3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的制造方法
技术领域
1.本发明涉及使用微生物的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的制造方法。
背景技术：
2.聚苯并噁唑(pbo)作为耐热性、力学强度优异的工程塑料而已知，用于纤维材料及半导体元件的绝缘膜等(非专利文献1)。
3.苯并噁唑骨架通过邻氨基苯酚骨架与羧酸的缩合而生成。因此，期待在分子内具有这些官能团的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸(haba)类作为pbo单体是有用的。实际上，研究了使用haba的聚苯并噁唑的合成和物性评价(非专利文献2)。
4.近年来，面向地球环境负荷减轻等以可再生能源为原料的利用微生物发酵的化合物的制造方法备受瞩目。例如，进行了具有与haba类似的结构的3
‑
氨基
‑4‑
羟基苯甲酸(ahba)的微生物的生产和聚合物化的研究(专利文献1)。
5.关于haba的制造，迄今为止已知有化学还原并合成硝基芳香族的方法等(专利文献2)。作为能够利用微生物法进行haba发酵生产的对策，可以考虑对可在微生物内进行生物合成的4
‑
氨基苯甲酸(aba)的3位进行氢氧化，但关于这种反应，仅报道了一部分的4
‑
羟基苯甲酸羟化酶具有轻微的活性(非专利文献3、4)。
6.专利文献1：日本特许第5445453号公报
7.专利文献2：日本特许第3821350号公报
8.非专利文献1：村濑浩贵，seni gakkaishi(纤维与工业)，vol.66，no.6(2010)
9.非专利文献2：lon j.mathias et al.,macromolecules,vol.18,no.4,pp.616
‑
622(1985)
10.非专利文献3：barrie entsch et al.,the journal of biological chemistry,vol.262,no.13,pp.6060
‑
6068(1987)
11.非专利文献4：domenico l.gatti et al.,biochemistry,vol.35,no.2,pp.567
‑
578(1996)
技术实现要素：
12.本发明涉及以下内容。
13.一种3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的制造方法，其中，包括使4
‑
氨基苯甲酸类与产生下述(a)或(b)的多肽的微生物接触的工序，
14.(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽，或由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽；
15.(b)由序列号6所示的氨基酸序列构成的多肽，或由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽。
具体实施方式
16.本发明涉及提供使用微生物的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的制造方法。
17.本发明人等发现，通过使用产生特定的4
‑
羟基苯甲酸羟化酶的微生物，能够高效地对4
‑
氨基苯甲酸(aba)类的3位进行氢氧化。
18.根据本发明，能够高效地制造3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类。
19.(1)定义
20.在本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性通过lipman
‑
pearson法(science,1985,227:1435
‑
1441)来计算。具体而言，通过使用遗传信息处理软件genetyx ver.12的同源性分析(search homology)程序，将unit size to compare(ktup)作为2进行分析来计算。
21.本说明书中，关于氨基酸序列或核苷酸序列的“至少90％的同一性”是指90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、且优选99％以上的同一性。
22.本说明书中的“缺失、取代、添加、或插入有1个或多个氨基酸的氨基酸序列”是指1个以上且10个以下、优选为1个以上且8个以下、更优选为1个以上且5个以下、进一步优选为1个以上且3个以下的氨基酸缺失、取代、添加、或插入的氨基酸序列。此外，本说明书中的“缺失、取代、添加、或插入有1个或多个核苷酸的核苷酸序列”是指1个以上且30个以下、优选为1个以上且24个以下、更优选为1个以上且15个以下、进一步更优选为1个以上且9个以下的核苷酸缺失、取代、添加、或插入的核苷酸序列。在本说明书中，氨基酸或核苷酸的“添加”中包含序列的一末端及两末端的氨基酸或核苷酸的添加。
23.在本说明书中，控制区域和基因的“可工作地连接”是指基因和控制区域以该基因能够在该控制区域的控制下表达的方式连接。基因和控制区域的“可工作地连接”的顺序是本领域技术人员公知的。
24.在本说明书中，用于细胞的功能、性状、特性的用语“本来”是为了表示该功能、性状、特性存在于该细胞的野生型而使用的。对照而言，用语“外来”不是从原来存在于该细胞，而是用于表示从外部导入的功能、性状、特性。例如，“外来”基因或多核苷酸为从外部导入细胞的基因或多核苷酸。外来基因或多核苷酸可以是与导入其的细胞同种的生物来源，也可以是不同种的生物来源(即异种基因或多核苷酸)。
