多核苷酸；
35.(b)包含在(a)所示的核酸序列中含有1个以上核苷酸的置换、添加、缺失或它们的组合的核酸序列的多核苷酸；
36.(c)包含与(a)或(b)所示的核酸序列具有至少70％以上的序列同一性的核酸序列、且编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸；
37.(d)包含与含有(a)～(c)中的任一者所示的核酸序列或其互补序列的多核苷酸在严谨条件下发生杂交的核酸序列、且编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸；
38.(e)作为(a)～(d)中的任一核酸序列的等位基因突变体的编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸；或
39.(f)编码包含序列号4、11、16或18所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
40.(g)编码包含在(f)的氨基酸序列中含有1个以上氨基酸的置换、添加、缺失或它们的组合的氨基酸序列、且具有生物学活性的多肽的多核苷酸；
41.(h)编码与(f)或(g)所示的氨基酸序列具有至少70％以上的序列同一性、且具有生物学活性的多肽的多核苷酸；或
42.(i)包含(f)～(h)所示的核酸序列的片段的多核苷酸。
43.(项目10)
44.根据项目9所述的多核苷酸，其中，上述生物学活性为与同化含反式脂肪酸油脂有
关的能力、或分解含反式脂肪酸油脂的能力。
45.(项目11)
46.根据项目9或10所述的多核苷酸，其编码45～70℃为分解油脂的能力的最适温度的多肽。
47.(项目12)
48.根据项目9～11中任一项所述的多核苷酸，其编码35～55℃为分解油脂的能力的最适温度的多肽。
49.(项目13)
50.根据项目9～12中任一项所述的多核苷酸，其编码在65℃以上且优选85℃以下具有热稳定性的多肽。
51.(项目14)
52.根据项目9～13中任一项所述的多核苷酸，其编码在75℃以上且优选80℃以下具有热稳定性的多肽。
53.(项目15)
54.根据项目9～14中任一项所述的多核苷酸，其中，上述多核苷酸编码在15℃时具有分解油脂的能力的多肽。
55.(项目16)
56.根据项目9～15中任一项所述的多核苷酸，其为来自森林伯克霍尔德菌(burkholderia arboris)的多核苷酸。
57.(项目17)
58.一种细胞或无细胞表达系统，其包含项目9～16中任一项所述的多核苷酸。
59.(项目18)
60.一种油分解剂，其包含：项目1～8中任一项所述的多肽、包含项目9～16中任一项所述的多核苷酸的细胞或无细胞表达系统、或项目17所述的细胞或无细胞表达系统。
61.(项目19)
62.根据项目18所述的油分解剂，其还包含油处理成分。
63.(项目20)
64.一种用于分解油的试剂盒，其具备：项目1～8中任一项所述的多肽、或包含项目9～16中任一项所述的多核苷酸的细胞或无细胞表达系统、或项目17所述的细胞或无细胞表达系统、或项目18所述的油分解剂；以及进一步的油处理成分。
65.(项目21)
66.一种油分解除去方法，其包括：使项目1～8中任一项所述的多肽、或包含项目9～16中任一项所述的多核苷酸的细胞或无细胞表达系统、项目17所述的细胞或无细胞表达系统、或项目18或19所述的油分解剂作用于处理对象。
67.(项目22)
68.根据项目21所述的方法，其中，上述处理对象包含反式脂肪酸或含反式脂肪酸油脂。
69.(项目23)
70.一种清洗剂，其包含：项目1～8中任一项所述的多肽、包含项目9～16中任一项所
述的多核苷酸的细胞或无细胞表达系统、或项目17所述的细胞或无细胞表达系统。
71.(项目24)
72.项目1～8中任一项所述的多肽、或包含项目9～16中任一项所述的多核苷酸的细胞或无细胞表达系统、项目17所述的细胞或无细胞表达系统、或项目18或19所述的油分解剂在脂肪改性/油脂生产技术(酯交换等)中的应用。
73.本公开中，意图使上述1或多个特征不仅能够以明示的组合方式来提供、还能够以另外的组合方式来提供。若根据需要阅读并理解以下的详细说明，则本领域技术人员将认识到本公开另一实施方式和优点。
74.发明的效果
75.使用本公开的脂肪酶，以往难以除去的含反式脂肪酸油脂的处理将变得容易。另外，实现了在以往无法使用微生物、酶的高温环境下、低温环境下均能够进行油脂除去、油处理。因此，本公开的新型脂肪酶在清洗剂、皮革工业、食品工业、净化受到油脂污染的环境、厨余垃圾处理、堆肥化处理、排水处理等废弃物处理和堆肥化、助消化药等药品、用于油性皮肤的化妆品等技术领域中是有用的。
附图说明
76.图1示出添加油脂时的、编码本公开的脂肪酶的基因的表达水平。在包含三油酸甘油酯、油酸、反油酸或三反油酸甘油酯的无机盐培养基中、在28℃下培养kh
‑
1株6小时后，从kh
‑
1株中提取rna，通过定量rt
‑
pcr对本公开的脂肪酶基因的表达水平进行定量。ole表示油酸培养下的结果，tole表示三油酸甘油酯培养下的结果，ed表示反油酸培养下的结果，ted表示三反油酸甘油酯培养下的结果。表达水平以用rpod基因的表达量进行标准化且将油酸培养或三油酸甘油酯下的表达水平设为1时的相对值来表示。(a)表示将三油酸甘油酯下的表达水平设为1时的相对值，(b)表示将油酸下的表达水平设为1时的相对值。上排的图表示第1脂肪酶基因的代表性序列的表达水平，下排的图表示第2脂肪酶基因的代表性序列的表达水平。误差条表示标准偏差。
77.图2示出来自在28℃下培养而得的kh
‑
1株培养上清的具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶的纯化。利用疏水性柱色谱来纯化在28℃下培养而得的kh
‑
1株的培养上清，示出利用cbb染色来分析洗脱级分的结果。从左侧起示出洗脱级分的编号，左侧示出分子量。
78.图3示出来自在15℃下培养而得的kh
‑
1株培养上清的具有代表性序列的本公开的第2脂肪酶的纯化。利用疏水性柱色谱来纯化在15℃下培养而得的kh
‑
1株的培养上清。示出利用cbb染色来分析洗脱级分的结果。从左侧起示出洗脱级分的编号，左侧示出分子量。
79.图4从左侧起示出具有代表性序列的第1脂肪酶的最适温度(a)、热稳定性(b)、最适ph(c)和ph稳定性(d)。图(a)～(d)的纵轴表示相对脂肪酶活性，(a)和(b)的横轴表示温度，(c)和(d)的横轴表示ph。(c)和(d)中，“〇”表示使用乙酸缓冲液在ph3.0～5.0的范围内进行分析的结果，
“▲”
表示使用磷酸钠缓冲液在ph5.0～7.0的范围内进行分析的结果，
“□”
表示是tris
‑
hcl缓冲液在ph7.0～9.0的范围内进行分析的结果，
“△”
表示使用caps缓冲液在ph9.0～11.0的范围内进行分析的结果。误差条表示标准偏差。
80.图5从左侧起示出具有代表性序列的第2脂肪酶的最适温度(a)、热稳定性(b)、最适ph(c)和ph稳定性(d)。图(a)～(d)的纵轴表示相对脂肪酶活性，(a)和(b)的横轴表示温
度，(c)和(d)的横轴表示ph。(c)和(d)中，“〇”表示使用乙酸缓冲液在ph3.0～5.0的范围内进行分析的结果，
“▲”
表示使用磷酸钠缓冲液在ph5.0～7.0的范围内进行分析的结果，
“□”
表示使用tris
‑
hcl缓冲液在ph7.0～9.0的范围内进行分析的结果，
“△”
表示使用caps缓冲液在ph9.0～11.0的范围内进行分析的结果。误差条表示标准偏差。
81.图6示出包含具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶的培养上清与油用清洗剂和一般清洗剂的、换气扇污垢分解活性的比较结果。左上的过滤器为附着有油的处理前的过滤器，上排的中央和右侧示出在kh
‑
1培养上清中分别浸渍了30分钟和1小时的过滤器。中间的中央和右侧示出在油用清洗剂中分别浸渍了2小时和4小时的过滤器。下排的中央和右侧示出在一般清洗剂中分别浸渍了2小时和4小时的过滤器。
82.图7示出具有代表性序列的第1脂肪酶和具有代表性序列的第2脂肪酶与novozym(注册商标)51032脂肪酶(novozymes)的、换气扇污垢分解活性的比较。(a)左侧示出在novozym51032脂肪酶(n
‑
51032)中浸渍了30分钟后的换气扇过滤器的照片，右侧示出使换气扇过滤器浸渍后的novozym51032脂肪酶溶液的照片。(b)左侧示出在具有代表性序列的第1脂肪酶中浸渍了30分钟后的换气扇过滤器的照片，右侧示出浸渍换气扇过滤器后的具有代表性序列的第1脂肪酶溶液的照片。(c)左侧示出在具有代表性序列的第2脂肪酶中浸渍了30分钟后的换气扇过滤器的照片，右侧示出使换气扇过滤器浸渍后的具有代表性序列的第2脂肪酶溶液的照片。
83.图8示出具有代表性序列的第1脂肪酶的猪油和起酥油的分解活性。具有代表性序列的第1脂肪酶是利用疏水性柱色谱从在28℃下培养而得的kh
‑
1株中纯化而得的。(a)示出与缓冲液或具有代表性序列的第1脂肪酶一起孵育后的猪油，(b)示出与缓冲液或具有代表性序列的第1脂肪酶一起孵育后的起酥油，(c)示出通过薄层层析对所提取的油脂进行分离的结果。
84.图9示出具有代表性序列的第2脂肪酶的猪油和起酥油的分解活性。具有代表性序列的第2脂肪酶是利用疏水性柱色谱从在15℃下培养而得的kh
‑
1株中纯化而得的。(a)示出与缓冲液或具有代表性序列的第2脂肪酶一起孵育后的猪油，(b)示出与缓冲液或具有代表性序列的第2脂肪酶一起孵育后的起酥油，(c)示出通过薄层层析对所提取的油脂进行分离的结果。
85.图10示出利用kh
‑
1株和br3200(bioremove3200、novozymes)进行的含反式脂肪酸排水的处理试验。(a)示出在供给含反式脂肪酸排水并培养kh
‑
1株和br3200 24小时或48小时后利用薄层层析对排水中的油脂进行分离的结果，(b)示出培养kh
‑
1株后和培养br3200后的排水中的油分浓度。
86.图11示出利用具有代表性序列的第1脂肪酶在37℃条件下分解三油酸甘油酯和三反油酸甘油酯。左侧示出三油酸甘油酯的分解，右侧示出三反油酸甘油酯的分解。tole表示三油酸甘油酯，ted表示三反油酸甘油酯。各板的上侧示出甘油三脂(三油酸甘油酯或三反油酸甘油酯)的信号，下侧示出游离脂肪酸(油酸或反油酸)的信号。还示出作为对照的仅利用不含酶的缓冲液得到的处理结果。
87.图12示出利用具有代表性序列的第2脂肪酶在37℃条件下分解三油酸甘油酯和三反油酸甘油酯。左侧示出三油酸甘油酯的分解，右侧示出三反油酸甘油酯的分解。tole表示三油酸甘油酯，ted表示三反油酸甘油酯。各板的上侧示出甘油三脂的信号，下侧示出游离
脂肪酸的信号。还示出作为对照的仅利用不含酶的缓冲液得到的处理结果。
88.图13示出利用本公开的脂肪酶在15℃条件下分解三油酸甘油酯和三反油酸甘油酯。利用丁基琼脂糖柱从kh
‑
1株培养上清中纯化具有代表性序列的第1脂肪酶的和具有代表性序列的第2脂肪酶，与三反油酸甘油酯或三油酸甘油酯混合，在15℃下处理24小时。左侧示出三油酸甘油酯的处理，右侧示出三反油酸甘油酯的处理。各板中，左侧示出利用包含具有代表性序列的第2脂肪酶的溶液进行的处理，右侧示出利用包含具有代表性序列的第1脂肪酶的溶液进行的处理。各板的上侧示出甘油三脂(三油酸甘油酯或三反油酸甘油酯)的信号，下侧示出游离脂肪酸(油酸或反油酸)的信号。
