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背景技术：
干细胞通过增殖产生分化的细胞为生物体提供了维持和修复特定组织的手段。造血干细胞移植已用来向患者提供产生血细胞的能力，通常在这种情况下患者已通过化疗或其他调理方案消融了内源性造血干细胞。
造血细胞移植通常涉及静脉输注包括造血干细胞在内的自体或同种异体造血细胞。这些造血细胞是从骨髓、外周血或脐带血收集的，并经移植以在骨髓或免疫系统受损或有缺陷的患者中重建造血功能。此过程通常作为治疗的一部分进行，以消除骨髓浸润过程(例如白血病)或纠正先天性免疫缺陷疾病。造血细胞移植还用于允许癌症患者接受比骨髓通常能够耐受的更高剂量的化疗；然后通过用先前收集的干细胞替换骨髓来挽救骨髓功能(通常参见wo2004/002425和wo2018/140940)。
发明概述
本发明提供了造血干细胞或祖细胞(hspc)，其经基因修饰以表达受体，所述受体赋予基因修饰的hspc在引入受试者时相对于内源性hspc的选择性增殖优势。任选地，所述细胞是原始干细胞。
本发明进一步提供了如上文或下文所定义的至少105个hspc的群体。任选地，至少105个hspc是cd34+。任选地，所述群体是纯系的(clonal)。任选地，所述群体包括原始干细胞和共同祖细胞。
在有些细胞中，所述受体是b2m/mhc-1、pd-l1、cd24、gas6、cd47、c-kit中的任一种或多种此类受体的组合。在有些细胞中，所述受体是突变体形式，其中所述突变体相对于所述受体的野生型形式具有与抗体的结合减少。在有些细胞中，受体是cd47或c-kit。有些细胞经进一步基因修饰以表达功能性人蛋白，使得所述hspc可以缓解遗传疾病。所述遗传疾病是由于患有所述疾病的受试者中编码人蛋白的基因的突变。在有些细胞中，人蛋白是血红蛋白。
一些hspc通过靶向构建体和内源性基因座之间的同源重组进行基因修饰。在某些hspc中，基因修饰是杂合的。在某些hspc中，基因修饰是纯合的。
本发明提供一种修饰hspc的方法，其包括向所述hspc中引入构建体，所述构建体并入hspc的基因组中，从而形成可表达受体的转录单元，所述受体赋予基因修饰的hspc相对于修饰前的hspc的选择性增殖优势。任选地，所述构建体包含转录单元，所述转录单元包含编码所述受体的片段，所述片段与用于其表达的调控序列可操作地连接。任选地，所述构建体与内源性基因座进行同源重组。任选地，所述方法包括将核酸酶引入所述hspc中，所述核酸酶切割邻近所述同源重组的基因座的基因组dna，从而刺激所述同源重组。任选地，通过引入编码所述核酸酶的构建体来引入核酸酶，所述构建体在hspc中表达。
本发明还提供一种治疗受试者的方法，其包括(a)施用与c-kit特异性结合的免疫治疗剂，以耗竭表达c-kit的内源性hspc；和(b)施用经基因修饰以表达受体的替代性hspc，所述受体赋予基因修饰的hspc相对于内源性hspc的选择性增殖优势，从而抵抗通过所述与c-kit特异性结合的免疫治疗剂的耗竭，其中所述替代性hspc至少部分地替代内源性hspc。任选地，赋予选择性增殖优势的受体是cd47。任选地，所述cd47受体包含突变，并且所述方法还包括施用抗体或sirpαfc融合蛋白，所述抗体或sirpαfc融合蛋白以比其与突变的受体结合和对突变的受体与sirpα的拮抗(如果有的话)更强地与野生型cd47结合和拮抗其与sirpα的相互作用。任选地，在实行步骤(b)之前内源性hspc仅部分耗竭。任选地，在步骤(b)之前实行步骤(a)。任选地，与步骤(b)同时或在其之后执行步骤(a)。任选地，当进行所述引入步骤时，所述与c-kit特异性结合的免疫治疗剂在血清中是可检测的。任选地，所述与c-kit特异性结合的免疫治疗剂在步骤(b)之前和之后多次施用。任选地，与c-kit特异性结合的免疫治疗剂是抗体。任选地，所述抗体具有有效促进adcc或adp的fc结构域。
任选地，受试者患有血细胞类型的遗传疾病，并且所述替代性hspc发育成没有所述疾病的类型的血细胞。任选地，替代性hspc是自体细胞，其已经经进一步基因修饰以没有所述疾病。任选地，遗传疾病是镰状细胞性贫血。任选地，所述受试者患有癌症。任选地，所述癌症是血细胞的癌症，其表达c-kit或衍生自表达c-kit的hspc。任选地，所述受试者患有癌症并且已经接受了抗癌化疗。任选地，受试者在步骤(a)之后接受器官移植。
定义
受试者包括通过所公开的方法治疗的人类和其它动物，特别是哺乳动物，包括宠物和实验动物，例如小鼠、大鼠、兔。因此，所述方法适用于人类治疗和兽医应用。
免疫治疗剂是指抗指定靶标的抗体或fc融合蛋白。例如，抗cd47抗体和sirp。-fc融合蛋白是抗cd47的免疫治疗剂。
核酸或氨基酸序列的可操作连接是指序列经连接使得每个序列都可以执行其预期的功能。例如，启动子与编码序列的可操作连接意味着编码序列可以从启动子表达。蛋白质与信号肽的可操作连接意味着信号肽可以引导蛋白质的分泌或靶向蛋白质以并入细胞膜中。
功能性核酸或由核酸编码的蛋白质是指核酸的野生型形式，或其天然或诱导的变体，该变体可以支持将核酸表达成蛋白质的受试者的正常生理机能。换句话说，核酸在受试者中的表达不会导致具有部分或完全外显的病理状况。例如，包括对野生型功能不具有任何显著影响的一种或多种变异的野生型核酸或蛋白质的变体将被视为功能性核酸或蛋白质。这与包括突变的核酸或由其表达的蛋白质形成对比，后者在受试者中以杂合或纯合形式的存在与具有部分或完全外显的病理状况的发展相关联。将功能性核酸引入替代性hspc中，使得能够表达其编码的蛋白质，因此可以至少部分地缓解由内源性hspc中的核酸和/或蛋白质的突变形式引起的病状。
免疫治疗剂通常以独立的形式提供。这意味着这种试剂相对于由于其制备或纯化而产生的干扰蛋白和其他污染物而通常具有至少50％w/w纯度，但不排除该试剂与过量的药物可接受载体或旨在促进其使用的其它载体组合的可能性。有时试剂相对于由制备或纯化产生的干扰蛋白和污染物而具有至少60、70、80、90、95或99％w/w纯度。通常，试剂是其纯化后剩余的主要大分子物质。
免疫治疗剂与其靶抗原的特异性结合意味着至少106、107、108、109或1010m-1的亲和力。特异性结合可在数量上可检测地更高，并且可与至少一个不相关靶标发生的非特异性结合区分开。特异性结合可以是特定官能团或特定空间配合(例如，锁和钥匙类型)之间形成键的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。与其靶抗原特异性结合的免疫治疗剂也可以描述为抗其靶抗原。
基本的抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kda)和一条“重”链(约50-70kda)。每条链的氨基末端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，该可变区主要负责识别抗原。该可变区最初表达为连接至可裂解信号肽。没有信号肽的可变区有时称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区是指没有轻链信号肽的轻链可变区。然而，提及可变区并不意味着必须存在信号序列；而且实际上，一旦本发明的抗体或其他免疫治疗剂已经表达和分泌，信号序列就被切割。一对重链和轻链可变区限定了抗体的结合区。轻链和重链的羧基末端部分分别限定了轻链和重链的恒定区。重链恒定区主要负责效应物功能。在igg抗体中，重链恒定区划分为ch1、铰链、ch2和ch3区。在iga中，重链恒定区划分为ch1、ch2和ch3。ch1区通过二硫键和非共价键与轻链恒定区结合。铰链区提供了抗体的结合区和效应区之间的灵活性，并且还为四聚体亚基中两个重链恒定区之间的分子间二硫键提供了位点。ch2和ch3区是效应物功能和fcrn结合的主要位点。