25.(2)3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的制造
26.本发明的方法是使用微生物从4
‑
氨基苯甲酸类制造3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的方法。
27.作为4
‑
氨基苯甲酸类，具体而言，可以举出由下述通式(1)所示的4
‑
氨基苯甲酸衍生物：
[0028][0029]
[式中，r1表示氢原子、羟基(
‑
oh)、甲氧基(
‑
och3)、氨基(
‑
nh2)、氟原子(
‑
f)、氯原子(
‑
cl)、溴原子(
‑
br)、碘原子(
‑
i)、羧基(
‑
cooh)、甲基(
‑
ch3)、乙基(
‑
ch2ch3)，r2表示氢原
子、羟基(
‑
oh)、甲氧基(
‑
och3)、氨基(
‑
nh2)、氟原子(
‑
f)、氯原子(
‑
cl)、溴原子(
‑
br)、碘原子(
‑
i)、羧基(
‑
cooh)、甲基(
‑
ch3)或乙基(
‑
ch2ch3)]。
[0030]
作为3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类，可以举出由下述通式(2)所示的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸衍生物：
[0031][0032]
[式中，r1及r2表示与上述相同的基团，x中的一个表示氢原子，另一个表示羟基]。
[0033]
作为r1所示的官能团，优选氢原子、羟基(
‑
oh)、甲氧基(
‑
och3)、氟原子(
‑
f)或甲基(
‑
ch3)。
[0034]
作为r2所示的官能团，优选氢原子、羟基(
‑
oh)、甲氧基(
‑
och3)、氟原子(
‑
f)或甲基(
‑
ch3)。
[0035]
更优选r1及r2均为氢原子。
[0036]
本发明中使用的微生物是产生下述(a)或(b)的多肽(以下，也称为“本发明的多肽”)的微生物。
[0037]
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽，或由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽；
[0038]
(b)由序列号6所示的氨基酸序列构成的多肽，或由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽。
[0039]
在此，由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽(也称为“hfm122”)、由序列号6所示的氨基酸序列构成的多肽(也称为“hfm689”)是作为4
‑
羟基苯甲酸
‑3‑
单加氧酶(ec1.14.13.2)而已知的。
[0040]
作为与序列号2或6所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列的例子，可以举出相对于序列号2或6所示的氨基酸序列缺失、取代、添加、或插入有1个或多个氨基酸的氨基酸序列。
[0041]“4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性”是指4
‑
羟基苯甲酸羟化酶所示的催化活性，4
‑
羟基苯甲酸羟化酶是指对4
‑
羟基苯甲酸的氢氧化进行催化的酶，优选为对4
‑
羟基苯甲酸的3位进行氢氧化，具有促进生成原儿茶酸的反应及其逆反应中的任一种或两种的催化活性的4
‑
羟基苯甲酸
‑3‑
单加氧酶。
[0042]4‑
羟基苯甲酸羟化酶活性可以通过例如公知的方法(yan huang et al.,appl.microbiol.biotechnol.,78,75
‑
83(2008).)等来决定。
[0043]
作为对氨基酸序列导入氨基酸的缺失、取代、添加、或插入等突变的方法，例如可以举出对编码该氨基酸序列的核苷酸序列导入核苷酸的缺失、取代、添加、或插入等突变的方法。作为向核苷酸序列的突变导入的方法，例如可以举出：乙基甲烷磺酸盐、n
‑
甲基
‑
n
‑
亚硝基胍、亚硝酸等化学突变原或紫外线、x射线、γ射线、离子束等物理突变原导致的诱变、位点特异性突变导入法、dieffenbach等(cold spring harbar laboratory press,new york,581
‑
621,1995)中记载的方法等。作为位点特异性突变导入的方法，可以举出利用了
splicing overlap extension(soe)pcr(horton et al.,gene 77,61
‑
68,1989)的方法、oda法(hashimoto
‑
gotoh et al.,gene,152,271
‑
276,1995)、kunkel法(kunkel,t.a.,proc.natl.acad.sci.usa,1985,82,488)等。或者，也可以利用site
‑
directed mutagenesis system mutan
‑
superexpress km试剂盒(takara bio公司)、transformer
tm site
‑
directed mutagenesis试剂盒(clonetech公司)、kod
‑
plus
‑
mutagenesis kit(东洋纺公司)等市售的位点特异性突变导入用试剂盒。
[0044]
在本发明的“产生多肽的微生物”中，该多肽不限于外来物质，也包括该微生物本来具有的物质，只要以能够表达的状态含有该多肽的表达所需的多核苷酸即可，优选为该多核苷酸以能够表达的方式被导入的微生物、该多核苷酸的表达被强化的微生物、即基因重组微生物。