89.图14示出利用本公开的第1脂肪酶和第2脂肪酶进行的三油酸甘油酯的脂肪改性。示出利用tlc分析来分析将具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶或单独的缓冲液与甲醇和三油酸甘油酯混合而进行反应的产物、以及油酸甲酯标准品而得的结果。从上方起，各信号依次对应于油酸甲酯、三油酸甘油酯、油酸和甘油二酯。
90.图15示出利用本公开的第1脂肪酶和第2脂肪酶进行的反式脂肪酸的脂肪改性。(a)示出利用tlc分析来分析将具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶或单独的缓冲液与甲醇和反棕榈油酸(palmitelaidic acid)混合而进行反应的产物、以及反棕榈油酸甲酯标准品而得的结果。从上方起，各信号依次对应于反棕榈油酸甲酯和反棕榈油酸。(b)示出利用tlc分析来分析将具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶或单独的缓冲液与甲醇和反式异油酸(vaccenic acid)混合而进行反应的产物、以及反式异油酸甲酯标准品而得的结果。从上方起，各信号依次对应于反式异油酸甲酯和反式异油酸。
91.图16示出本发明的第1脂肪酶的变体的油脂分解活性。左侧示出三油酸甘油酯(tole)的分解，右侧示出三反油酸甘油酯(ted)的分解。各照片中，左侧的泳道示出利用单独的缓冲液进行处理的结果，右侧的泳道示出利用第1脂肪酶的变体进行处理的结果。各照片中，上部的箭头对应于未被分解的油脂，下部的箭头对应于游离脂肪酸。
92.图17示出本发明的第2脂肪酶的变体的油脂分解活性。左侧示出三油酸甘油酯(tole)的分解，右侧示出三反油酸甘油酯(ted)的分解。各照片中，左侧的泳道示出利用单独的缓冲液进行处理的结果，右侧的泳道示出利用第2脂肪酶的变体进行处理的结果。各照片中，上部的箭头对应于未被分解的油脂，下部的箭头对应于游离脂肪酸。
具体实施方式
93.以下示出最佳方式来说明本发明。在本说明书整体中，单数形式的表述只要没有特别声明则应理解为还包括其复数形式的概念。因此，单数形式的冠词(例如，英语中的“a”，“an”，“the”等)只要没有特别声明则应理解为还包括其复数形式的概念。另外，本说明书中使用的术语只要没有特别声明则应理解为以该领域中通常使用的含义来使用。因此，除非另有定义，否则本说明书中使用的全部专业术语和科学技术术语具有与本发明所属领域的本领域技术人员的通常理解相同的含义。如有冲突，则以本说明书(包括定义)为准。
94.以下适当地说明本说明书中特别使用的术语的定义和/或基本的技术内容。
95.(术语的定义)
96.本说明书中，“脂肪酶”是酯酶的一种，是指可逆地催化将中性脂肪(甘油酯)水解为脂肪酸和甘油的反应的酶。本公开的脂肪酶以酶编号(ec编号)表示时为ec3.1.1.3，属于
甘油三酯脂肪酶。
97.本说明书中，脂肪酶活性可如下确定：使用棕榈酸与4
‑
硝基苯酚的酯、即棕榈酸4
‑
硝基苯酯(4
‑
npp)作为底物进行酶反应，通过测定410nm的吸光度来确定通过酯的水解而生成的对硝基苯酚的量。首先，将4
‑
npp(18.9mg)添加到3％(v/v)tritonx―100(12ml)中，在70℃下溶解而制成底物溶液。将底物溶液1ml、离子交换水0.9ml和150mm gta缓冲液(向150mm 3,3
‑
二甲基戊二酸、150mm tris和150mm 2
‑
氨基
‑2‑
甲基
‑
1,3
‑
丙二醇中加入naoh或hcl而调节至ph7.0)1ml加入到比色皿中，在28℃下保温5分钟。向其中添加培养上清0.1ml，边搅拌边测定410nm的值。关于脂肪酶活性，将生产1μmol的4
‑
硝基苯酚的酶量定义为1单位(u)而进行活性测定，计算每1ml培养上清的单位。
98.油脂和脂肪酸的分解
·
消耗能力可以通过利用薄层层析来分析培养基中残存的油脂和因水解而生成的游离脂肪酸来测定。若示出具体的定量步骤，首先向培养上清中加入等量的氯仿来提取油脂。对于5μl该提取物，使用按照体积比计分别以96：4：1的比率包含氯仿、丙酮和甲醇的展开溶剂在硅胶涂布板上进行展开。用钼酸多水合物对板进行处理而使油脂显色。
99.本说明书中，“含反式脂肪酸油脂”是指含有反式脂肪酸的油脂。“反式脂肪酸”以本技术领域中通常使用的含义来使用，表示具有反式型的双键的不饱和脂肪酸。反式脂肪酸天然地以共轭亚油酸、反式异油酸的形式微量地存在，但油脂工业中通过不饱和脂肪酸的氢化而制造饱和脂肪酸时会大量产生，也包含在人造黄油和起酥油等食品中。反式脂肪酸包括反油酸、反棕榈油酸(棕榈反油酸)、反式异油酸等，本说明书中提及时，对反式脂肪酸的种类没有特别限制。对存在于含反式脂肪酸油脂中的反式脂肪酸的比率没有特别限定。
100.本说明书中，“与同化含反式脂肪酸油脂有关的能力”是指：用于引起微生物同化含反式脂肪酸油脂的活性。本说明书中，“同化含反式脂肪酸油脂”以本技术领域中通常使用的含义来使用，是指微生物摄取含反式脂肪酸油脂而作为碳源等营养源。进行“同化”时，除了包括水解为甘油和游离脂肪酸以外还包括转化为其它物质的一部分。
101.本说明书中，“分解含反式脂肪酸油脂的能力”是指将含反式脂肪酸油脂水解为甘油和游离脂肪酸的活性。
102.本说明书中，(各温度下的)“分解油脂的能力”可如下测定。即，通过本说明书中记载的方法纯化脂肪酶，在应该为待测温度的恒温下，将脂肪酶和棕榈酸对硝基苯酯混合，测定410nm下的吸光度，由此可以进行测定。代替方案为：通过本说明书中记载的方法回收kh
‑
1株或其衍生株的培养上清，将包含脂肪酶的培养上清或粗纯化脂肪酶液在恒温下与棕榈酸对硝基苯酯混合，测定410nm下的吸光度，由此可以进行测定。
103.本说明书中，分解油脂的能力的“最适温度”以本技术领域中通常使用的含义来使用，是指使分解油脂的活性处于一定水平的期望程度以上(例如，是指保持该酶所具有的最高水平的80％以上的活性的温度范围，在另一实施方式中有时是指最高水平。)的温度。具体而言，本公开的第1脂肪酶的分解油脂的活性的峰值为约60℃，在约45～70℃的范围内保持峰值的80％以上的活性。本公开的第2脂肪酶的分解油脂的活性的峰值为约50℃，在约35～55℃的范围内保持峰值的80％以上的活性。在言及本公开的脂肪酶的最适温度的上下文中，是指本公开的第1脂肪酶的最适温度为45～75℃、优选为50～70℃、更优选为55～65℃、
进一步优选为58～63℃、最优选为60℃。是指本公开的第2脂肪酶的最适温度为35～55℃、优选为40～55℃、更优选为45～50℃。在另一实施方式中，可以以改变最适温度的方式来改造本公开的脂肪酶，作为其最适温度的下限，可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等(或在这些之间的温度范围内以每次1℃的方式进行改变)，作为上限，可以为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃(或在这些之间的温度范围内以每次1℃的方式进行改变)。
104.本说明书中，“热稳定性”具有与“温度稳定性”、“耐热性”等术语相同的含义，以本技术领域中通常使用的含义来使用，是指酶在高温下保持活性。已知酶通常在50℃左右的温度下由于分子结构改变等原因而发生失活。与此相对地，对于本公开的第1脂肪酶而言，例如，将30℃下处理30分钟后的酶活性设为100％时的相对酶活性为：在约30～约85℃左右的温度范围内处理30分钟后也为100％以上，在90℃下处理30分钟后也保持约30％的酶活性，因此可以说本公开的脂肪酶具有较高热稳定性。对于本公开的第2脂肪酶而言，例如，将70℃下处理30分钟后的酶活性设为100％时的相对酶活性为：在约15～约75℃左右的温度范围内处理30分钟后也保持90％以上，在80℃也保持80％左右。本说明书中，“保持热稳定性”等类似表述表述：将30℃左右下处理30分钟后的酶活性设为100％时，相对酶活性保持约50％以上。
105.本说明书中，分解油脂的能力的“最适ph”以本技术领域中通常使用的含义来使用，是指使分解油脂的活性为一定水平以上(例如，保持该酶所具有的最高水平的80％以上的活性的ph范围，在另一实施方式中也有时是指最高水平。)时的ph。本公开的第1脂肪酶和第2脂肪酶的分解油脂的活性的峰值均为约ph9，在约ph7.5～ph9.5的范围内保持峰值的80％以上的活性。在言及第1脂肪酶和第2脂肪酶的最适ph的上下文中，本公开的(第1和第2两者)脂肪酶的最适ph为ph7.5～ph9.5、优选为ph8.0～ph9.3、更优选为ph9。
106.本说明书中，“森林伯克霍尔德菌(burkholderia arboris)”是指在生物分类学上属于伯克霍尔德属(burkholderia)森林(arboris)种。本说明书中的伯克霍尔德菌森林种kh
‑
1株具有编码至少2种脂肪酶(即，本公开的“第1脂肪酶”的代表序列和“第2脂肪酶”的代表序列)的基因。本公开的脂肪酶包括由属于伯克霍尔德菌森林种的kh
‑
1株或其衍生株生产的脂肪酶，但是不限于此。
107.本说明书中，“无细胞表达系统”以本技术领域中通常使用的含义来使用，是指使用从细胞提取的生物分子的转录翻译机制在体外生产目标重组蛋白的系统。作为用于生产本公开的脂肪酶的无细胞表达系统，没有特别限定，可以利用大肠杆菌等原核生物源无细胞表达系统。
108.本说明书中，“油处理成分”是指有助于油脂的同化和分解的成分。具体而言，包括生物表面活性剂等促进油脂的分散的成分、将油脂分解为脂肪酸和甘油的成分、分解脂肪酸成分、分解甘油的成分、以及吸附油并将其从待处理的对象物中除去的成分等。一方式中，油处理成分包括kh
‑
1株所产生的生物表面活性剂等。
109.本说明书中，“油分解剂”是指：以本公开的伯克霍尔德菌森林种kh
‑
1菌株或由该菌株产生的本公开的第1脂肪酶或第2脂肪酶为有效成分的、能够分解油脂的制剂。本公开中，油分解剂可以与油处理成分组合使用。关于这种情况下的油分解剂与油处理成分的组合使用时机，既可以同时使用，也可以先使用其中的任一者。进一步地，油分解剂中还可以
含有用于提高所使用的菌株或源自菌株的脂肪酶的活性的成分(例如碳源、氮源)、表面活性剂、干燥保护剂、用于长时间维持细菌的成分、防腐剂、赋形剂、强化剂、抗氧化剂等。
110.本公开所提供的油分解剂以液体或固体或干燥体的状态来提供。作为液体形式，可例示细菌的培养液(可根据需要进行浓缩或稀释)、培养上清、使来自培养液的酶成分吸附于支撑体的形态、从培养液中分离纯化酶后悬浮于溶剂的形态等。另外，关于固体，可以例示悬浮于包含甘油等保护剂的溶剂并冷冻的形态、固定于载体的形态(通过共价键、静电相互作用
·
疏水性相互作用等吸附于载体的形态、与载体进行分子交联的形态等)、通过离心分离或压缩机压缩等脱水后的形态、以及干燥而得的干燥体等。优选实施方式中，代表性地能够以液体形态、粉末、颗粒的形态提供油分解剂，能够同时含有作为清洗剂或清洗剂成分的其它成分而提供。
111.并非意在进行限定，但本说明书中使用的(脂肪酶等)“衍生物”、“类似物”或“突变体”优选包含下述分子，所述分子含有与对象蛋白(例如脂肪酶)实质上同源的区域，在各种实施方式中，这样的分子在相同大小的氨基酸序列之间或者利用本领域公知的计算机同源性程序进行比对时与所比对的序列相比至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％一致，或者，编码这样的分子的核酸在(高)严谨条件、中等严谨条件或非严谨条件下能够与编码组成蛋白的序列杂交。其是作为分别通过氨基酸的置换、缺失和添加来改造蛋白而得的产物，该衍生物是指虽然未必为同等程度但显示出原蛋白质的生物学功能的蛋白质。例如，能通过本说明书中记载或该领域中公知的且能适当利用的体外测试来调查这样的蛋白质的生物学功能。本说明书中使用的“功能性活性”或“具有功能性活性”在本说明书中是指：本公开的多肽、即与片段或衍生物有关的方式具有生物学活性等蛋白质的结构功能、控制功能或生化学功能。