轻链分为κ(kappa)或λ(lambda)型。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别定义为igg、igm、iga、igd和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“j”片段连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“d”片段。(通常参见《基础免疫学(fundamentalimmunology)》(paul，w.编辑，第二版，raven出版社，纽约，1989)，第7章)(出于所有目的通过全文引用的方式并入本文)。
每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点，即，是二价的。在天然抗体中，结合位点是相同的。然而，在双特异性抗体中，结合位点是不同的(例如，参见songsivilai和lachmann，clin.exp.immunol.，79:315-321(1990)；kostelny等人，j.immunol.，148:1547-53(1992))。可变区都表现出相对保守的框架区(fr)的相同通用结构，该框架区由三个高变区(也称为互补决定区或cdr)连接。来自每对的两条链的cdr通过框架区对齐，使得能够与特定的表位结合。从n端到c端，轻链和重链均包含结构域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。依照如下文献中的定义将氨基酸分配给每个结构域：kabat，《免疫重要的蛋白质的序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest))(美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，1987和1991)，或chothia&lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987)；chothia等人，nature342:878-883(1989)。kabat还提供了一种广泛使用的编号规定(kabat编号)，其中不同重链可变区之间或不同轻链可变区之间的相应残基分配相同的编号。尽管kabat编号可用于抗体恒定区，但eu索引更常用，就像本申请中的情况一样。
术语“表位”是指抗原上与双特异性抗体臂结合的位点。表位可以由连续氨基酸或通过一个或多个蛋白质的三次折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三次折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在用变性溶剂处理时丢失。一些抗体与末端特异性表位结合，这意味着相对于与另一多肽融合从而导致失去自由端的相同多肽，抗体优先与具有自由端的多肽结合。表位通常包括处于独特空间构象的至少3个，并且更通常至少5或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。例如，参见《分子生物学方法》中的“表位映射方案”，第66卷，glenne.morris编辑(1996)。
术语“抗原”或“靶抗原”表示由双特异性抗体的一个结合位点结合的靶分子。抗原可以是任何长度的蛋白质(天然、合成或重组表达的)、核酸或碳水化合物以及其他分子。抗原包括受体、配体、反受体和外壳蛋白。
识别相同或重叠表位的抗体可以在简单的免疫测定中鉴定，从而显示一种抗体与另一种抗体竞争结合靶抗原的能力。抗体的表位也可以通过对与其抗原结合的抗体应用x射线晶体学方法来定义以识别接触残基。或者，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的所有氨基酸突变减少或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
抗体之间的竞争是通过试验来确定，在该试验中，被测抗体抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合(参见例如junghans等人，cancerres.50:1495,1990)。如在竞争性结合试验中所测量的，如果过量的测试抗体(例如，至少2倍、5倍、10倍、20倍或100倍)抑制至少50％、但优选75％、90％或99％的参考抗体的结合，则测试抗体与参考抗体竞争。通过竞争试验鉴定的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和与离参考抗体结合的表位足够近以产生位阻的相邻表位结合的抗体。
为了将氨基酸取代分为保守或非保守的，将氨基酸进行如下分组：第i组(疏水侧链)：met、ala、val、leu、ile；第ii组(中性亲水侧链)：cys、ser、thr；第iii组(酸性侧链)：asp、glu；第iv组(碱性侧链)：asn、gln、his、lys，arg；第v组(影响链取向的残基)：gly，pro；和第vi组(芳族侧链)：trp，tyr，phe。保守取代涉及同一类氨基酸之间的取代。非保守取代涉及将这些类中之一的成员替换为另一类的成员。
用通过可变区的kabat编号规定或恒定区的eu编号最大对齐的抗体序列来确定序列同一性百分比。对齐后，如果将目标抗体区域(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域进行比较，则目标抗体区域和参考抗体区域之间的序列同一性百分比是目标抗体区域和参考抗体区域中的相同氨基酸所占据的位置的数量除以两个区域的对齐位置的总数(未计算间隙)，再乘以100以转换成百分比。
“包含”一种或多种所述元件的组合物或方法可包括未特别列举的其它元件。例如，包含抗体的组合物可以仅含有抗体或含有抗体与其他成分组合。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”或adcc是诱导细胞死亡的机制，其取决于抗体包被的靶细胞(即具有结合抗体的细胞)与具有裂解活性的免疫细胞(也称为效应细胞)的相互作用。这种效应细胞包括自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞。adcc由与细胞结合的抗体的fc区与免疫效应细胞(例如嗜中性粒细胞，巨噬细胞和自然杀伤细胞)上的fc疫受体(尤其是fc(尤其和fc(尤其是胞)之间的相互作用而触发。根据介导效应细胞的类型，通过吞噬作用或裂解作用消除靶细胞。抗体包被的靶细胞的死亡的发生是效应细胞活性的结果。