[0045]
在此，作为多核苷酸，可以举出下述的(a)或(b)的多核苷酸(以下，也称为“本发明的多核苷酸”)。
[0046]
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，或由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的多核苷酸；
[0047]
(b)由序列号5所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，或由与序列号5所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的多核苷酸。
[0048]
作为与序列号1或5所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列的例子，可以举出相对于序列号1或5所示的核苷酸序列缺失、取代、添加、或插入有1个或多个核苷酸的核苷酸序列。在核苷酸序列中导入核苷酸的缺失、取代、添加、或插入等突变的方法如上所述。上述多核苷酸可以是1根链或2根链的形态，或者可以是dna也可以是rna。该dna可以是cdna、化学合成dna等人工dna。
[0049]
上述多核苷酸可以重组至载体中。优选含有本发明的多核苷酸的载体为表达载体。此外，优选该载体是能够将本发明的多核苷酸导入至宿主微生物、且能够在宿主微生物内表达该多核苷酸的表达载体。优选该载体包含本发明的多核苷酸、以及与其可工作地连接的控制区域。该载体可以是在质粒等染色体外能够自我增殖和复制的载体，或者也可以是重组于染色体内的载体。
[0050]
作为具体的载体的例子，例如可以举出：pbluescript ii sk(
‑
)(stratagene)、puc18/19、puc118/119等puc系载体(takara bio)、pet系载体(takara bio)、pgex系载体(ge healthcare)、pcold系载体(takara bio)、phy300plk(takara bio)、pub110(mckenzie,t.et al.,1986,plasmid 15(2):93
‑
103)、pbr322(takara bio)、prs403(stratagene)、pmw218/219(nippon gene)、pri 909/910等pri系载体(takara bio)、pbi系载体(clontech)、in3系载体(inplanta innovations)、pptr1/2(takara bio)、pdjb2(d.j.ballance et al.,gene,36,321
‑
331,1985)、pab4
‑
1(van hartingsveldt w et al.,mol gen genet,206,71
‑
75,1987)、pleu4(m.i.g.roncero et al.,gene,84,335
‑
343,1989)、ppyr 225(c.d.skory et al.,mol genet genomics,268,397
‑
406,2002)、pfg1(gruber,f.et al.,curr genet,18,447
‑
451,1990)等。
[0051]
此外，上述多核苷酸也可以构建为含有该多核苷酸的dna片段。作为该dna片段，例
如可以举出pcr扩增dna片段及限制性内切酶切断dna片段。优选该dna片段可以为包含本发明的多核苷酸、及与其可工作地连接的控制区域的表达盒。
[0052]
上述载体或dna片段中包含的控制区域是用于在导入了该载体或dna片段的宿主细胞内表达本发明的多核苷酸的序列，例如可以举出启动子或终止子等表达调节区域、复制起始点等。该控制区域的种类可以根据导入载体或dna片段的宿主微生物的种类适当选择。根据需要，该载体或dna片段还可以具有抗生素抗性基因、氨基酸合成相关基因等选择标记。
[0053]
作为对宿主细胞以能够表达的方式导入本发明的多核苷酸或强化本发明的多核苷酸的表达的手段，例如可以举出：将含有与控制区域、优选与强控制区域(与野生型相比能够强化表达的控制区域)可工作地连接的本发明的多核苷酸的载体或dna片段导入至宿主微生物，或者在宿主微生物的基因组上，将强控制区域与本发明的多核苷酸以可工作地连接进行配置(例如，将母细胞的基因组上的本发明的多核苷酸的控制区域序列取代为强控制区域)等。
[0054]
作为宿主细胞，可以使用真菌、酵母、放线菌、大肠杆菌、枯草杆菌等中的任一种，但优选大肠杆菌、放线菌。作为放线菌，可以举出棒状杆菌属菌、分枝杆菌属菌、红球菌属菌、链霉菌属菌、丙酸杆菌属菌等，优选为棒状杆菌属菌，更优选为谷氨酸棒状杆菌。
[0055]
向上述微生物导入载体或dna片段时，可以使用一般的转化法，例如电穿孔法、转化法、转染法、拼接法、原生质体法、粒子枪法、农杆菌法等。
[0056]
导入有目标载体或dna片段的微生物可以利用选择标记进行选择。例如，在选择标记为抗生素抗性基因的情况下，通过在该抗生素添加培养基中进行培养，能够选择导入有目标载体或dna片段的微生物(转化体)。此外，例如，在选择标记为氨基酸合成相关基因的情况下，在对该氨基酸要求性的宿主微生物进行基因导入后，能够以该氨基酸要求性的有无为指标，选择导入有目标载体或dna片段的微生物。或者，也可以通过利用pcr等检查转化体的dna序列来确认目标载体或dna片段的导入。
[0057]
此外，作为强控制区域，可例示作为公知的高表达启动子的t7启动子、lac启动子、tac启动子、trp启动子等，但并不特别限定于这些。
[0058]