112.本公开中，脂肪酶的片段是指包含脂肪酶的任意区域的多肽，只要能够实现本公开的目的(例如分解含反式脂肪酸油脂)则可以不必具有天然脂肪酶的全部生物学功能。
113.本说明书中，“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”和“肽”在本说明书中以相同的含义来使用，是指任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以为直链也可以有分支，还可以为环状。氨基酸可以是天然或非天然的氨基酸，还可以是修饰氨基酸。该术语此外还包括组装成多个多肽链的复合体者。该术语此外还包括天然的或人工改造后的氨基酸聚合物。作为这样的改造，包括例如形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任意的其它操作或改造(例如与标记成分形成结合体)。该定义此外还包括例如：包含1或2种以上的氨基酸类似物的多肽(例如包含非天然氨基酸等)、肽样化合物(例如拟肽)和该领域中公知的其它改造。本说明书中，“氨基酸”为具有氨基和羧基的有机化合物的总称。本公开的实施方式的蛋白质或酶包含“特定的氨基酸序列”时，该氨基酸序列中的任意氨基酸可以受到化学修饰。另外，该氨基酸序列中的任意氨基酸可以形成盐或溶剂化物。另外，该氨基酸序列中的任意氨基酸可以为l型或d型。在上述情况下，可以说本公开的实施方式的蛋白质包含上述“特定的氨基酸序列”。作为在蛋白质所含的氨基酸在体内所受到的化学修饰，已知有例如n末端修饰(例如乙酰化、肉豆蔻酰化等)、c末端修饰(例如酰胺化、添加糖基磷脂酰肌醇等)、或侧链修饰(例如磷酸化、添加糖链等)等。氨基酸只要满足本公开的目的则可以为天然氨基酸也可以为非天然氨基酸。
114.本说明书中，“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在本说明书中以相同的含义来使
用，是指任意长度的核苷酸聚合物。该术语此外还包括“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”。“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”包括核苷酸的衍生物、或者是指核苷酸间具有不寻常键的寡核苷酸或多核苷酸，可替换使用。作为这样的寡核苷酸，具体而言，可例示例如2
’‑
o
‑
甲基
‑
核糖核苷酸、寡核苷酸中的磷酸二酯键变成了硫代磷酸酯键的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的磷酸二酯键变成了n3
’‑
p5’磷酰胺酯键的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的核糖与磷酸二酯键变成了肽核酸键的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的尿嘧啶被置换为c
‑
5丙炔基尿嘧啶的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的尿嘧啶被置换为c
‑
5噻唑尿嘧啶的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的胞嘧啶被置换为c
‑
5丙炔基胞嘧啶的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的胞嘧啶被置换为酚噁嗪修饰胞嘧啶(phenoxazine
‑
modified cytosine)的寡核苷酸衍生物、dna中的核糖被置换为2
’‑
o
‑
丙基核糖的寡核苷酸衍生物和寡核苷酸中的核糖被置换为2
’‑
甲氧基乙氧基核糖的寡核苷酸衍生物等。除非另有说明，否则特定的核酸序列与明确示出的序列同样地包含其进行了保守性改造的变体(例如简并密码子置换体)和互补序列。具体而言，通过制作将1种或1种以上的所选择的(或全部的)密码子的第3位的位置用混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换而成的序列，能够获得简并密码子置换体(batzer et al.,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka et al.,j.biol.chem.260:2605
‑
2608(1985)；rossolini et al.,mol.cell.probes 8:91
‑
98(1994))。本说明书中，“核酸”还能够与基因、cdna、mrna、寡核苷酸和多核苷酸替换使用。本说明书中，“核苷酸”可以是天然核苷酸也可以是非天然核苷酸。
115.本说明书中，“基因”是指定义遗传形状的因子，“基因”有时是指“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”。
116.本说明书中，基因的“同源性”是指2个以上的基因序列彼此间的同一性的程度，通常具有“同源性”是指同一性或类似性的程度高。因此，某2个基因的同源性越高则它们的序列同一性或类似性越高。关于2种基因是否具有同源性，可通过序列的直接比较、或者在核酸的情况下通过严谨条件下的杂交法来获知。在对2个基因序列进行直接比较时，dna序列在该基因序列间代表性情况下至少50％一致时、优选至少70％一致时、更优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致时，它们的基因具有同源性。因此，本说明书中，“同源体”或“同源基因产物”是指：与本说明书另外记载的复合体中的蛋白质组成部分具有相同的生物学功能的其它种属、优选微生物、更优选细菌中的蛋白质。这样的同源体有时还称为“直系同源基因产物”。可理解，只要符合本公开的目的则也可以使用这样的同源体、同源基因产物、直系同源基因产物等。
117.本说明书中，通过通常公知的3字母符号或iupac
‑
iub biochemical nomenclature commission建议的单字母符号中的任一方式来表示氨基酸。核苷酸也同样，通过通常已知的单字母符号来表示。本说明书中，氨基酸序列和碱基序列的类似性、同一性和同源性的比较中，使用作为序列分析用工具的blast且使用默认参数(default parameter)来进行计算。同一性检索例如可使用ncbi的blast2.7.1(2017.10.19发行)来进行。本说明书中的“同一性”的值通常是指：使用上述blast在默认条件下进行比对时的值。其中，在通过参数变更而出现更高的值时，将最高的值作为同源性的值。在多个区域评价同一性时，将其中的最高值作为同源性的值。“类似性”是除了同源性以外还考虑类似的氨基酸而计算出的数值。
118.本公开的一实施方式中，“数个”例如可以为15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2个，可以为上述任一值以下。已知受到1或数个氨基酸残基的缺失、添加、插入或利用其它氨基酸进行的置换的多肽维持其生物学活性(mark et al.,proc natl acad sci usa.1984sep；81(18):5662
‑
5666.、zoller et al.,nucleic acids res.1982oct 25；10(20):6487
‑
6500.、wang et al.,science.1984jun 29；224(4656):1431
‑
1433.)。发生了缺失等的蛋白质例如可通过位点定向诱变法、随机诱变法、或使用蛋白质噬菌体文库的生物淘选(biopanning)等来制作。作为位点定向诱变法，可以使用例如kod
‑
plus
‑
mutagenesis kit(toyobo co.,ltd.)。关于从导入了缺失等变异型蛋白质中选择具有与野生型同样的活性的蛋白质，可通过进行facs分析、elisa等各种鉴定来实现。
119.在本公开的一实施方式中作为同源性等数值的“70％以上”例如可以为70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、或100％，可以是上述成为起点的数值中的任意2个值之间的范围。上述“同源性”是按照上述那样的公知方法计算2个或多个的氨基酸序列中相同的氨基酸数的比例而得的。若具体说明，在计算比例之前，将要进行比较的氨基酸序列组的氨基酸序列对齐，在需要使同一氨基酸的比例达到最大时在氨基酸序列的局部导入空格。用于对齐的方法、比例的计算方法、比较方法、和与这些有关的计算机程序在该领域中是众所周知的(例如上述的blast等)。本说明书中，“同一性”和“类似性”在没有特别声明时可以用以ncbi的blast测定的值来表示。用blast进行氨基酸序列的比较时的算法中，可以以默认设定来使用blastp。将测定结果以positives或identities方式数值化。
120.本说明书中，“在严谨(的)条件下发生杂交的多核苷酸”是指本领域惯用的公知的条件。使用从本公开的多核苷酸中选择的多核苷酸作为探针，通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法或dna印迹杂交法等可以得到这样的多核苷酸。具体是指如下核酸：使用固定有来自菌落或噬菌斑的dna的过滤器，在0.7～1.0m的nacl存在下在65℃下进行杂交后，用0.1～2倍浓度的ssc(柠檬酸盐缓冲液、saline
‑
sodiumcitrate)溶液(1倍浓度的ssc溶液的组成为150mm氯化钠、15mm柠檬酸钠)在65℃条件下洗涤过滤器时，能够鉴定出的多核苷酸。“严谨条件”例如可以采用以下条件。(1)为了洗涤，使用低离子强度和高温度(例如，50℃下，0.015m的氯化钠/0.0015m的柠檬酸钠/0.1％的十二烷基硫酸钠)、(2)杂交中使用甲酰胺等变性剂(例如，42℃下，50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚糖体(ficoll)/0.1％的聚乙烯基吡咯烷酮/50mm的ph6.5的磷酸钠缓冲液、和750mm的氯化钠、75mm柠檬酸钠)、或(3)在包含20％甲酰胺、5
×
ssc、50mm磷酸钠(ph7.6)、5
×
denhardt’s液、10％硫酸葡聚糖、和20mg/ml的变性剪切鲑鱼精子dna的溶液中在37℃下孵育一晩，接着在约37
‑
50℃下以1
×
ssc洗涤过滤器。需要说明的是，甲酰胺浓度可以为50％以上。洗涤时间可以为5、15、30、60、或120分钟或更长时间。作为影响杂交反应的严谨性的因素，认为有温度、盐浓度等多个因素，详细可参照ausubel et al.,current protocols in molecular biology,wiley interscience publishers,(1995)。“高严谨条件”的例子为：0.0015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠、65～68℃、或0.015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠和50％甲酰胺、42℃。杂交可按照molecular cloning 2nd ed.,current protocols in molecular biology,supplement 1