术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”或adcp是指抗体包被的细胞被与免疫球蛋白fc区结合的吞噬免疫细胞(例如巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)全部或部分内在化的过程。
术语“补体依赖性细胞毒作用”或cdc是指诱导细胞死亡的机制，其中结合靶标的抗体的fc效应结构域激活一系列酶促反应，最终在靶细胞膜中形成孔。通常，抗原-抗体复合物(例如抗体包被的靶细胞上的那些)结合并激活补体成分c1q，其进而激活补体级联反应，从而导致靶细胞死亡。补体的激活还可导致补体成分在靶细胞表面上的沉积，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如cr3)来促进adcc。
发明详述
i.一般内容
本发明提供了基因修饰的造血干细胞或祖细胞(hspc)以及在干细胞替代疗法中使用hspc的方法。hspc经基因修饰以表达受体，该受体赋予所引入的细胞相对于内源性hspc或未经修饰的对照hspc的选择性优势。这种受体的存在提供了对用于消除内源性hspc的免疫治疗方案的耐受性。因此，相对于内源性hspc，所述免疫治疗方案有利于所引入的hspc的增殖。基因修饰的hspc可用于替换患遗传疾病的内源性hspc，替换患恶性血液病或自身免疫性疾病的内源性hspc，替换受化疗方案损害的内源性hspc，或替换器官移植前消融的内源性hspc，以及其他应用。
ii.hspc
根据应用，要引入受试者的hspc可以是自体的(即来自该受试者)、同种异体的(来自相同物种的另一个个体)或异种的(来自不同物种)。如果是同种异体，则hspc可以完全或部分匹配或不匹配mhc等位基因。匹配的hspc可以从亲属或陌生人那里获得。
尽管所有hspc都能够增殖和分化成髓样或淋巴样谱系细胞或两者，但hspc包括处于不同分化阶段的细胞。原始干细胞可以无限增殖，并形成髓样和淋巴样谱系的所有细胞类型。原始干细胞分化为多能祖细胞，其可以产生髓样和淋巴样谱系的所有细胞，但不能无限增殖。多能祖细胞产生低能祖细胞，包括共同淋巴样祖细胞clp，其产生成熟的b淋巴细胞、t淋巴细胞和自然杀伤(nk)细胞。多能祖细胞也产生共同髓样祖细胞(cmp)，所述cmp进一步分化为粒细胞-巨噬细胞祖细胞，其分化成单核细胞/巨噬细胞和粒细胞；以及巨核细胞/红细胞祖细胞，其分化成巨核细胞/血小板和红细胞(参见图1，bryder等人，am.j.pathol.169,338-346(2006))。
原始hc和多能祖细胞可以通过实验彼此区分，例如通过实行鹅卵石样区域形成细胞实验(ploemacher等人，blood.78:2527-33(1991))。祖细胞出现较早，在培养1至3周的时间段内出现，而原始造血干细胞在培养4至5周出现。原始干细胞和多能祖细胞都可用于替代疗法。也可以使用进一步分化的细胞，例如cmp或clp，但其通用性可能较差，因为其增殖能力有限并且它们能够形成的细胞谱系有限。
hspc可以通过从骨髓、外周血或脐带血中收获而获取。当供体处于局部或全身麻醉时，通常从后髂嵴抽取骨髓。可以从前髂嵴获得另外的骨髓。骨髓可以用粒细胞集落刺激因子(g-csf；非格司亭[neupogen])引发，以增加干细胞计数。所提及的“全骨髓”通常是指源自骨髓的单核细胞的组合物，这些单核细胞尚未被选择作为特定的免疫细胞亚群。例如，“分离的骨髓”可以是耗竭的t细胞，例如cd8+细胞、cd52+细胞、cd3+细胞等；富含cd34+细胞等。
hspc也可以通过细胞因子(例如g-csf、gm-csf，或plerixafor(也称为amd3100或普乐沙福(mozobil)))将干细胞从骨髓动员到外周血而获得。用于动员的g-csf的示例性剂量是10性剂量是g/天，但是可以给予更高的剂量，例如，可以给予最高至40μ0是可/天。普乐沙福可与g-csf联合使用，以将hspc动员到外周血以进行采集。可以使用单采设备从外周血收集hspc。
hspc也可以从脐带血(ubc)获得，其通常用于同种异体移植。ucb富含原始干/祖细胞，能够在体内产生长期再增殖的干细胞。
通过这些方法分离出的血细胞可以通过特征性细胞表面标记物的亲和力富集来富集hspc或其亚群，例如原始干细胞和/或共同祖细胞。这样的标记物包括：cd34；cd90(thy-1)；cd59；cd110(c-mpl)；c-kit(cd-117)。可以通过亲和力方法从供体造血细胞样品中选择细胞，所述亲和力方法包括磁珠选择、流式细胞术等。一些免疫选择设备，包括ceparte、isolex300i和clinimacs
如群体中为cd34+的细胞的百分比所定义，hspc组合物可以为至少约50％纯度，可以为至少约75％纯度，至少约85％纯度，至少约95％纯度，或更多(以同样的方式定义)。
iii.赋予对消融方案耐受性的受体
hspc经基因工程改造以表达一种或多种受体，该受体赋予替代性hspc相对于内源性hspc的选择性增殖优势，使得在将替代性hspc引入含有内源性hspc的受试者中后，替代性hspc的比例将随着时间的推移而增加。适合的受体包括“不要吃我”受体。“不要吃我”受体是以下受体，其能保护表达该受体的细胞免受该细胞通常居住的生物体的免疫系统的影响。在本发明的方法中，“不要吃我”受体保护替代性hspc能抵抗受体受试者中的免疫应答，特别是能抵抗用于消融来自受试者的内源性hspc的免疫治疗。适合的受体的实例是cd47(例如，swissprotq08722)；c-kit(例如，swissprotp10721)；β；m(例如，swissprotp61769)/mhc-1(许多不同的登录号)；pd-l1(q9nzq7)；cd24(swissprotp25063)；gas6(例如，swissprotq14393)和cd31(例如，swissprotp16284)。所提及的这种受体应理解为指的是人形式，例如所提供的登录号的那些。但是，这些受体的非人形式也可以用于兽医应用或建模实验中。
hspc上的cd47与吞噬细胞上的sirpi的结合产生“不要吃我”信号，其保护hspc免受吞噬作用，包括由消融内源性hspc的方案中使用的抗体所诱导的吞噬作用。
cd31是“不要吃我”受体的另一个实例。brown等人,nature.2002；418(6894):200–203。
mhci类分子是异源二聚体，其由两条多肽链：α和ββ-微球蛋白(b2m)组成。这两条链通过b2m和α3结构域的相互作用而非共价连接。mhci类蛋白质通过与巨噬细胞上称为lilrb1的蛋白质结合而产生“不要吃我”信号。当mhci类蛋白或lilrb1被阻断时，“不要吃我”信号被解除，巨噬细胞杀死携带mhci类的细胞的能力恢复。mhci类也可以作为自然杀伤细胞(nk)的抑制性配体。降低表面mhci类的正常水平是某些病毒和某些肿瘤逃避ctl应答所采用的机制，其可激活nk细胞杀伤。
程序性死亡配体1(pd-l1)向适应性免疫系统提供“不要找我”信号。
生长停滞特异性6也称为gas6，是编码gas6蛋白的人类基因。gas6在包括aml在内的某些癌症上表达。(wu等人，《细胞死亡与疾病(celldeath&disease)》第8卷，第2700页(2017))。