作为将存在于宿主微生物的基因组上的上述多核苷酸的控制区域取代为强控制区域的方法，可以举出将包含强控制区域和选择标记的多核苷酸序列的dna片段导入至宿主细胞，选择通过同源重组或非同源重组等转化的微生物的方法等。
[0059]
培养如此制备的本发明的产生多肽的微生物，评价3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的生产率，选择适当的重组体，由此可以得到有用的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的生产菌株。产物的测定方法可以按照后述参考例中记载的方法进行。
[0060]
本发明的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的制造方法通过使4
‑
氨基苯甲酸类与产生上述多肽的微生物接触来实施。微生物与4
‑
氨基苯甲酸类的接触条件可以根据所使用的微生物适当设计。
[0061]
即，培养本发明的微生物的培养基只要是含有碳源、氮源、无机盐类等、能够高效地培养该微生物的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。作为碳源，例如可以使用葡萄糖等糖类、甘油等多元醇类、乙醇等醇类、或丙酮酸、琥珀酸或柠檬酸等有机酸类。此外，作为氮源，例如可以使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆
粕碱性提取物、甲胺等烷基胺类、或氨或其盐等。此外，也可以根据需要使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类、特定的氨基酸、特定的维生素、消泡剂等。
[0062]
培养通常可以在10℃～40℃下根据需要边搅拌或振荡边进行6小时～72小时、优选9小时～60小时、更优选12小时～48小时。此外，培养中也可以根据需要在培养基中添加氨苄西林、卡那霉素等抗生素。
[0063]
培养物(包含培养液、培养上清、培养菌体、菌体的破碎物等)与4
‑
氨基苯甲酸类的接触方法没有特别限制，可以在微生物的培养中接触，也可以在培养后另行接触。此外，4
‑
氨基苯甲酸类可以在培养中在菌体内生物合成，也可以从外部添加。对接触条件没有特别限制，通常可以在20℃～50℃下根据需要边搅拌或振动边进行5分钟～72小时、优选1小时～60小时、更优选1小时～24小时。
[0064]
在培养物与4
‑
氨基苯甲酸类接触后，在菌体内生产3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的情况下，可以通过使用通常已知的方法、例如使用机械方法、溶菌酶等的酶的方法或表面活性剂等的化学处理来破坏菌体，从而提取3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类。此外，在菌体外生产3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的情况下，直接使用培养液，或通过离心分离等除去菌体。
[0065]
对来自培养物的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的采集及分离方法没有特别限制。即，可以通过组合公知的离子交换树脂法、沉淀法、结晶法、重结晶法、浓缩法等其它方法来实施。例如，将菌体通过离心分离等除去后，用阳离子和阴离子交换树脂除去离子性物质，如果浓缩，则可以取得3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类。培养物中蓄积的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类可以不分离直接使用。
[0066]
关于上述的实施方式，在本发明中还公开了以下的方式。
[0067]
<1>一种3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类的制造方法，其中，包括使4
‑
氨基苯甲酸类与产生下述(a)或(b)的多肽的微生物接触的工序，
[0068]
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽，或由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成、且具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽；
[0069]
(b)由序列号6所示的氨基酸序列构成的多肽，或由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、且具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽。
[0070]
<2>根据<1>所述的方法，其中，微生物以能够表达下述(a)或(b)的多核苷酸的状态而含有下述(a)或(b)的多核苷酸，
[0071]
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，或由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的多核苷酸；
[0072]
(b)由序列号5所示的核苷酸序列构成的多核苷酸，或由与序列号5所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成、且编码具有4
‑
羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的多核苷酸。