‑
38,dna cloning 1:core techniques,a practical approach,second edition,oxford university press(1995)等实验书中记载的方法来进行。在此，优选从在
严谨条件下发生杂交的序列中排除仅包含a序列或仅包含t序列的序列。中等程度的严谨条件例如可以由本领域技术人员基于dna的长度容易地确定，sambrook等在molecular cloning:alaboratory manual、第3期、vol.1、7.42
‑
7.45cold spring harbor laboratory press,2001中有公开，并且，关于硝基纤维素过滤器，包括使用5
×
ssc、0.5％sds、1.0mm edta(ph8.0)的预洗涤溶液、约40
‑
50℃下的约50％甲酰胺、2
×
ssc
‑6×
ssc(或约42℃下的约50％甲酰胺中的stark’s溶液(stark’s solution)等其它同类杂交溶液)的杂交条件、以及约60℃、0.5
×
ssc、0.1％sds的洗涤条件的方式。因此，本公开中使用的多肽还包括由下述核酸分子编码的多肽，所述核酸分子为与编码本公开中明确记载的多肽的核酸分子在高严谨条件或中等严谨条件下发生杂交的核酸分子。
121.本公开的脂肪酶可优选为“经纯化”或“经分离”的脂肪酶。本说明书中，“经纯化的”物质或生物学因子(例如核酸或蛋白质等)是指：除去了与该物质或生物学因子天然相随伴的因子中的至少一部分的产物。因此，通常经纯化的生物学因子中的、该生物学因子的纯度高于该生物学因子通常存在状态下的纯度(即，被浓缩)。本说明书中使用的术语“经纯化的”是指：存在优选至少75重量％、更优选至少85重量％、更进一步优选至少95重量％、并且最优选至少98重量％的同型的生物学因子。本公开中使用的物质或生物学因子优选为“经纯化的”物质。本说明书中使用的“经分离的”物质或生物学因子(例如核酸或蛋白质等)是指：实质上除去了与该物质或生物学因子天然相随伴的因子的产物。本说明书中使用的术语“经分离的”会根据其目的而发生变化，因此有时不需要用纯度来表示，在需要时是指：存在优选至少75重量％、更优选至少85重量％、更进一步优选至少95重量％、并且最优选至少98重量％的同型的生物学因子。本公开中使用的物质优选为“经分离的”物质或生物学因子。
122.本说明书中，“片段”或“fragment”以相同含义来使用，是指相对于全长的多肽或多核苷酸(长度为n)具有1～n
‑
1的序列长度的多肽或多核苷酸。片段长度可根据其目的适宜变更，例如，作为其长度的下限，在多肽时可列举3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50和50个以上的氨基酸，未在此列举的整数所表示的长度(例如11等)也适合作为下限。另外，在多核苷酸时可列举5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100和100个以上的核苷酸，未在此列举的整数所表示的长度(例如11等)也适合作为下限。本说明书中，对于这样的片段应如下理解：例如当全长时作为油脂分解分子起作用的情况下，则只有该片段本身具有作为油脂分解分子的作用就包含在本公开的范围内。
123.本说明书中，在言及某基因或与其相关的核酸分子或多肽时，“生物学功能”是指该基因、核酸分子或多肽在体内或体外可能具有的特定功能，可列举例如分解油脂(例如分解含反式脂肪酸油脂)等，但不限于此。本公开中，例如除了分解含反式脂肪酸油脂以外还可列举分解含顺式脂肪酸油脂、分解含有不具有双键的饱和脂肪酸的油脂等，但不限于此。本说明书中，生物学功能可通过对应的“生物学活性”来发挥。本说明书中，“生物学活性”是指某因子(例如多核苷酸、蛋白质等)可能具有的活性，包括发挥各种功能(例如含反式脂肪酸油脂的分解活性)的活性。“生物学活性”可以是在体内发挥的活性，也可以是通过分泌等而在体外发挥的活性。例如在某因子为酶时，其生物学活性包括其酶活性。这样的生物学活性可以利用该领域中公知的技术来测定。因此，“活性”是指：表示或表明发生结合(直接或间接中的任一者)；影响响应(即，具有响应某些曝露或刺激的可测定的影响)之类各种可测
定的指标，例如，可包括对与本公开的多肽或多核苷酸直接结合的化合物的亲和性、或例如某些刺激后或事件后上游或下游的蛋白质的量或其它类似的功能的尺度。
124.本说明书中，基因、多核苷酸、多肽等的“表达”是指：该基因等在体内受到一定的作用而成为其它形态。优选指基因、多核苷酸等被转录和翻译而成为多肽的形态，转录而形成mrna的方式也为表达的一种方式。因此，本说明书中，“表达产物”包括这样的多肽或蛋白质、或mrna。更优选地，这样的多肽的形态可以是接受了翻译后加工的形态。例如，脂肪酶的表达水平可通过任意方法来确定。具体而言，可以通过评价脂肪酶的mrna的量、脂肪酶蛋白的量、以及脂肪酶蛋白的生物学活性来了解脂肪酶的表达水平。脂肪酶的mrna、蛋白质的量可以通过在本说明书的其它位置进行了详述的方法或其它的该领域中公知的方法来确定。
125.本说明书中，“功能等价物”是指：相对于目标实体具有目标功能相同但结构不同的任意物质。因此，本公开的“脂肪酶”的功能等价物应理解为包括：不是本公开的脂肪酶本身、但是作为其突变体或变体(例如氨基酸序列变体等)的具有该脂肪酶所具有的生物学作用的物质；以及、在进行作用时能够变成为具有该脂肪酶所具有的生物学作用的突变体或该变体的物质(例如，编码该突变体或变体的核酸以及包含该核酸的载体、细胞等)。应理解，本公开中，脂肪酶的功能等价物即使没有特别言及也能够与脂肪酶同样地使用。功能等价物可以通过检索数据库等来发现。本说明书中，“检索”是指通过电子方法或生物学方法或其它方法利用某核酸碱基序列来发现具有特定的功能和/或性质的其它核酸碱基序列的方法。作为电子学检索，可列举blast(altschul et al.,j.mol.biol.215:403
‑
410(1990))、fasta(pearson&lipman,proc.natl.acad.sci.,usa 85:2444
‑
2448(1988))、smith and waterman法(smith and waterman,j.mol.biol.147:195
‑
197(1981))、和needleman and wunsch法(needleman and wunsch,j.mol.biol.48:443
‑
453(1970))等，但不限于此。作为生物学检索，可列举严谨杂交、将基因组dna置于尼龙膜等而成的大阵列或置于玻璃板而成的微阵列(微阵列测试)、pcr和原位杂交等，但不限于此。本说明书中，旨在使本公开中使用的基因包括通过这样的电子学检索、生物学检索而鉴定出的对应基因。
126.作为本公开的功能等价物，可以使用在氨基酸序列中插入、置换或缺失1或多个氨基酸或者在其一个末端或两个末端添加1或多个氨基酸而成的物质。本说明书中，“在氨基酸序列中插入、置换或缺失1或多个氨基酸或者在其一个末端或两个末端添加1或多个氨基酸”是指：通过位点定向诱变法等公知的技术方法或通过自发突变而能自然产生的程度的多个氨基酸的置换等而进行的改造。改造氨基酸序列例如可以为1～30个、优选为1～20个、更优选为1～9个、进一步优选为1～5个、特别优选为1～2个氨基酸的插入、置换、或缺失或者添加在其一个末端或两个末端。就改造氨基酸序列而言，其氨基酸序列可以优选为在序列号4～6、11～14、16或18的氨基酸序列中具有1或多个(优选为1个或多个或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)的保守置换的氨基酸序列。这里“保守置换”是指以实质上不改变蛋白质功能的方式将1或多个氨基酸残基置换为其它的化学上类似的氨基酸残基。可列举例如：将某疏水性残基置换为其它疏水性残基、将某极性残基置换为具有相同电荷的其它极性残基等。对于能够进行这样的置换的功能类似的氨基酸而言，每一个氨基酸在该领域中都是公知的。若列举具体例，作为非极性(疏水性)氨基酸，可列举丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可列举甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷的
(碱性)氨基酸，可列举精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为具有负电荷的(酸性)氨基酸，可列举天冬氨酸、谷氨酸等。
127.本说明书中，“试剂盒”是指：通常分成2个以上的区块来提供所要提供的部分(例如酶、油脂分解剂、缓冲液、说明书等)的单元。在目的为提供组合物且组合物为由于稳定性等而不应以混合状态提供、优选在即将使用前混合而使用的组合物时，优选该试剂盒的方式。有利的方式是，这样的试剂盒优选具备记载有如何使用所提供的部分(例如酶、油脂分解剂)、或者应如何处理试剂或使用后的废液的指导书或说明书。本说明书中，在以试剂用试剂盒形式使用试剂盒时，试剂盒中通常包含记载有酶、油脂分解剂等的使用方法等的指导书等。
128.本说明书中，“指导书”为针对使用者的、记载有使用本公开的脂肪酶的方法的说明的物质。该指导书记载有指导本公开的脂肪酶的使用方法的文字。必要情况下，该指导书按照实施本发明的国家的监管机构(例如，在日本为厚生劳动省或农林水产省等，在美国为食品药品局(fda)、农业省(usda)等)所规定的格式来制作，并明确记载得到了该监管机构的批准的主旨。指导书可以以纸介质形式提供，但不限于此，例如，也可以以电子介质(例如互联网所提供的主页、电子邮件)之类的方式来提供。
129.(优选实施方式)
130.以下对本公开的优选实施方式进行说明。以下提供的实施方式是为了更好地理解本公开而提供的，可以理解的是，本公开的范围不应限于以下记载。因此，本领域技术人员可以参考本说明书中的记载在本公开的范围内适宜地进行改进，这是不言而喻的。另外可以理解的是，本公开的以下实施方式可以单独使用或将它们组合使用。
131.(酶)
132.本公开提供新型的多肽。
133.作为代表，本公开提供由伯克霍尔德菌森林种(burkholderia arboris)kh
‑
1株或其衍生株得到的第1脂肪酶的代表性序列和第2脂肪酶的代表性序列以及它们的衍生物。
134.一个方式中，本公开的多肽可以为下述多肽：
135.(a)包含序列号4、11、16或18所示的氨基酸序列的多肽；
136.(b)包含在(a)的氨基酸序列中含有1个以上氨基酸的置换、添加、缺失或它们的组合的氨基酸序列且具有生物学活性的多肽；
137.(c)与(a)或(b)所示的氨基酸序列具有至少70％以上的序列同一性、且具有生物学活性的多肽；
138.(d)包含由序列号1、7、15或17所示的核酸序列编码的氨基酸序列的多肽；
139.(e)由在(d)所示的核酸序列中含有1个以上核苷酸的置换、添加、缺失或它们的组合的核酸序列编码且具有生物学活性的多肽；
140.(f)由与(d)或(e)所示的核酸序列具有至少70％以上的序列同一性的核酸序列编码且具有生物学活性的多肽；
141.(g)由与包含(d)～(f)中的任一者所示的核酸序列或其互补序列的多核苷酸在严谨条件下发生杂交的核酸序列编码、且具有生物学活性的多肽；
142.(h)由(d)～(g)中的任一核酸序列的等位基因突变体编码且具有生物学活性的多肽；或
143.(i)包含(a)～(h)所示的氨基酸序列的片段的多肽。