cd24是一种由多种癌症和癌症干细胞表达的小细胞表面蛋白，且参与细胞粘附和癌症转移。jaggupilli等人，《临床和发育免疫学(clinicalanddevelopmentalimmunology)》2012卷，文章id708036。
如上所述的保护性受体可以是这种序列的野生型序列(通常是人)或突变形式。如果不是野生型，则受体通常在变体或野生型的全长(以较短者为准)上显示出与野生型至少90％、95％或99％的序列同一性。任何差异都可以而不必是保守性取代。保护性受体(无论其是野生型还是突变序列)通常包括细胞外、跨膜和细胞内结构域。保护性受体可以是全长的(可能除信号肽以外)，也可以是截短的(例如，从末端)，只要保留保护功能即可。例如，如果保护作用涉及诸如cd47和sirpα之间的配体结合，则应保留这种结合。
当消融方案不包括抗保护性受体的抗体时，保护性受体的野生型形式尤其是可用的。例如，如果消融方案使用抗c-kit抗体而不是抗cd47抗体，则野生型cd47可以用作替代性hspc的保护性受体。
保护性受体的突变形式尤其可用于以下受体：针对该受体的抗体作为内源性hspc的消融方案的一部分或针对抗携带该受体的癌细胞。将突变引入保护性受体中减少或消除了受体与用于消融内源性hspc或癌症治疗的抗所述受体的抗体或其它免疫治疗剂的结合。同样，突变降低了抗体或其他免疫治疗剂拮抗受体的能力。换句话说，抗体或其他免疫治疗剂相比于突变受体(如果有的话)更强烈地结合并拮抗野生型受体。突变可以存在于保护性受体的一个或多个氨基酸位置，所述位置形成这种抗体所结合的表位。例如，如果消融方案涉及与表位x结合的抗c-kit抗体，则hspc可以经基因操作以表达在表位x突变的c-kit，从而使得所述抗体不结合或仅以降低的程度结合突变的c-kit。或者，突变可以变构地减少或消除抗体结合。这种突变优选不显著减少c-kit与其配体干细胞因子的结合。同样，如果消融方案涉及与表位y结合的抗cd47抗体以促进内源性hspc的消融，则hspc可以经基因修饰以表达在表位y内突变的cd47，使得抗体不结合或仅以降低的程度结合cd47。或者，突变可以变构地减少或消除抗cd47抗体结合。这种突变优选不显著减少cd47与sirpi的结合。其它保护性受体的类似突变形式同样可以与涉及抗一种或多种此类受体的抗体的消融或抗癌疗法组合使用。
iv.消融方案
消融方案用于减少或消除内源性hspc。在引入替代性hspc之前，内源性hspc可以减少一定的系数，例如至少10％、25％、50％或90％。在引入替代性hspc之前，某些方案不会使内源性hspc减少超过例如50％、25％或10％。
这样的消融方案涉及施用与c-kit(cd117)特异性结合的抗体(通常参见wo2008067115)。c-kit是一种细胞表面标记物，其用于鉴定骨髓中某些类型的hspc。造血干细胞(hsc)、多能祖细胞(mpp)和共同髓样祖细胞(cmp)表达高水平的c-kit。这种抗体可以通过抑制c-kit与其配体之间的相互作用以及通过效应物介导的机制(例如adcc、adcp和cdc)来减少内源性hspc。c-kit是iii型受体酪氨酸激酶，其与干细胞因子(一种引起某些类型的细胞生长的物质，也称为“钢因子”或“c-kit配体”)结合。当该受体与干细胞因子结合时，其形成激活其内在酪氨酸激酶活性的二聚体，所述二聚体进而磷酸化并激活在细胞中传播信号的信号转导分子。特异性结合人c-kit的许多抗体可商购获得，包括sr1、2b8、ack2、yb5-b8、57a5、104d2(us20180214525)。amg191是sr1的人源化形式(美国专利第8,436,150号和第7,915,391号)。sr1的其他人源化形式在2019年11月25日提交的pct/us19/63091中进行了描述，出于所有目的其通过全文引用的方式并入本文中。本发明的一些抗体具有成熟重链可变区和成熟轻链可变区，该成熟重链可变区具有2019年11月25日提交的pct/us19/63091中指定为ah2、ah3和ah4的指定为seqidno.13、17或21的任何链的序列；该成熟轻链可变区具有pctus2019//us19/63091的seqidno:53,nl2的序列(本文中为seqidno:13-16)。这些抗体中的任何一种，包括嵌合、修饰(veneered)或人源化形式，或结合相同表位或与之竞争以结合c-kit的抗体，都可用于所公开的方法中。其它的抗c-kit抗体可以通过如下进一步描述的标准免疫学技术从头产生。
消融方案还可以包括抑制cd47-sirpd相互作用的免疫治疗剂，以与抗c-kit抗体组合使用(通常参见wo2016033201)。这种试剂促进由抗c-kit介导的内源性hspc的效应物介导的消除。这种试剂包括与cd47或sirp4特异性结合的抗体。这种试剂还包括与fc融合的cd47ecd，其功能类似于抗sirpi抗体；或与fc融合的sirp的，其功能类似于抗cd47抗体。(参见zhang等人，《抗体治疗(antibodytherapeutics)》，第1卷，第2期，2018年9月21日，第27-32页)。优选的抗体拮抗cd47-sirp7的相互作用，而不会通过任一受体赋予激活信号。
适合的抗cd47抗体的实例包括克隆b6h12、5f9、8b6、c3(例如wo2011/143624中所述)、cc9002(vonderheide，natmed2015；21:1122-3.，2015)和srf23(《表面肿瘤学(surfaceoncology)》)。适合的抗cd47抗体包括这类抗体的人、人源化或嵌合形式，与相同表位结合或与之竞争以与cd47结合的抗体。人源化抗体(例如，hu5f9-igg4-wo2011/143624)由于其低的抗原性而特别适用于人体内应用。类似地，犬源化或猫源化的抗体等特别适用于分别在狗、猫和其他物种中的应用。一些人源化抗体特异性结合人cd47，所述抗体包括可变重链(vh)区，该可变重链区含有分别在wo2011/143624的seqidno:20、21和22中示出的vh互补区cdr1、cdr2和cdr3；和可变轻链(vl)区，该可变轻链区含有分别在wo2011/143624的seqidno:23、24和25中示出的vl互补区cdr1、cdr2和cdr3(本文中为seqidno:1-6)。一些人源化抗体包括选自在wo2011/143624中列出的seqidno:36、seqidno:37和seqidno:38的重链可变区和选自在wo2011/143624中列出的seqidno:41、seqidno:42和seqidno:43的轻链可变区(本文中为seqidno:7-12)。示例性抗体是magolimab。
适合的抗sirpi抗体与sirpi特异性结合，优选不激活/刺激足够的信号响应以抑制吞噬作用，并且抑制sirpi和cd47之间的相互作用。适合的抗sirp相抗体包括此类抗体的完全人、人源化或嵌合形式。示例性抗体为kwar23(ring等人，procnatlacadsciusa2017年12月5日；114(49):e10578-e10585，wo2015/138600)；my-1(yanagita等人，jciinsight.2017年1月12日；2(1):e89140)；和effi-dem(zhang等人，《抗体治疗学(antibodytherapeutics)》，第1卷，第2期，2018年9月21日，第27-32页)。人源化抗体由于其低的抗原性而特别适用于人体内应用。类似地，犬源化或猫源化等抗体特别适用于分别在狗、猫和其他物种中的应用。