[0073]
<3>根据<1>或<2>所述的方法，其中，微生物为大肠杆菌或棒状杆菌属菌。
[0074]
<4>根据<1>～<3>中任一项所述的方法，其中，4
‑
氨基苯甲酸类为由下述通式(1)所示的4
‑
氨基苯甲酸衍生物：
[0075][0076]
[式中，r1表示氢原子、羟基(
‑
oh)、甲氧基(
‑
och3)、氨基(
‑
nh2)、氟原子(
‑
f)、氯原子(
‑
cl)、溴原子(
‑
br)、碘原子(
‑
i)、羧基(
‑
cooh)、甲基(
‑
ch3)、乙基(
‑
ch2ch3)，r2表示氢原子、羟基(
‑
oh)、甲氧基(
‑
och3)、氨基(
‑
nh2)、氟原子(
‑
f)、氯原子(
‑
cl)、溴原子(
‑
br)、碘原子(
‑
i)、羧基(
‑
cooh)、甲基(
‑
ch3)或乙基(
‑
ch2ch3)]，
[0077]3‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸类为由下述通式(2)所示的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸衍生物：
[0078][0079]
[式中，r1及r2表示与上述相同的基团，x中的一个表示氢原子，另一个表示羟基]。
[0080]
<5>根据<4>所述的方法，其中，在式(1)所示的4
‑
氨基苯甲酸衍生物和式(2)所示的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸衍生物中，r1优选为氢原子、羟基(
‑
oh)、甲氧基(
‑
och3)、氟原子(
‑
f)或甲基(
‑
ch3)。
[0081]
<6>根据<4>或<5>所述的方法，其中，在式(1)所示的4
‑
氨基苯甲酸衍生物和式(2)所示的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸衍生物中，r2优选为氢原子、羟基(
‑
oh)、甲氧基(
‑
och3)、氟原子(
‑
f)或甲基(
‑
ch3)。
[0082]
<7>根据<4>所述的方法，其中，在式(1)所示的4
‑
氨基苯甲酸衍生物和式(2)所示的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸衍生物中，r1和r2均为氢原子。
[0083]
<8>根据<1>～<7>中任一项所述的方法，其中，4
‑
氨基苯甲酸类与微生物的接触为使微生物的菌体破碎液与4
‑
氨基苯甲酸类在20℃～50℃下接触5分钟～72小时、优选1小时～60小时、更优选1小时～24小时。
[0084]
实施例
[0085]
以下，基于实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于此。
[0086]
实施例1转化株的制作
[0087]
将本实施例中使用的pcr引物示于表1。
[0088]
[表1]
[0089]
引物序列(5＇
→
3＇)序列号pet hfm122fgaaggagatatacatatgcgcactcaggtggctat7pet hfm122rgtggtggtggtggtgttatacgagtggcagtccta8pet phhyart_pa fgaaggagatatacatatgaaaactcaggtggctat9pet phhyart_pa rgtggtggtggtggtgttactcgatctcctcgtaag10pet hfm689art fgaaggagatatacatatgaaaacccaggttgccat11pet hfm689art rgtggtggtggtggtgttagacgggcagaccgacgt12pet21a vec ratgtatatctccttcttaaagttaaac13
pet21a vec fcaccaccaccaccaccactgagatc14forcpcr pet21a fcgaaattaatacgactcactataggggaattgtg15forcpcr pet21a rccaaggggttatgctagttattgctcag16
[0090]
<质粒载体的制作>
[0091]
通过人工基因合成制作含有编码从黄素单加氧酶中选择的3种4
‑
羟基苯甲酸羟化酶(hfm122、hfm300和hfm689)的基因(序列号1、3、5)的质粒，将其作为模板，通过使用引物pet hfm122 f(序列号7)、pet hfm122 r(序列号8)、pet phhyart_pa f(序列号9)、pet phhyart_pa r(序列号10)、pet hfm689art f(序列号11)、pet hfm689art r(序列号12)的pcr，合成插入用dna片段。接着，以质粒pet21a为模板，通过使用引物pet21a vec r(序列号13)和pet21a vec f(序列号14)的pcr，扩增载体用dna片段。使用in
‑
fusion hd cloning kit(clontech)分别连接以上的片段，构建质粒载体pet
‑
hfm122、pet
‑
hfm300、pet
‑
hfm689。
[0092]
<质粒载体的扩增>
[0093]
使用上述制作的质粒载体pet
‑
hfm122、pet
‑
hfm300、pet
‑