144.在另一方式中，本公开提供编码新型多肽的核酸序列。本公开的多核苷酸可以为下述多核苷酸：
145.(a)包含序列号1、7、15或17所示的核酸序列的多核苷酸；
146.(b)包含在(a)所示的核酸序列中含有1个以上核苷酸的置换、添加、缺失或它们的组合的核酸序列的多核苷酸；
147.(c)包含与(a)或(b)所示的核酸序列具有至少70％以上的序列同一性的核酸序列、且编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸；
148.(d)包含与含有(a)～(c)中的任一者所示的核酸序列或其互补序列的多核苷酸在严谨条件下发生杂交的核酸序列、且编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸；
149.(e)作为(a)～(d)中的任一核酸序列的等位基因突变体的编码具有生物学活性的多肽的多核苷酸；或
150.(f)编码包含序列号4、11、16或18所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
151.(g)编码包含在(f)的氨基酸序列中含有1个以上氨基酸的置换、添加、缺失或它们的组合的氨基酸序列、且具有生物学活性的多肽的多核苷酸；
152.(h)编码与(f)或(g)所示的氨基酸序列具有至少70％以上的序列同一性、且具有生物学活性的多肽的多核苷酸；或
153.(i)包含(f)～(h)所示的核酸序列的片段的多核苷酸。
154.本公开的多肽所具有的生物学活性可以为本公开的第1脂肪酶或第2脂肪酶所具有的任意特性中的至少一种，例如，可包括与同化含反式脂肪酸油脂有关的能力、或分解含反式脂肪酸油脂的能力或这两者。
155.因此，一个实施方式中，本公开的多肽或多核苷酸所编码的多肽可具有与同化含反式脂肪酸油脂有关的能力、或分解含反式脂肪酸油脂的能力或这两者。
156.一个优选实施方式中，本公开的多肽或多核苷酸所编码的多肽具有在15℃、或10℃分解油脂的能力。
157.另一优选实施方式中，作为本公开的第1脂肪酶的多肽或多核苷酸所编码的多肽，45～75℃、50～70℃、优选为55～65℃、58～63℃、或60℃为其分解油脂的能力的最适温度。作为本公开的第2脂肪酶的多肽或多核苷酸所编码的多肽，35～55℃、40～55℃、优选为45～55℃、45～50℃、或50℃为其分解油脂的能力的最适温度。
158.一个实施方式中，作为本公开的第1脂肪酶的多肽或多核苷酸所编码的多肽，可在50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、或75℃以上具有热稳定性，在50℃以下、55℃以下、60℃以下、65℃以下、70℃以下、75℃以下、80℃以下、85℃以下、或88℃以下能够保持该热稳定性。作为本公开的第1脂肪酶的多肽或多核苷酸所编码的多肽优选可在65℃以上具有热稳定性，可在85℃以下保持该热稳定性。作为本公开的第2脂肪酶的多肽或多核苷酸所编码的多肽可在40℃以上、45℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、或75℃以上具有热稳定性，可在40℃以下、45℃以下、50℃以下、55℃以下、60℃以下、65℃以下、70℃以下、75℃以下、80℃以下、或85℃以下保持该热稳定性。作为本公开的第2脂肪酶的多肽或多核苷酸所编码的多肽优选在50℃以上具有热稳定性，可在80℃以下保持该热稳定性。
159.一个具体实施方式中，本公开的多肽或多核苷酸所编码的多肽可以源自伯克霍尔德菌森林种(burkholderia arboris)，但是不限于此。优选实施方式中，可以为源自森林伯克霍尔德菌kh
‑
1株或其衍生株的酶，但是不限于此。
160.另一方式中，本公开提供一种油分解剂，其包含：上述任意多肽、或者包含多核苷酸的细胞或无细胞表达系统。
161.本公开的细胞包含本公开的第1脂肪酶或第2脂肪酶的多肽、或者以能够表达的方式整合有编码本公开的第1脂肪酶或第2脂肪酶的多肽的多核苷酸。无细胞表达系统以能够表达的方式提供编码本公开的第1脂肪酶或第2脂肪酶的多肽的多核苷酸，通过适宜的机制多肽表达而发挥油分解效果。
162.一个实施方式中，上述油分解剂包含进一步的油处理成分。
163.在另一方式中，本公开提供一种试剂盒，其用于油分解或油脂处理，所述试剂盒具备本公开的多肽、或者本公开的细胞或无细胞表达系统、或者油分解剂；所述试剂盒还具备另外的油处理成分。可以理解的是，本公开的试剂盒中包含的油分解剂和油处理成分可以与本说明书中其它位置所说明的任意种类的物质以任意的组合来使用。
164.在另一方式中，本公开提供一种油分解除去方法，其包括：使本公开的多肽、或本公开的细胞或无细胞表达系统、或本公开的油分解剂作用于处理对象。本公开的油分解除去方法中，上述处理对象优选包含含反式脂肪酸油脂，但是不限于此。本说明中公开了：即使是不包含含反式脂肪酸油脂的对象，在使用本公开的脂肪酶时也能够非常高效地进行油分解。
165.在另一方式中，本公开提供一种清洗剂，其包含：本公开的多肽、本公开的细胞或无细胞表达系统、或本公开的油分解剂。
166.在又一方式中，提供一种在脂肪改性/油脂生产技术(酯交换等)中的应用，其使用本公开的多肽、本公开的细胞或无细胞表达系统、或本公开的油分解剂。作为脂肪改性/油脂生产技术(酯交换等)，可列举：生成酯体、例如甲酯、乙酯的反应；油脂所含的脂肪酸的置换反应；甘油二酯、单酰基甘油的生产等。
167.意图使本公开的多肽不仅包括具有序列号4～6、序列号11～14、16或18的氨基酸序列的多肽、还包括它们的变体。作为这样的多肽，可列举：包含相对于序列号4～6、序列号11～14、16或18的氨基酸序列而言含有1个以上氨基酸的置换、添加、缺失或它们的组合的氨基酸序列、并且具有生物学活性的多肽。特定实施方式中，本发明的第1脂肪酶的代表性序列中，对应于序列号4所示的氨基酸序列中的第1位、第3位、第6位、第137位、第220位、第227位、第243位、第276位和第316位的氨基酸被置换。另一实施方式中，本发明的第2脂肪酶的代表性序列中，对应于序列号11所示的氨基酸序列中的第13位、第26位、第45位、第75位、第100位、第138位、第168位、第171位、第214位、第230位、第234位、第248位、第250位、第331位和第360位的氨基酸被置换。
168.本公开还提供编码新型多肽的核酸序列，意图使该核酸序列不仅包括序列号1～3、序列号7～10、15或17所示的核酸序列、还包括它们的变体。作为这样的核酸序列，可列举：相对于序列号1～3、序列号7～10、15或17的核酸序列而言包含1个以上核苷酸的置换、添加、缺失或它们的组合且编码具有生物学活性的多肽的核酸序列。
169.关于上述氨基酸序列或核酸序列中可导入变异的位置，本领域技术人员可以通过
同源检索、基序检索、结构域分析、比对、二级结构预测等方法容易地确定。关于氨基酸序列或核酸序列中可导入变异的位置，只要在该位置具有变异的变体保持本公开的脂肪酶活性就可以为任意位置，可以向多个位置导入变异。具体而言，在本公开的第1脂肪酶的情况下，可以在序列号6(全长氨基酸序列)的任意位置具有变异，作为一例，期望为对应于序列号6的第131位的s、第308位的d、第330位的h的残基以外的变异，但是不限于此。
170.(酶的生产)
171.作为一例，本公开的第1脂肪酶或第2脂肪酶可以从伯克霍尔德菌森林种(burkholderia arboris)kh
‑
1株(保藏编号nite bp
‑
02731)或其衍生株纯化。具体而言，本公开的第1脂肪酶可通过包括下述工序的方法来纯化：
172.工序(a)：将kh
‑
1株或其衍生株在包含1％芥花油的培养基中在28℃下培养24小时以上；
173.工序(b)：将(a)的培养上清用孔径0.45μm的过滤器灭菌，上样到用为柱体积的约10倍量的包含0.5m nacl和2mm cacl2的20mm tris
‑
hcl(ph7.0)缓冲液(此后记作tris缓冲液)预先平衡化的butyl
‑
s sepharose 6fast flow(ge healthcare)，静置约1小时，使疏水性蛋白质吸附于柱；
174.工序(c)：用柱体积的约10倍量的tris缓冲液洗涤(b)的柱，然后用柱体积的约1倍量的不含nacl的tris缓冲液洗涤5次，洗脱与柱载体结合不牢的蛋白质；和
175.工序(d)：将(c)的柱用柱体积的约1倍量的包含0.5％的tritonx
‑
100的tris缓冲液洗涤4次，洗脱与柱牢固结合的蛋白质。
176.本公开的第2脂肪酶可通过包括下述工序的方法来纯化：
177.工序(a)：将kh
‑
1株或其衍生株在包含1％芥花油的培养基中在15℃下培养48小时以上；
178.工序(b)：将(a)的培养上清用孔径0.45μm的过滤器灭菌，上样到用为柱体积的约10倍量的包含0.5m nacl和2mm cacl2的20mm tris
‑
hcl(ph7.0)缓冲液(此后记作tris缓冲液)预先平衡化的butyl
‑
s sepharose 6fast flow(ge healthcare)，静置约1小时，使疏水性蛋白质吸附于柱；
179.工序(c)：用柱体积的约10倍量的tris缓冲液洗涤(b)的柱，然后用柱体积的约1倍量的不含nacl的tris缓冲液洗涤5次，洗脱与柱载体结合不牢的蛋白质；和
180.工序(d)：将(c)的柱用柱体积的约1倍量的包含0.5％的tritonx
‑
100的tris缓冲液洗涤4次，洗脱与柱牢固结合的蛋白质。
181.酶的纯化方法中，kh
‑
1株或其衍生株的培养条件、柱色谱的条件等具体条件可以由本领域技术人员适宜调整。
182.本公开的第1脂肪酶和第2脂肪酶也可以通过使用微生物的分泌生产系统来生产。具体而言，本公开的第1脂肪酶或第2脂肪酶可以通过包含下述工序的方法来生产：
183.(a)将编码本公开的第1脂肪酶或第2脂肪酶的成熟体的核酸分子(例如序列号1、7、15或17或其改造序列)导入pbic1质粒(宝生物公司)内，使之在短芽孢杆菌(brevibacillus)内表达的工序、和
184.(b)用ni
‑
琼脂糖纯化短芽孢杆菌(brevibacillus)分泌的蛋白质的工序。
185.或者，可以通过使用谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)的corynex
(注册商标)系统(味之素)、毕赤酵母(pichia pastoris)表达系统(thermofisher)、使用昆虫细胞的杆状病毒表达系统(thermofisher)、使用曲霉的蛋白质分泌表达系统(大关)、利用pet系统的大肠杆菌的周质分泌生产系统(默克)等表达系统来生产本公开的脂肪酶重组蛋白。在该使用微生物生产脂肪酶的方法中，表达脂肪酶的方法、表达脂肪酶的宿主、宿主所分泌的脂肪酶的纯化方法等具体条件可以由本领域技术人员适宜地调整。另外，本公开的脂肪酶除了可以使用微生物分泌生产系统以外，还可以使用菌体内表达系统、无细胞表达系统等各种表达系统来表达。
186.(酶的应用)
187.本公开的脂肪酶在油脂处理中是有用的，用于含油脂的排水、废液等的处理。该实施方式中，本公开的脂肪酶用于排水处理。本公开的脂肪酶在被用于排水处理用途时，可用于工场排水、厨房排水、住宅排水等用途中。
188.作为此外的例子，本公开的脂肪酶作为清洗剂使用。本公开的脂肪酶在作为清洗剂使用时，可用于洗涤用清洗剂、厨房用清洗剂、扫除用清洗剂、工业用清洗剂等用途中。本公开的包含脂肪酶的清洗剂在管道清洁剂等排水沟清洗剂中尤其有用。