免疫治疗剂还包括可溶性cd47多肽，该多肽特异性结合sirp异并减少hspc上的cd47与吞噬细胞上的sirpi之间的相互作用(例如参见wo2016179399)。这种多肽可以包括整个ecd或其具有上述功能的部分。适合的可溶性cd47多肽特异性结合sirpi而不会激活或刺激通过sirpα的信号传导，因为sirpi的激活会抑制吞噬作用。实际上，适合的可溶性cd47多肽促进内源性hcsp的吞噬作用。可溶性cd47多肽可与fc融合(例如，如us20100239579中所述)。
免疫治疗试剂还包括与cd47特异性结合并抑制其与sirp性相互作用的可溶性sirpi多肽。示例性试剂包括alx148(kauder等人，《血液(blood)》2017130:112)和tti-622和tti-661(trillium)。这种试剂可以包括整个sirpαecd或其具有上述功能的任何部分。sirpα试剂通常包含sirp通的至少d1结构域。可溶性sirpi多肽可以与fc区融合。称为“高亲和力sirpi试剂”的示例性sirpα多肽包括衍生自sirpi的多肽及其类似物(例如，wo2013/109752中描述的cv1-hlgg4和cv1单体)。高亲和力sirp亲试剂是天然sirp然蛋白的变体。提供增加的亲和力的氨基酸变化位于d1结构域中，因此高亲和力sirp，试剂包含人sirp人的d1结构域，其在d1结构域内相对于野生型序列具有至少一个氨基酸变化。这种高亲和力sirpα试剂任选地包含另外的氨基酸序列，例如抗体fc序列；野生型人sirpα蛋白的除d1结构域之外的部分(包括但不限于天然蛋白或其片段的残基150-374)，通常是与d1结构域相邻的片段；等等。高亲和力sirpi试剂可以是单体或多聚体，即二聚体、三聚体、四聚体等。在一些实施方案中，高亲和力sirp是试剂是可溶的，其中所述多肽缺乏sirp溶跨膜结构域并且相对于野生型sirp域序列包含至少一个氨基酸变化，并且其中所述氨基酸变化例如通过使解离速率降低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更多，来提高sirp多多肽与cd47结合的亲和力。针对cd47或sirp和的具有fc区的免疫治疗剂可以具有任何人类同种型，例如igg1、igg2、igg3或igg4。可以使用经突变以降低效应物功能的人igg4或igg2同种型或igg1，因为抑制cd47-sirp4相互作用不需要效应物功能。
在有效达到减少或消除内源性hspc的预期目的的方案中施用免疫治疗剂，包括抗体和fc融合蛋白。有效方案是指剂量、给药频率和给药途径的组合。这种试剂的有效剂量可以随试剂的不同而变化。抗c-kit抗体的示例性剂量为至少0.05mg/kg和最多10mg/kg，例如约0.05-10mg/kg，或0.1-5mg/kg。抑制cd47-sirp4的免疫治疗剂的示例性剂量为至少0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg中的任何一个至5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg中的任何一种。一些示例性范围为0.05mg/kg至50mg/kg，0.1mg/kg至20mg/kg，或1mg/kg至10mg/kg。任选地，这种免疫治疗剂最初可以一个或多个引发剂量施用，随后以一个或多个治疗剂量施用，以减少红细胞的不期望的交联，例如wo2017181033所述。
可以在引入替代性hspc之前一次或多次施用免疫治疗剂，以将内源性hspc降低到所需水平或消除内源性hspc。所述方案可以在引入替代性hspc之前的一个月、两周、一周或更短的时间内开始。可以在引入替代性hspc之前一次或多次施用免疫治疗剂，以选择对抗残余内源性hspc的hspc。或者，消融方案可以在引入替代性hspc的同时或之后开始。
如果使用多种免疫治疗剂，则试剂或试剂的组合在引入替代性hspc之前和之后可以相同，也可以不同。例如，抗c-kit可以在引入替代性hspc之前单独施用，在其之后施用抗c-kit和抗cd47两者。在引入替代性hspc之后，可以继续消融内源性hspc的方案，直到内源性hspc降低到所需水平。将基因修饰的hspc引入保留一些内源性hspc的受试者中并持续选择基因修饰的hspc有利于不完全剥夺受试者的hspc而带来随时感染的风险。
免疫治疗剂通常作为药物组合物施用，其中所述试剂与一种或多种药学上可接受的载体组合。可以使用多种水性载体，例如缓冲生理盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不期望的物质。这些组合物可以通过常规技术灭菌。组合物可包含接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可以在很宽的范围内变化，并且根据所选择的特定给药方式和患者的需要，主要基于液体体积、粘度、体重等来选择(例如，remington，《药学科学(pharmaceuticalscience)》(第15版，1980)；和goodman&gillman，《治疗药物的药理学基础(thepharmacologicalbasisoftherapeutics)》(hardman等人编著，1996))。
v.抗体的一般特征
针对抗原的其他非人单克隆抗体(例如，鼠、豚鼠、灵长类动物、兔或大鼠)的产生可以通过例如用抗原或其片段或带有抗原的细胞免疫动物来完成。参见harlow&lane，《抗体，实验室手册(antibodies,alaboratorymanual)》(cshpny，1988)(出于所有目的通过引用方式并入)。这种抗原可以从天然来源、通过肽合成或通过重组表达获得。任选地，所述抗原可以与载体蛋白融合或以其他方式复合来施用。任选地，抗原可以与佐剂一起施用。如下所述，可以使用几种类型的佐剂。优选使用完全弗氏佐剂然后使用不完全佐剂来免疫实验动物。
人源化抗体是一种基因工程抗体，其中来自非人“供体”抗体的cdr被移植到人“受体”抗体序列中(例如，参见queen的美国专利第5,530,101号和第5,585,089号；winter的美国专利第5,225,539号；carter的美国专利第6,407,213号；adair的美国专利第5,859,205号和第6,881,557号；foote的美国专利第6,881,557号)。受体抗体序列可以是例如成熟的人抗体序列、这种序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区区域序列。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体的一些或全部cdr，以及可变区框架序列和恒定区的抗体，可变区框架序列和恒定区如果存在的话，其全部或基本上来自人抗体序列。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个和通常所有三个cdr，以及重链可变区框架序列和重链恒定区，重链可变区框架序列和重链恒定区如果存在的话，其基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个和通常所有三个cdr，以及轻链可变区框架序列和轻链恒定区，轻链可变区框架序列和轻链恒定区如果存在的话，其基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列。除纳米抗体(nanobody)和dab外，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。当各个cdr之间的相应残基(如kabat所定义)至少85％、90％、95％或100％相同时，人源化抗体中的cdr基本上来自非人抗体中的相应cdr。当由kabat定义的的相应残基至少85％、90％、95％或100％相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别基本上来自人可变区框架序列或人恒定区。