hfm689，通过感受态细胞转化法转化大肠杆菌dh5α株(nippon gene)。将得到的转化细胞液涂布于lbamp琼脂培养基(细菌胰蛋白胨(bacto trypton)1％、酵母提取物0.5％、nacl 1％、氨苄西林钠50μg/ml、琼脂1.5％)后，在37℃下静置一晚，对得到的菌落进行使用sapphire amp(takara)和引物forcpcr pet21a f(序列号15)、forcpcr pet21a r(序列号16)的pcr反应，选择确认了目标dna片段的导入的菌株作为转化株。将转化株接种于lbamp液体培养基(细菌胰蛋白胨(bacto trypton)1％、酵母提取物0.5％、nacl 1％、氨苄西林钠50μg/ml)1ml中，在37℃下培养一晚。使用高纯质粒分离试剂盒(roche life science)从该培养液进行各质粒载体的纯化。
[0094]
<质粒载体向宿主细胞的导入>
[0095]
使用上述得到的质粒载体pet
‑
hfm122、pet
‑
hfm300、pet
‑
hfm689，通过感受态细胞转化法转化大肠杆菌bl21(de3)株(nippon gene)。将得到的转化细胞液涂布于lbamp琼脂培养基后，在37℃下静置一晚，将得到的菌落作为转化株(hfm122株、hfm300株、hfm689株)。
[0096]
实施例2使用转化株的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸的生产
[0097]
<转化株的培养>
[0098]
将使用上述中得到的hfm122株、hfm300株、hfm689株分别接种于lbamp液体培养基(细菌胰蛋白胨(bacto trypton)1％、酵母提取物0.5％、nacl 1％、氨苄西林钠50μg/ml)1ml中，在37℃下培养一晚。将得到的培养液100μl接种于overnight express培养基(merck)10ml，在37℃下培养约24小时后，通过离心分离回收菌体。
[0099]
<菌体破碎液的制备>
[0100]
将上述得到的hfm122株、hfm300株、hfm689株的菌体使用bugbuster protein extraction reagent(merck)1ml进行悬浮，在30℃下振荡20分钟后，将通过离心分离除去不溶成分的物质作为菌体破碎液。
[0101]
<3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸的生产能力>
[0102]
在将100mm磷酸缓冲液(ph7.0)80μl、100mm nadph 20μl、20mm 4
‑
氨基苯甲酸20μl加入到添加有80μl的上述得到的hfm122株、hfm300株、hfm689株的菌体破碎液的96孔板(iwaki)中，静置1小时后，按照后述的参考例1中记载的顺序进行3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸的
定量。
[0103]
使用bio
‑
rad蛋白测定(bio
‑
rad)对菌体破碎液的总蛋白量进行定量，按照下述式算出hfm122株和hfm689株中的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸的生产能力和其提高率。
[0104]3‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸生产能力＝(反应后的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸浓度/总蛋白量)
[0105]
生产能力提高率(％)＝(hfm122株和hfm689株的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸生产能力/hfm300株的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸生产能力)
×
100
‑
100
[0106]
将结果示于表2。与非专利文献3、4中存在启示的hfm300株相比，在hfm122株和hfm689株中，分别观察到46％和114％的生产能力的提高。
[0107]
[表2]
[0108]
株名3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸浓度(g/l)生产能力提高率(％)hfm122株0.08246hfm300株0.056
‑
hfm689株0.120114
[0109]
参考例1 3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸的定量
[0110]
反应后的3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸的定量通过hplc进行。将供于hplc分析的反应液用0.1％磷酸适当稀释后，使用acroprep 96孔板(0.2μm ghp膜，nihon pall)进行不溶物的除去。
[0111]
hplc的装置使用lachrom elite(hitachi high
‑
technologies)。分析柱使用l
‑
柱ods(4.6mm i.d.
×
50cm，化学物质评价研究机构)，将洗脱液a设为0.1％磷酸，将洗脱液b设为70％甲醇，在流速1.0ml/分钟、柱温40℃的条件下进行梯度洗脱。对于3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸的检测，使用uv检测器(检测波长280nm)。使用标准试样[3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸(销售商编码a1194，东京化成工业)]制作浓度校准曲线，基于浓度校准曲线进行3
‑
羟基
‑4‑
氨基苯甲酸的定量。