189.另一实施方式中，本公开的脂肪酶用于脂肪改性/油脂生产技术中。本公开的脂肪酶在被用于脂肪改性/油脂生产技术时，可用于食品用、工业用、燃料用等用途。
190.另一实施方式中，本公开的脂肪酶作为环境污染对策来使用。本公开的脂肪酶在被用于环境污染对策时，可用于除去由油导致的土壤污染、地下水污染、海洋污染等中的污染物质。
191.另一实施方式中，本公开的脂肪酶用于废弃物处理和堆肥化。本公开的脂肪酶在被用于废弃物处理和堆肥化时，可用于包括减量型在内的厨余垃圾处理、堆肥化、农产物
·
食品废弃物的饲料化、加压上浮分离装置、由油脂捕集器形成的油性污泥的减量化等用途。
192.另一实施方式中，本公开的脂肪酶作为药品使用。本公开的脂肪酶在作为药品使用时可用于助消化药、脂肪分解促进剂等用途。
193.另一实施方式中，本公开的脂肪酶作为化妆品使用。本公开的脂肪酶在作为化妆品使用时可用于用来改善、预防或处置油性肌肤的化妆品等用途。
194.使用本公开的脂肪酶时，可以以包含经分离的酶的成分形式使用，也可以以包含细菌本身的成分形式来使用。
195.(一般技术)
196.本说明书中使用的分子生物学方法、生化学方法、微生物学方法为该领域中公知惯用的，例如，记载于savli,h.,karadenizli,a.,kolayli,f.,gundes,s.,ozbek,u.,vahaboglu,h.2003.expression stability of six housekeeping genes:a proposal for resistance gene quantification studies of pseudomonas aeruginosa by real
‑
time quantitative rt
‑
pcr.j.med.microbiol.52:403
‑
408.、marie
‑
ange teste,manon duquenne,jean m francois and jean
‑
luc parrou 2009.validation of reference genes for quantitative expression analysis by real
‑
time rt
‑
pcrin saccharomyces cerevisiae.bmc molecular biology 10:99、石井诚治、奥村弘、松原千代、二宮扶实、吉冈浩、2004年、“使用热感应性聚合物的水包油成分的简易测定方法”vol 46、no.12、“用水和排水”等中，这些中的与本说明书相关的部分(可以是全部)作为参考而
援引于此。
197.(附注)
198.本说明书中，“或”在可以采用文章中所列举的事项的“至少1个以上“时使用。”或者”也是同样。本说明书中明确记载为“2个值的范围内”的情况下，该范围还包括2个值本身。
199.对于本说明书中引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献，将其整体以与各自具体记载的内容相同程度地作为参考引入本说明书中。
200.以上为了容易理解本发明而示出优选的实施方式进行了说明。以下基于实施例对本发明进行说明，但上述的说明和以下的实施例仅出于示例的目的而提供，并非出于限定本发明的目的而提供。因此，本发明的范围不限定于本说明书中具体记载的实施方式或实施例，仅由权利要求书来限定。
201.实施例
202.以下记载实施例。以下实施例中使用的生物学处理在必要时遵守名古屋大学、监管机构和卡塔赫纳议定书中规定的基准。试剂类具体而言使用了实施例中记载的制品，也可以用其它厂商(sigma
‑
aldrich、富士胶片和光纯药、nacalai tesque、r&dsystems、uscn life science inc、thermo fisher scientific、关东化学、hunakoshi、东京化成、merck等)的同等品来代替。
203.(实施例1：推定脂肪酶的表达分析)
204.本实施例中示出kh
‑
1株中发现的推定脂肪酶基因在各温度下的表达分析。
205.(实验方法)
206.将kh
‑
1株以基于使用hitachi u
‑
2810分光光度计(日立制作所、东京)得到的菌体光学密度的最终浓度达到od
660
＝0.03的方式接种于含芥花油的无机盐培养基(na2hpo
4 3.5g/l、kh2po
4 2.0g/l、(nh4)2so
4 4.0g/l、mgcl2·
6h2o 0.34g/l、feso4·
7h2o 2.8mg/l、mnso4·
5h2o 2.4mg/l、cocl2·
6h2o 2.4mg/l、cacl2·
2h2o 1.7mg/l、cucl2·
2h2o 0.2mg/l、znso4·
7h2o 0.3mg/l、和namoo
4 0.25mg/l)3l中，在5l容积发酵罐(250rpm、200ml/分钟的空气回流下)中在28℃或15℃下进行培养。使用high pure rna分离试剂盒(roche)从经时取样而取得的各培养物中提取总rna。以2μg的总rna为模板，使用primescript
tm rt reagent kit with gdna eraser perfect real time(宝生物公司)除去基因组dna并合成cdna。之后，使用试剂盒附带的稀释溶液将cdna原液稀释3倍。使用对编码本公开的第1脂肪酶和第2脂肪酶的基因为特异性的合成引物，通过applied biosystems steponeplus
tm
(applied biosystems)进行定量实时rt
‑
pcr。在包含powerup
tm sybr(注册商标)green master mix(thermo fisher scientific)(10μl)、各引物(终浓度0.5μm)、cdna(1μl)的20μl溶液中实施pcr反应。pcr反应使用快速循环模式，通过在进行1个循环的95℃下2分钟的变性后、将95℃下3秒、60℃下30秒的循环重复40次的程序来进行。通过rna聚合酶σ因子(rpod)的表达水平将表达水平标准化。对于数据，在确认熔解曲线具有单峰后，通过比较ct法(δδct法)进行分析。将用lb培养基进行培养时表达的各脂肪酶基因作为对照，示出将其设为1时的相对表达水平。
207.(结果)
208.通过在油脂存在下培养kh
‑
1株，确认到编码2种脂肪酶(具有代表性序列的第1脂
肪酶的和具有代表性序列的第2脂肪酶)的基因的表达诱导。如以下表1所示，编码具有代表性序列的第1脂肪酶的基因当在28℃下培养时在约24小时时出现表达水平的峰，在15℃下培养时在约60小时时出现表达水平的峰。编码具有代表性序列的第2脂肪酶的基因当在28℃下培养时在约24小时时出现表达水平的峰，在15℃下培养时在约96小时时出现表达水平的峰。
209.[表1]
[0210]
表1.各培养温度下，含有芥花油的无机盐培养基中的、编码本发明的脂肪酶的基因的表达量(将lb培养基中的表达量设为1时的相对值)
[0211] 第1脂肪酶第2脂肪酶28℃136
±
39(24小时)198
±
26(24小时)15℃57
±
12(60小时)134
±
28(96小时)
[0212]
括弧内为表达水平显示峰值的培养时间。
[0213]
(实施例2：突变体的实验)
[0214]
本实施例中，示出使用本公开的脂肪酶的突变体的实验。
[0215]
(实验方法)
[0216]
向具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶的氨基酸序列(序列号4)以及具有代表性序列的第2脂肪酶的氨基酸序列(序列号11)中，对于已知在脂肪酶中为活性部位的部位以外的氨基酸残基以使序列同一性达到70～99％的方式分别导入变异，由此制作多肽。使用该突变体多肽测定含反式脂肪酸油脂的分解活性。
[0217]
(实施例3：利用反式脂肪酸和含反式脂肪酸油脂进行的本公开的第1脂肪酶和第2脂肪酶的表达诱导)
[0218]
本实施例中，将添加反式脂肪酸(反油酸)和含反式脂肪酸油脂(三反油酸甘油酯)时，编码本公开的具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶的基因的表达水平与与顺式脂肪酸(油酸)和含顺式脂肪酸的脂肪酸(三油酸甘油酯)进行了比较。
[0219]
(实验方法)
[0220]
将kh
‑
1株用三油酸甘油酯板培养2天。之后，用棉棒拭取kh
‑
1株，悬浮于pbs，接着用pbs洗涤2次。作为油脂的储备溶液，制备包含终浓度2％的油酸、三油酸甘油酯、反油酸或三反油酸甘油酯的终浓度5％的tritonx
‑
100溶液，在70℃下进行溶解。向20ml的无机盐培养基中，以体积比为1/10的方式添加各油脂的储备溶液，向其中接种洗涤后的kh
‑
1株(终浓度为0.2％的油脂、0.5％的tritonx
‑
100，菌株的od
660
＝0.1)。在28℃下进行6小时的培养后，回收kh
‑
1株，由回收的kh
‑
1株提取总rna。使用2μg的总rna作为模板，按照上述合成cdna后，将稀释3倍的cdna作为模板进行定量rt
‑
pcr。通过rpod基因的表达量将表达水平标准化，以将油酸培养或三油酸甘油酯下的表达水平设为1时的相对值进行比较。
[0221]
(结果和考察)
[0222]
编码具有代表性序列的第1脂肪酶的基因的表达水平在三反油酸甘油酯处理后增加了100倍左右(图1a和1b的上排)。该结果表明，反式脂肪酸或含反式脂肪酸油脂可能为第1脂肪酶的诱导剂。关于编码具有代表性序列的第2脂肪酶的基因的表达，在三反油酸甘油酯处理后也增加了10～20倍左右(图1a和1b的下排)、该结果表明，反式脂肪酸或含反式脂肪酸油脂可能也为第2脂肪酶的诱导剂。
[0223]
(实施例4：从在28℃下培养kh
‑
1株而得的上清纯化第1脂肪酶)
[0224]
本实施例中，示出从28℃下的kh
‑
1株培养上清纯化具有代表性序列的第1脂肪酶。
[0225]
(实验方法)
[0226]
将4ml的butyl
‑
s sepharose 6fast flow(ge healthcare)用包含0.5m nacl和2mm cacl2的20mm tris
‑
hcl(ph7.0)缓冲液40ml进行平衡化。将在28℃下培养kh
‑
1株后的培养上清用0.45μm的过滤器灭菌，上样到柱中。放置1小时而吸附疏水性蛋白质后，用40ml的前述缓冲液洗涤。之后，用不含nacl的4ml的前述缓冲液洗涤5次，将与柱载体结合较弱的蛋白质洗脱。再用包含0.5％的tritonx
‑
100的4ml的前述的缓冲液洗涤4次，进行与柱载体牢固地形成疏水键的蛋白质的洗脱。将各洗脱样品用0.45μm的过滤器过滤，向其中的20μl中添加4μl的5
×
sds
‑
page样品缓冲液。在100℃下进行5分钟热处理后，离心分离，将20μl的上清上样到聚丙烯酰胺凝胶(5
‑
12％梯度凝胶)，以20ma进行90分钟电泳。接着进行cbb染色，由此对样品中包含的蛋白质进行分离分析。
[0227]
进行洗脱脂肪酶的n末端氨基酸序列的分析。将洗脱级分用30kda截止的旋转柱浓缩后，将样品上样到旋转柱型的表面活性剂除去柱detergentout tm
(takara)，按照制造商的规程置换为包含2mm cacl2的20mm tris
‑
hcl(ph7.0)的缓冲液，从而除去洗脱时使用的tritonx
‑
100。将得到的脱表面活性剂脂肪酶样品用sds
‑
page进行分离，将目标蛋白质印迹到pvdf膜后，通过埃德曼降解确定n末端氨基酸序列。
[0228]
(结果)
[0229]
由28℃的培养上清纯化而得的蛋白质显示约30kda的分子量(图2)。并且，通过疏水性柱色谱从kh