尽管人源化抗体常常并入来自小鼠抗体的所有六个cdr(优选由kabat定义)，但它们也可以用少于全部的cdr(例如，来自小鼠抗体的至少3、4或5个cdr)制成(例如，pascalis等人，j.immunol.169:3076，2002；vajdos等人，《分子生物学杂志(journalofmolecularbiology)》，320:415-428，2002；iwahashi等人，mol.immunol.36:1079-1091，1999；tamura等人，《免疫学杂志(journalofimmunology)》，164:1432-1441，2000)。
嵌合抗体是其中非人抗体(例如，小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链和重链恒定区组合的抗体。这种抗体基本上或完全保留小鼠抗体的结合特异性，并且为约三分之二的人序列。
修饰抗体是一种人源化抗体，它保留了非人抗体的一些(且通常是所有的)cdr和一些非人可变区框架残基，但用来自人抗体序列的相应位置的残基替换可能贡献了b细胞或t细胞表位的其它可变区框架残基，例如暴露的残基(padlan，mol.immunol.28:489，1991)。结果得到这样一种抗体，其中cdr完全或基本上来自非人抗体，并且通过替换使非人抗体的可变区框架更像人。
人抗体可以从人分离，或者通过人免疫球蛋白基因的表达(例如，在转基因小鼠中、在体外或通过噬菌体展示)而产生。产生人抗体的方法包括：三源杂交瘤方法(oestberg等人，《杂交瘤(hybridoma)》2:361-367(1983)；oestberg，美国专利第4,634,664号；和engleman等人，美国专利第4,634,666号)；使用包括人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(例如，参见lonberg等人，wo93/12227(1993)；美国专利5,877,397号、5,874,299号、5,814,318号、5,789,650号、5,770,429号、5,661,016号、5,633,425号、5,625,126号、5,569,825号、5,545,806号；《自然(nature)》148，1547-1553(1994)；《自然生物技术(naturebiotechnology)》14，826(1996)；kucherlapati，wo91/10741(1991))；和噬菌体展示方法(例如，参见dower等人，wo91/17271；和mccafferty等人，wo92/01047；美国专利5,877,218号、5,871,907号、5,858,657号、5,837,242号、5,733,743号和5,565,332号)。
筛选抗体以与其预期靶标特异性结合。可以进一步筛选抗体，以与靶标的特定区域(例如，包含所需的表位)结合，与参考抗体竞争对携带抗原的细胞的激动作用或拮抗作用。非人抗体可以转化为如上所述的嵌合、修饰或人源化形式。
恒定区的选择部分取决于是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒作用。例如，人同种型igg1和igg3具有补体依赖性细胞毒作用，而人同种型igg2和igg4则没有。轻链恒定区可以是λ或κ。人igg1和igg3也比人igg2和igg4诱导更强的细胞介导的效应物功能。
人恒定区在不同个体之间表现出同种异型(allotypic)变异和同族同种异型(isoallotypic)变异，也就是说，恒定区在不同个体中的一个或多个多态性位置可能有所不同。同族同种异型(isoallotype)与同种异型的不同之处在于，识别同族同种异型的血清与一个或多个其它同种型的非多态性区域结合。所提及的人恒定区包括具有任何天然同种异型或占据天然同种异型中的多态性位置的残基的任何排列的恒定区。
轻链和/或重链的氨基或羧基末端处的一个或几个氨基酸，例如重链的c-端赖氨酸，可以在部分或全部分子中缺失或衍生化。可以在恒定区进行取代以降低或增加效应物功能，例如补体介导的细胞毒作用或adcc(例如，参见winter等人，美国专利第5,624,821号；tso等人，美国专利第5,834,597号；和lazar等人，proc.natl.acad.sci.usa103:4005,2006)；或用于延长在人中的半衰期(例如，参见hinton等人，j.biol.chem.279:6213，2004)。示例性取代包括位置250处的gln和/或位置428处的leu，位置434处的s或n，位置252处的y，位置254处的t和位置256处的e。n434a(eu编号)。增加的fcrn结合有利于使本发明的杂合蛋白更强地与内源性igg竞争与fcrn结合。还已知大量减少adcc、adp或cmc中的任何一种的突变。(例如，参见winter等人，美国专利第5,624,821号；tso等人，美国专利第5,834,597号；和lazar等人，proc.natl.acad.sci.usa103:4005，2006)。例如，位置234、235、236和/或237中的任何一个的取代降低对fc低受体、特别是fc、特别受体的亲和力(例如，参见us6,624,821)。任选地，人igg2中的位置234、236和/或237被丙氨酸取代，且位置235被谷氨酰胺或谷氨酸取代。(例如，参见us5,624,821)。降低效应物功能的其它取代包括位置268处的a、位置297处的g或a、位置309处的l、位置322处的a、位置327处的g、位置330处的s、位置331处的s、位置238处的s、位置268处的a、位置309处的l。增强效应物功能的突变的一些实例包括s239d、i332e、a330l及其组合。
可以测试用于消融的目标抗体诱导adcc的能力。与抗体相关的adcc活性可以通过检测来自裂解细胞的标记或乳酸脱氢酶的释放或检测降低的靶细胞活力(例如膜联蛋白测定)来监测和定量。细胞凋亡检测可以通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的digoxigenin-11-dutp缺口末端标记(tunel)检测来进行(lazebnik等人，nature:371，346(1994))。细胞毒性也可以通过检测试剂盒直接检测，例如罗氏应用科学公司(印第安纳州，印第安纳波利斯)的细胞毒性检测试剂盒。同样可以测试抗体针对例如amllsc诱导抗体依赖性吞噬作用(adp)的能力，如wo/2009/091601所述。