‑
1的28℃下的培养上清纯化而得的脂肪酶几乎为单一条带，表明几乎由单一蛋白质构成。
[0230]
读取了由28℃下的培养上清纯化而得的蛋白质的n末端序列，为ala
‑
asp
‑
asn
‑
tyr
‑
ala，确认为编码第1脂肪酶的基因的产物。
[0231]
(考察)
[0232]
具有代表性序列的第1脂肪酶的成熟蛋白质的氨基酸序列与根据由rast的基因信息得到的基因序列推定的产物的第45位起的序列一致，表明第1～44位的氨基酸残基为前序列，在从细胞内分泌后被切除。
[0233]
(实施例5：从在15℃下培养kh
‑
1株而得的上清纯化第2脂肪酶)
[0234]
本实施例中，示出从15℃下的kh
‑
1株培养上清纯化具有代表性序列的第2脂肪酶。
[0235]
(实验方法)
[0236]
通过与实施例4相同的方法，从在15℃下培养kh
‑
1株后的培养上清纯化脂肪酶。将纯化而得的蛋白质级分用sds
‑
page进行分离后，从凝胶切出目标条带、脱色并洗涤后，加入包含胰蛋白酶的tris缓冲液(ph8.0)，在35℃下实施20小时的酶消化。将回收的样品溶液脱盐
·
浓缩后，用lc
‑
ms/ms(thermo fisher scientific inc.,usa)进行分析。
[0237]
(结果)
[0238]
从15℃的培养上清纯化而得的蛋白质显示约40kda的分子量(图3)。并且，利用疏水性柱色谱从kh
‑
1的15℃下的培养上清纯化而得的脂肪酶几乎为单一条带，表明几乎由单一蛋白质构成。
[0239]
根据由15℃下的培养上清纯化而得的蛋白质的质谱分析结果，检测到asn
‑
val
‑
thr
‑
tyr
‑
his片段，未检测到比其更靠n末端侧的序列。考虑到胰蛋白酶消化的特异性，推测为编码以该序列或向n末端侧进一步延长了2个残基的thr
‑
arg
‑
asn
‑
val
‑
thr
‑
tyr
‑
his为n末端序列的第2脂肪酶的基因的产物。
[0240]
(考察)
[0241]
具有代表性序列的第2脂肪酶的成熟蛋白质的氨基酸序列根据与由rast的基因信息得到的基因序列推定的产物的第49位或51位起的序列一致，表明第1～48或50位的氨基酸残基为前序列，从细胞内分泌后被切除。
[0242]
(实施例6：本公开的脂肪酶的热稳定性、最适温度、最适ph和ph稳定性)
[0243]
本实施例中，示出本公开的第1脂肪酶和第2脂肪酶的热稳定性、最适温度、最适ph和ph稳定性。
[0244]
(实验方法)
[0245]
利用疏水性柱色谱分别从28℃或15℃下培养而得的kh
‑
1株纯化本公开的具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶，制备为5u/ml。测定以下的(a)～(d)条件下的棕榈酸对硝基苯酯的水解，由此来定量各脂肪酶活性。(a)将调整到10～80℃之间的温度的缓冲液与本公开的具有代表性序列的第1脂肪酶或第2脂肪酶混合，立即在各温度下测定脂肪酶活性。(b)将本公开的第1脂肪酶或第2脂肪酶在30～95℃之间的温度下孵育30分钟，之后在37℃下测定各脂肪酶活性。(c)将乙酸缓冲液(ph3.0～5.0)、磷酸钠缓冲液(ph5.0～7.0)、tris
‑
hcl缓冲液(ph7.0～9.0)或caps缓冲液(ph9.0～11.0)与本公开的具有代表性序列的第1脂肪酶或第2脂肪酶混合，之后测定脂肪酶活性。以将ph9.0下的脂肪酶活性设为100％时的相对强度来表示。(d)将(c)中使用的各缓冲液与本公开的具有代表性序列的第1脂肪酶或第2脂肪酶的溶液以1：1的体积比混合，在28℃下放置24小时，之后在ph7.0下测定脂肪酶活性。
[0246]
(结果)
[0247]
具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶的最适温度为60℃，在30℃～85℃之间的较宽温度范围内显示热稳定性(图4)。具有代表性序列的本公开的第2脂肪酶的最适温度为50℃，在15℃～80℃之间的较宽温度范围内显示热稳定性(图5)。具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶的最适ph为ph9.0，稳定的ph为ph9.0～9.5。具有代表性序列的本公开的第2脂肪酶的最适ph为ph9.0，稳定的ph为ph7.5～10.5。
[0248]
(考察)
[0249]
本公开的第1脂肪酶和第2脂肪酶的最适温度和热稳定性的结果表明，本公开的脂肪酶是在高温下也保持高活性的脂肪酶。
[0250]
(实施例7：比较kh
‑
1株培养上清和清洗剂的换气扇污垢分解活性)
[0251]
本实施例中，比较了kh
‑
1株培养上清与油用清洗剂、以及与一般清洗剂的换气扇污垢分解活性。
[0252]
(实验方法)
[0253]
作为kh
‑
1株培养上清，使用将kh
‑
1株在包含1％芥花油的培养基中在28℃下培养24小时时的培养物的上清。作为油用清洗剂和一般清洗剂，分别使用天然酶清洗剂nicoeco厨房用(nicoeco、长野、按照说明书用水稀释143倍)和family(注册商标)(花王、东京、按照说明书稀释666倍)。将沉积有油垢的换气扇过滤器切成2cm见方并放入板中，向各板中添加
kh
‑
1株培养上清(kh
‑
1)、油用清洗剂或一般清洗剂5ml，浸渍30分钟～4小时。
[0254]
(结果)
[0255]
将实施例7的结果示于图6。一般清洗剂和油用清洗剂即使在4小时的浸渍洗涤中也没能完全除去油垢，而kh
‑
1株培养上清通过1小时的浸渍洗涤就能够将过滤器洗涤到与新品同等程度。
[0256]
(考察)
[0257]
由于可认为在该培养条件下得到的培养上清中的主要的脂肪酶为本公开的酶，因此认为该油垢的分解活性是本公开的酶带来的。
[0258]
(实施例8：比较kh
‑
1株来源的本公开的酶与n
‑
51032酶的换气扇污垢分解活性)
[0259]
本实施例中，比较了kh
‑
1株来源的本公开的具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶与novozym51032脂肪酶(novozymes)的换气扇污垢分解活性。
[0260]
(实验方法)
[0261]
将kh
‑
1株的培养上清分别用上述疏水性柱色谱纯化，由此得到kh
‑
1株来源的具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶的和具有代表性序列的第2脂肪酶。novozym51032脂肪酶(n
‑
51032)购自novozymes公司。将各脂肪酶溶解于包含2mm cacl2和0.25％tritonx
‑
100的20mm tris
‑
hcl缓冲液(ph7.4)中，使得达到15u/ml的浓度。将沉积有油垢的换气扇过滤器切成2cm见方并放入板中，向各板中添加各脂肪酶的溶液5ml，浸渍30分钟。
[0262]
(结果)
[0263]
将在脂肪酶溶液中浸渍后的换气扇过滤器和浸渍后的脂肪酶溶液示于图7。在本公开的具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶中浸渍后的换气扇过滤器与在novozym51032脂肪酶中浸渍后的换气扇过滤器相比，油垢均显著分解。
[0264]
(实施例9：本公开的第1脂肪酶对猪油和起酥油的分解)
[0265]
本实施例中，示出具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶对猪油和起酥油的分解活性。
[0266]
(实验方法)
[0267]
使用包含2mm cacl2和0.5％tritonx
‑
100的20mm tris
‑
hcl(ph7.0)洗脱缓冲液，利用疏水性柱色谱从kh
‑
1株的培养上清纯化具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶。将2ml的本公开的脂肪酶的溶液(50u/ml)加入到板中，向其中添加0.7g的猪油(a)或0.5g的起酥油(b)。适宜地搅拌而使溶液融合，同时在28℃下放置24小时。将仅用前述洗脱缓冲液处理者作为对照。
[0268]
(c)向2.5％tritonx
‑
100中溶解猪油或起酥油，使得终浓度达到2％，由此制备储备溶液。将使猪油和起酥油在65℃下熔解的储备溶液0.2ml加入到1.8ml的含上述脂肪酶的缓冲液中。tritonx
‑
100和各油脂的终浓度分别为0.25％和0.2％。在28℃下孵育24小时，用等量的氯仿萃取油脂，将5μl的提取物供于薄层层析。
[0269]
(结果)
[0270]
将实施例9的结果示于图8。根据本实施例的实验结果，用单独的缓冲液处理的猪油和起酥油在处理后也为固体状态，而用具有代表性序列的第1脂肪酶处理的油脂则是溶解的(图8的(a)和(b))。薄层层析的结果也证明，猪油和起酥油中的甘油三脂被分解为游离脂肪酸(图8的(c))。表面本公开的第1脂肪酶具有水解猪油和起酥油、使其可溶的活性。
株用含1％的芥花油的无机盐培养基在28℃下培养而得的培养上清中纯化而得的脂肪酶。将三油酸甘油酯和三反油酸甘油酯溶解于包含5％的tritonx
‑
100的蒸馏水且使得终浓度达到2％，作为储备溶液(10
×
储备溶液)。将具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶的溶液(终浓度30u/ml的20mm tris缓冲液(包含2mm cacl2和0.5％tritonx
‑
100；ph7.0)中)或不含脂肪酶的同种缓冲液各100μl分注到管中，以体积比1/10添加上述油脂10
×
储备溶液。各油脂的终浓度为0.2％，tritonx
‑
100的终浓度为0.5％。将这些溶液在37℃下孵育24小时。之后，使用以体积比分别为96：4：1的比率包含氯仿、丙酮和甲醇的展开溶剂在硅胶涂布板上展开。使用薄层层析，通过利用钼酸多水合物的显色来检测油脂的分解。
[0289]
(结果)
[0290]
具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶具有水解三油酸甘油酯和三反油酸甘油酯中的任意者的活性(图11)。
[0291]
(考察)
[0292]
明确了具有代表性序列的本公开的第1脂肪酶具有水解作为顺式体的甘油三脂的三油酸甘油酯和作为反式体的甘油三脂的三反油酸甘油酯这两者的活性。
[0293]
(实施例13：本公开的第2脂肪酶对各油脂的分解)
[0294]
本实施例中，示出具有代表性序列的本公开的第2脂肪酶对三油酸甘油酯和三反油酸甘油酯的分解。
[0295]
(实验方法)
[0296]
作为具有代表性序列的本公开的第2脂肪酶，使用了通过疏水性柱色谱从将kh
‑
1株用含1％的芥花油的无机盐培养基在15℃下培养而得的培养上清中纯化而得的脂肪酶。将本公开的第2脂肪酶溶液(终浓度0.3u/ml的20mm tris缓冲液(包含2mm cacl2和0.5％tritonx
‑
100；ph7.0)中)或不含脂肪酶的同种缓冲液各100μl分注到管中，以体积比1/10添加上述油脂10
×
储备溶液。各油脂的终浓度为0.2％，tritonx
‑
100的终浓度为0.5％。将这些溶液在37℃下孵育22小时。之后，使用以体积比分别为96：4：1的比率包含氯仿、丙酮和甲醇的展开溶剂在硅胶涂布板上展开。使用薄层层析，通过利用钼酸多水合物的显色来检测油脂的分解。
[0297]
(结果)
[0298]
具有代表性序列的本公开的第2脂肪酶具有水解作为顺式体的甘油三脂的三油酸甘油酯和作为反式体的甘油三脂的三反油酸甘油酯这两者的活性(图12)。
[0299]
(实施例14：低温下本公开的脂肪酶对各油脂的分解)
[0300]
本实施例中，示出在15℃条件下本公开的具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶对三油酸甘油酯和三反油酸甘油酯的分解。
[0301]
(实验方法)
[0302]
具有代表性序列的第1脂肪酶，使用了通过疏水性柱色谱从将kh
‑
1株在包含1％的芥花油的无机盐培养基中在28℃下培养而得的培养上清中纯化而得的脂肪酶。作为具有代表性序列的第2脂肪酶，使用了通过疏水性柱色谱从将kh
‑
1株在15℃下同样进行培养而得的培养上清中纯化而得的脂肪酶。对于三油酸甘油酯或三反油酸甘油酯，以1/20添加上述10
×
储备溶液而使终浓度为0.1％，从而与第1脂肪酶或第2脂肪酶溶液混合。具有代表性序列的第1脂肪酶以4
‑
npp为底物且终浓度设为6u/ml，具有代表性序列的第2脂肪酶以4
‑
npp
为底物且终浓度设为6u/ml。将这些溶液在15℃下孵育72小时。之后，使用以体积比分别为96：4：1的比率包含氯仿、丙酮和甲醇的展开溶剂在硅胶涂布板上展开。使用薄层层析，通过利用钼酸多水合物的显色来检测油脂的分解。
[0303]
(结果和考察)
[0304]
作为顺式体的甘油三脂的三油酸甘油酯通过具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶中的任一者的处理被分解为油酸。作为反式体的甘油三脂的三反油酸甘油酯也通过第1脂肪酶和第2脂肪酶中的任一者的处理被分解为反油酸(图13)。该结果证明，本公开的具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶即使在低温(15℃)条件下也具有分解含顺式脂肪酸油脂和含反式脂肪酸油脂中的任一者的活性。
[0305]
(实施例15：三油酸甘油酯的脂肪改性和脂肪酸甲酯的油脂生产技术)
[0306]
本实施例中，示出利用本发明的具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶进行的、顺式体的脂肪酸的脂肪改性。
[0307]
(实验方法)
[0308]
在包含1％的芥花油的bs培养液中，对kh
‑
1株进行48小时发酵罐培养，使用丁基琼脂糖柱从其上清中纯化具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶。将第1脂肪酶和第2脂肪酶的溶液调整为5u/ml。将三油酸甘油酯溶解于甲醇，使得达到0.5％，作为储备溶液。将该储备溶液80μl与各酶溶液20μl的混合液分注到带螺帽的管中，在37℃的培养箱中静置96小时。需要说明的是，将与不含脂肪酶的缓冲液的混合物作为对照区。之后，向各溶液中添加100μl的水和50μl的氯仿，用涡旋混合器充分搅拌后，以12,000g离心分离5分钟。对于10μl的下层的氯仿层，使用以体积比分别为80：20：1的比率包含己烷、乙醚和乙酸的展开溶剂供于tlc分析。
[0309]
(结果)
[0310]
将实施例15的结果示于图14。本发明的第1脂肪酶和第2脂肪酶中的任一者均催化作为顺式体的甘油三脂的三油酸甘油酯的酯交换反应而生成油酸甲酯。
[0311]
(实施例16：反式脂肪酸的脂肪改性和脂肪酸甲酯的油脂生产技术)
[0312]
本实施例中，示出利用本发明的具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶进行的、反式脂肪酸的脂肪改性。
[0313]
(实验方法)
[0314]
在包含1％的芥花油的bs培养液中，将kh
‑
1株进行48小时发酵罐培养，从其上清中使用丁基琼脂糖柱纯化具有代表性序列的第1脂肪酶和第2脂肪酶。将第1脂肪酶和第2脂肪酶的溶液调整为5u/ml。将(a)反棕榈油酸和(b)反式异油酸的各反式脂肪酸单体以各脂肪酸单体为0.5％的方式溶解于甲醇，作为储备溶液。将各反式脂肪酸储备溶液80μl与各酶溶液20μl的混合液分注到带螺帽的管，在37℃的培养箱中静置72小时。需要说明的是，将与不含脂肪酶的缓冲液的混合物作为对照区。之后，向各溶液中添加100μl的水和50μl的氯仿，用涡旋混合器充分搅拌后，以12,000g进行5分钟离心分离。对于5μl的下层的氯仿层，使用以体积比分别为80：20：1的比率包含己烷、乙醚和乙酸的展开溶剂供于tlc分析。
[0315]
(结果)
[0316]
将实施例16的结果示于图15。本发明的第1脂肪酶和第2脂肪酶中的任一者均催化作为反式脂肪酸的反棕榈油酸和反式异油酸的酯交换反应，分别生成反棕榈油酸甲酯和反
式异油酸甲酯。由此明确了，这些酶在反油酸以外的反式脂肪酸的反应中也是有用的。
[0317]
(实施例17：本发明的第1脂肪酶的变体的油脂分解活性)
[0318]
本实施例中，分析本发明的第1脂肪酶的变体的油脂分解活性。
[0319]
(实验方法)
[0320]
根据使用短芽孢杆菌表达系统的表达系统(bic system:takara)构建了变体(序列号16)的表达构建体，所述变体将本发明的具有代表性序列的第1脂肪酶(序列号4)的氨基酸序列中的、与第1位、第3位、第6位、第137位、第220位、第227位、第243位、第276位和第316位对应的氨基酸分别置换为丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸。将菌体在向2sy培养基中添加终浓度为50μg/ml的新霉素而成的培养基，在30℃下培养48小时。将培养而得的菌的上清50ml上样到丁基琼脂糖柱，洗脱到包含0.25％tritonx
‑
100的20mm tris
‑
hcl、2mm cacl2中。需要说明的是，重组脂肪酶在成熟型序列的n末端添加有ad+6xhis+dddk(肠激酶识别序列)。作为油脂，使用三油酸甘油酯(tole)和三反油酸甘油酯(ted)，在以下实验条件下通过tlc分析各油脂的分解活性：
[0321]
·
油脂的种类：三油酸甘油酯、三反油酸甘油酯
[0322]
·
反应液：20mm tris
‑
hcl(ph7.0),2mm cacl2,0.5％triton x100
[0323]
·
油脂终浓度：0.2％
[0324]
·
处理方法：向微量离心管(eppendorf tubes)中加入100μl的酶溶液，添加1/5量的10x各油脂储备物。
[0325]
·
处理温度：37℃
[0326]
·
处理时间：48小时
[0327]
·
油分提取：用一半量的氯仿进行萃取，上样10μl，进行tlc。
[0328]
·
展开板：硅胶涂布板
[0329]
·
展开溶剂：氯仿：丙酮：甲醇＝96:4:2
[0330]
·
检测：利用钼酸多水合物进行显色(2.4g/60ml etoh)
[0331]
(结果)
[0332]
将实施例17的结果示于图16。具有上述9处变异的变体也具有高油脂分解活性。
[0333]
(实施例18：本发明的第2脂肪酶的变体的油脂分解活性)
[0334]
本实施例中，分析本发明的第2脂肪酶的变体的油脂分解活性。
[0335]
(实验方法)
[0336]
根据使用短芽孢杆菌表达系统的表达系统(bic system:takara)构建了变体(序列号18)的表达构建体，所述变体将本发明的具有代表性序列的第2脂肪酶(序列号11)的氨基酸序列中的第13位、第26位、第45位、第75位、第100位、第138位、第168位、第171位、第214位、第230位、第234位、第248位、第250位、第331位和第360位的氨基酸分别置换为亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和丙氨酸。将菌体在向tm培养基中添加终浓度20mm的mgcl2和终浓度50μg/ml的新霉素的培养基中在30℃下培养72小时。将培养而得的菌的上清50ml上样到丁基琼脂糖柱中，洗脱到包含0.25％tritonx
‑
100的20mm tris
‑
hcl、2mm cacl2中。需要说明的是，重组脂肪酶在推定的切除了信号序列的序列的n末端添加有ad+6xhis+dddk(肠激酶识别序列)。作为油脂，使用三油酸甘油酯(tole)和三反油酸甘油酯(ted)，在以下实验条
件下通过tlc分析各油脂的分解活性：
[0337]
·
油脂的种类：三油酸甘油酯、三反油酸甘油酯
[0338]
·
反应液：20mm tris
‑
hcl(ph7.0),2mm cacl2,0.5％triton x100
[0339]
·
油脂终浓度：0.2％
[0340]
·
处理方法：向微量离心管加入100μl的酶溶液，添加1/5量的10x各油脂储备。
[0341]
·
处理温度：37℃
[0342]
·
处理时间：48小时
[0343]
·
油分提取：用等量的氯仿进行萃取，上样10μl，进行tlc。
[0344]
·
展开板：硅胶涂布板
[0345]
·
展开溶剂：氯仿：丙酮：甲醇＝96:4:2
[0346]
·
检测：利用钼酸多水合物进行显色(2.4g/60ml etoh)
[0347]
(结果)
[0348]
将实施例18的结果示于图17。具有上述15处变异的变体也具有高油脂分解活性。
[0349]
(附注)
[0350]
如上，使用本公开的优选实施方式示例出了本发明，但可理解的是本发明仅通过权利要求书解释其范围。可理解的是，对于本说明书中引用的专利、专利申请和其它文献，其内容本身以与本说明书中具体记载的内容同样内容的方式作为参考引用至本说明书中。本申请对2018年7月6日向日本特许厅提出的日本特愿2018
‑
129504要求优先权，应理解其内容均作为参考而被引入本说明书。
[0351]
产业上的可利用性
[0352]
本公开在分解含反式脂肪酸油脂中、在对食品工场等而言成为问题的含反式脂肪酸排水的处理等中具有有用性。
[0353]
保藏编号
[0354]
nite bp
‑
02731
[0355]
序列号1本公开的第1脂肪酶的代表性核酸序列的成熟序列
[0356]
序列号2本公开的第1脂肪酶的代表性核酸序列中包含了编码前序列的核苷酸的核酸序列
[0357]
序列号3本公开的第1脂肪酶的代表性核酸序列的全长序列
[0358]
序列号4本公开的第1脂肪酶的代表性氨基酸序列的成熟序列
[0359]
序列号5本公开的第1脂肪酶的代表性氨基酸序列中包含了前序列的氨基酸序列
[0360]
序列号6本公开的第1脂肪酶的代表性氨基酸序列的全长序列
[0361]
序列号7本公开的第2脂肪酶的代表性核酸序列的成熟序列
[0362]
序列号8本公开的第2脂肪酶的代表性核酸序列中包含了编码短链前序列的核苷酸的核酸序列
[0363]
序列号9本公开的第2脂肪酶的代表性核酸序列中包含了编码长链前序列的核苷酸的核酸序列
[0364]
序列号10本公开的第2脂肪酶的代表性核酸序列的全长序列
[0365]
序列号11本公开的第2脂肪酶的代表性氨基酸序列的成熟序列
[0366]
序列号12本公开的第2脂肪酶的代表性氨基酸序列中包含了短链前序列的氨基酸
序列
[0367]
序列号13本公开的第2脂肪酶的代表性氨基酸序列中包含了长链前序列的氨基酸序列
[0368]
序列号14本公开的第2脂肪酶的代表性氨基酸序列的全长序列
[0369]
序列号15本公开的第1脂肪酶的代表性核酸序列的成熟序列的改造序列
[0370]
序列号16本公开的第1脂肪酶的代表性氨基酸序列的成熟序列的改造序列
[0371]
序列号17本公开的第2脂肪酶的代表性核酸序列的成熟序列的改造序列
[0372]
序列号18本公开的第2脂肪酶的代表性氨基酸序列的成熟序列的改造序列