在一些实施方案中，免疫治疗剂与效应物部分缀合。效应物部分可以是任何数量的分子，包括标记部分，例如放射性标记或荧光标记，或者可以是细胞毒性部分。细胞毒性剂包括细胞毒性药物或毒素或这种毒素的活性片段。适合的毒素及其相应的片段包括白喉a链、外毒素a链、蓖麻毒素a链、相思豆毒素a链、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、酚霉素、伊诺霉素、皂草素、瑞奥西汀e等。细胞毒性剂还包括通过使放射性同位素与抗体偶联而制成的放射性化学物质。将细胞毒性部分靶向跨膜蛋白可增加靶向区域中细胞毒性部分的局部浓度。
vi.血细胞遗传疾病
本发明的方法可用于纠正血细胞的遗传疾病，特别是由单一蛋白质的突变引起的单基因疾病。这种疾病可以是显性或非显性的，并可导致部分或完全外显。通常，可以通过消融内源性hplc并施用替代性hplc来治疗这种疾病，所述替代性hplc包括所述疾病背后的蛋白质的功能性(例如，野生型)形式。这种细胞可以表达野生型蛋白质和这种蛋白质的突变形式或者只表达野生型蛋白质，这取决于如何进行基因修饰。
血细胞的遗传疾病包括血红蛋白病(例如地中海贫血和镰状细胞病)，x连锁严重联合免疫缺陷(x-scid)，腺苷脱氨酶缺乏症(ada-scid)，scid的其他遗传形式(artemis，rag1/2)，wiskottaldrich综合征(was)，慢性肉芽肿病，噬血细胞性淋巴组织细胞增生症，x-连锁高igm综合征，x-连锁淋巴组织增生性疾病，x-连锁无丙种球蛋白血症，x-连锁肾上腺脑白质营养不良，异染性脑白质营养不良，血友病，血管性血友病，镰状细胞性贫血，遗传性再生障碍性贫血，纯红细胞再生障碍性贫血，阵发性睡眠性血红蛋白尿症，范可尼贫血，噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(hlh)，先天性代谢缺陷(例如粘多糖贮积症、戈谢病和其它脂质贮积症)，大疱性表皮松解症，重症先天性粒细胞缺乏症，shwachman-diamond综合征，diamond-blackfan贫血，kostmann综合征和白细胞粘附缺陷。
在镰状细胞性贫血中，血红蛋白β链的第六个氨基酸谷氨酸被缬氨酸取代。血红蛋白的缬氨酸突变形式比谷氨酸形式的溶解性低得多；它形成杆状似的半固体凝胶，从而导致红细胞(rbc)在低p02位点成镰刀状。变形的不灵活的红细胞粘附在血管内皮上，并堵塞小的小动脉和毛细血管，导致闭塞和梗塞。由于镰刀状的红细胞太脆弱，无法承受循环的机械创伤，因此它们进入循环后会发生溶血。在纯合体中，临床表现是由贫血和血管闭塞事件引起的，从而导致组织缺血和梗塞。生长和发育受损，且易感染性增加。贫血通常很严重，但患者之间差异很大。可以通过纠正遗传缺陷、表达额外的功能性血红蛋白转录单位或破坏bcl11a红系增强子来修复病态细胞贫血，所述bcl11a红系增强子抑制导致用于治疗镰状细胞贫血(或β地中海贫血)的胎儿血红蛋白水平升高的胎儿珠蛋白表达。
地中海贫血是一组慢性遗传性小红细胞性贫血，其特征是有缺陷的血红蛋白合成和无效的红细胞生成，在地中海、非洲和东南亚血统的人中尤为常见。地中海贫血是最常见的遗传性溶血性疾病。它是由至少一个珠蛋白多肽链(β、α、γ、δ)的产量下降所引起的不平衡的hb合成所致。这可以通过基因调控区中的突变或导致表达降低的珠蛋白编码序列中的突变而发生。
联合免疫缺陷是一组疾病，其特征在于，b细胞和t细胞系统的先天性和通常遗传性的缺陷、淋巴发育不全和胸腺发育不良。联合免疫缺陷包括重度联合免疫缺陷，瑞士型无丙种球蛋白血症，伴有腺苷脱氨酶或核苷磷酸化酶缺乏症的联合免疫缺陷，以及伴有免疫球蛋白的联合免疫缺陷(nezelof综合征)。大多数患者都会在早期感染鹅口疮、肺炎和腹泻。如果不及时治疗，大多数人会在2岁之前死亡。大多数患者存在严重的b细胞和免疫球蛋白缺乏。存在如下特征：淋巴细胞减少，t细胞水平低或缺乏，对有丝分裂原的增殖反应极低，皮肤无反应性，胸腺阴影缺失以及淋巴组织减少。肺囊虫肺炎和其他机会性感染很常见。
本发明的方法还可用于通过修饰感染病毒所用的免疫细胞受体(例如在hiv情况下为ccr5)来治疗感染性疾病。
这些本发明的方法还可用于治疗恶性血液病和自身免疫性疾病，其中病状至少部分存在于血细胞中。恶性血液病包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。这种恶性肿瘤的更特定的实例包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、急性髓系白血病、急性淋巴系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病和多发性骨髓瘤。自身免疫性疾病包括b细胞和t细胞介导的疾病。常见的实例是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、多发性硬化症、1型糖尿病、格林巴利综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、牛皮癣、格雷夫病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎和系统性硬化症。
本发明的方法还可用于替换患有其他类型癌症(例如实体瘤)的患者中的内源性hspc，这些患者已经接受了对内源性hspc造成损害的化学疗法。实体瘤包括乳腺、前列腺、脑、肺、肾、肝、胃、肠、结肠、甲状腺、胸腺、卵巢、黑素瘤和胰腺等的瘤。替代性干细胞提供内源性hspc的功能(例如，在抵抗感染方面)，并且如果是同种异体的话可对残余的癌细胞具有额外的活性。
本发明的方法也可用于替换器官移植物中的hspc，特别是同种异体移植物中的hspc。内源性hspc可能会针对非mhc匹配的同种异体移植物产生宿主对移植物的反应。可以通过在器官移植之前消融内源性hspc并引入替代性hspc来降低宿主对移植物的反应，该替代性hspc经基因修饰以在移植器官的同时赋予增殖优势且优选来自相同来源(即受试者)。
在自体和同种异体来源之间选择替代性hspc取决于几个因素。自体移植很容易进行，并且不需要鉴定hla匹配的供体。自体移植具有危及生命的并发症的风险较低；没有发生gvhd的风险，也不需要免疫抑制疗法来预防gvhd和移植物排斥。免疫重建比同种异体移植后更快，机会性感染的风险更低。移植很少发生失败。然而，来自癌症患者的自体移植物有被癌细胞污染的风险。
同种异体移植的优点是移植物没有被肿瘤细胞污染。移植物还包括供体来源的免疫活性细胞，其可产生免疫的移植物抗恶性肿瘤的作用。与自体移植相比，同种异体移植后疾病复发的风险通常较低。然而，同种异体移植可能与许多潜在的致命并发症有关，例如方案相关的器官毒性，移植物衰竭和移植物抗宿主疾病。
通常，同种异体移植主要用于治疗白血病和骨髓增生异常综合征。自体移植已更多地用于实体瘤、淋巴瘤和骨髓瘤。为了纠正遗传疾病，可以将自体移植与用于纠正疾病的遗传基础的基因修饰或无需纠正的同种异体移植一起进行。
vii.hspc的基因工程化
hspc经过基因修饰，以使它们能够表达一种或多种蛋白质，从而相对受试者中的内源性hspc提供选择性优势。hspc也可以经基因修饰以表达内源性hspc中缺乏的蛋白质的功能性形式，以治疗缺陷背后的遗传性疾病。基因修饰可涉及引入编码受体或要表达的其它蛋白质的外源核酸。这样的外源核酸然后可以作为游离基因存在，或者优选地掺入到基因修饰的hspc的基因组中。这种掺入可以是随机的或通常靶向对应的内源序列。外源核酸可以包括调控序列，例如位于待表达序列侧翼的启动子，或者待表达序列可以被设计成在染色体位置与内源性调控序列可操作地连接成一体。无论哪种形式，hspc的基因组都经过修饰以包含转录单元，所述转录单元能够表达赋予选择性优势的受体或表达内源性hspc中缺乏的蛋白质功能性形式。
基因修饰还可以包括引入基因靶向构建体以修饰编码受体或蛋白质的内源基因，例如去除遗传缺陷背后的突变，或使内源基因失活。这种修饰通常通过靶向构建体和内源性等位基因之间的重组来实现。靶向构建体通常包括用于替换内源核酸的片段的核酸(例如，用野生型密码子代替突变密码子)，该核酸侧接有同源臂以介导同源重组。通过修饰靶向的频率可以通过邻近重组的靶向切割来增加，所述靶向切割通过crispr或与核酸酶结构域融合的锌指蛋白、talon等实现(shim等人，中国药理学报，第38卷，第738-753页(2017))；美国专利号：8,586,526、6,534,261、6,599,692、6,503,717、6,689,558、7,067,317、7,262,054、7,888,121、7,972,854、7,914,796、7,951,925、8,110,379、8,409,861；美国专利公开：20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060063231、20080159996、201000218264、20120017290、20110265198、20130137104、20130122591、20130177983和20130177960。
基因修饰还可涉及激活或抑制内源性受体或蛋白质的表达。表达可以通过引入表达dna结合结构域的融合蛋白的构建体以及转录激活因子或阻遏因子来激活或抑制(参见例如us6,933,133)。dna结合结构域可以是锌指蛋白、talen或cas9突变，以便在不切割的情况下结合到靶位点。
基因修饰涉及将一个或多个修饰元件引入细胞中(例如，实现修饰的靶向载体和促进同源重组的核酸酶，或编码转录单元以实现随机插入的病毒载体)。如果引入多个元件，则可以将它们包含在相同或不同的构建体中。同样，如果进行多种修饰(例如，引入编码保护性受体的核酸和编码蛋白质的野生型形式的核酸两者以纠正遗传疾病)，则修饰的核酸可以包含在相同或不同的载体中，并且如果是后者，则修饰可以同时进行，也可以依序进行。基因修饰后的hspc可以是纯系群体或多克隆的。基因修饰可以导致细胞杂合或纯合的修饰。细胞可以在引入受试者之前进行增殖。
可用于将外源基因转移到靶哺乳动物细胞中的许多载体是可获得的(例如，参见wo2018/140940；morgan等人，cellstemcell21,574-590(2018))。载体可以是游离基因的，或者可以通过同源重组或随机整合而整合到靶细胞基因组中。载体可以编码或不编码可选择的标记物，以选择修饰的细胞。载体包括质粒、病毒衍生载体如巨细胞病毒、腺病毒等，逆转录病毒衍生的载体，如mmlv、hiv-1和alv。慢病毒载体(例如基于hiv或fivgag序列的慢病毒载体)可用于转染非分裂细胞，例如静止期的hspc。
可以通过用合适的载体转染(例如，电穿孔)、转导等对细胞进行基因改变。可使用逆转录病毒和适当的包装系的组合，其中衣壳蛋白的作用是感染靶细胞。通常，细胞和病毒将会在培养基中孵育至少约24小时。在一些应用中，然后使细胞在培养基中生长较短的时间间隔，例如24-73小时，或至少两周，并且在分析之前可以使细胞生长五周或更长时间。常用的逆转录病毒载体是“缺陷型的”，即不能产生有效感染所需的病毒蛋白。载体的复制需要在包装细胞系中生长或者转染，细胞可以例如如下进行基因改变：使用含有上清液的载体放置8-16小时，然后交换到生长培养基中1-2天，任选地使用药物选择剂如嘌呤霉素、g418或杀稻瘟菌素来选择，然后再培养。病毒或质粒载体可以包括随后例如使用重组酶系统(例如cre/lox)必须移除的基因或者表达它们的细胞，所述细胞例如通过包括允许选择性毒性的基因(例如疱疹病毒tk、bcl-xs等)而被破坏。
viii.施用替代干细胞的方案
替代干细胞通常通过静脉输注肠胃外施用。施用的干细胞的剂量可以取决于所输注的细胞组合物的期望纯度和细胞的来源。剂量也可以取决于hspc的基因修饰类型。由于对hspc的保护，并且由于在引入替代性hspc之前基本上完全消除内源性hspc是不必要的，因此剂量有时可能少于现有技术的方法，在现有技术的方法中，1-2x106cd34+细胞/kg体重被认为是最低限度。重新引入的细胞的示例性剂量为至少1x105、1x106、2、x106、5x106、107、2x107cd34+细胞/kg体重。示例性范围为1x105至5x107，1x106至2x107，或5x10z5至6x106个cd34+细胞/kg体重。剂量可能受可用细胞数量的限制。通常，无论来源如何，剂量都是通过存在的cd34+细胞的数量来计算的。未分离的骨髓或动员了的外周血的cd34+细胞的百分比可能较低；在这种情况下，施用的细胞总数要高得多。
viii.监测
在将基因修饰的替代性hspc引入受试者后，可以监测替代性hspc与总hspc的比率。如前所述，可以从骨髓或外周血获得hspc样品。可以通过例如核酸杂交检测或免疫检测将替代性hspc与内源性hspc区分开。如果替代性hspc是同种异体或异种的，则替代细胞和内源细胞之间存在许多遗传差异，这些差异可以构成差异化探针结合测定的基础，且有时受体的差异允许进行免疫测定。如果替代性hspc是自体的，则基因修饰的替代性hspc可以通过核酸杂交测定或免疫测定与内源性hspc区分开。在引入替代性hspc后，替代性hspc与总hspc的比例可以随着时间的延长而增加。优选地，该比例在六个月后超过30％、50％、75％、90％或95％。
以上或以下引用的所有专利申请、网站、其他出版物、登录号等出于所有目的全部通过引用并入，其程度与每个单独项目被具体且单独指示通过引用并入的程度相同。如果序列的不同版本在不同时间与登录号相关联，则指在本申请的有效提交日期与登录号相关联的版本。有效提交日期是指涉及登录号的实际提交日期或优先申请的提交日期(如适用)中较早的日期。同样，如果出版物、网站等的不同版本在不同的时间发布，则除非另有说明，否则是指在申请的有效提交日期最近发布的版本。本发明的任何特征、步骤、元件、实施例或方面可与任何其它组合使用，除非另有特别说明。尽管为了清楚和理解的目的，已经通过说明和示例的方式对本公开进行了一些详细描述，但是显而易见的是，在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。
序列表
<110>四十七公司
<120>对消融方案耐受的基因修饰的hspc
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