用于使用寡核苷酸缀合抗体检测细胞的方法和试剂盒

用于使用寡核苷酸缀合抗体检测细胞的方法和试剂盒
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2018年10月31日提交的美国临时专利申请第62/753,854号的优先权，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.生物标志物测量能够检测多种生物状态。对于一些测定，单个参数的大量测量结果足以评估给定样品的疾病状态；但是，这些测量结果模糊了单细胞分辨率数据，并且可能混淆生物学相关样本的潜在异质性。


技术实现要素：

4.本文提供了一种方法，所述方法包括：使包括多种所关注生物特征的样品与多种捕获剂接触，其中每种捕获剂能够与不同的所关注生物特征结合，其中每种捕获剂与不同的寡核苷酸缀合；将与所关注生物特征结合的所述捕获剂固定到所述样品；使每个寡核苷酸与环状核酸引物接触，其中所述核酸引物的区段与所述寡核苷酸互补，并且其中每个寡核苷酸与不同的核酸引物接触；使用所述环状核酸引物作为模板扩增所述寡核苷酸以产生经过扩增的寡核苷酸；使所述寡核苷酸的子集中的寡核苷酸与包括标记的探针接触，以形成经过探针扩增的寡核苷酸双链体，其中每个探针只能与一个寡核苷酸结合；读取所述样品以确定所述探针中的每个探针的结合模式、灭活或去除所述标记并用与不同寡核苷酸子集结合的不同探针重复所述接触和读取步骤。
5.在一些实施例中，样品是生物样品。在一些实施例中，样品选自由新鲜样品、冷冻样品和化学固定样品组成的组。在一些实施例中，样品是ffpe组织样品。在一些实施例中，样品包括细胞。在一些实施例中，样品选自由生物组织、生物流体和匀浆组成的组。在一些实施例中，样品包括细胞。在一些实施例中，细胞包括稀有细胞群。在一些实施例中，细胞包括癌细胞。在一些实施例中，细胞选自由以下组成的组：动物细胞、植物细胞、细菌、真菌细胞或原生生物。
6.在一些实施例中，样品是人类样品或小鼠样品。在一些实施例中，样品包括病原体。在一些实施例中，病原体选自由以下组成的组：细菌细胞、酵母细胞、细菌细胞、病毒、病毒载体或朊病毒。在一些实施例中，样品包括肿瘤组织。在一些实施例中，样品包括健康组织。在一些实施例中，样品粘附到载玻片。在一些实施例中，生物特征包括蛋白质。在一些实施例中，生物特征包括标志物。在一些实施例中，所述标志物中的至少一个标志物是低水平标志物。在一些实施例中，生物特征包括疾病标志物。在一些实施例中，生物特征包括诊断标志物。在一些实施例中，标志物包括选自由以下组成的组的分子：转录因子、信号传导分子、弥漫性细胞外标志物或细胞表面标志物。在一些实施例中，生物特征包括突变蛋白质。
7.在一些实施例中，捕获剂包括抗体。在一些实施例中，捕获剂包括抗体片段。在一些实施例中，抗体片段选自由以下组成组：igg、igm、多克隆抗体、单克隆抗体、scfv、纳米体、fab或双抗体。
8.在一些实施例中，每个不同的寡核苷酸的长度为至少10个核苷酸。在一些实施例中，每个不同的寡核苷酸的长度为至少25个核苷酸。在一些实施例中，每个不同的寡核苷酸的长度不超过100个核苷酸。
9.在一些实施例中，固定包括交联。在一些实施例中，交联包括使用甲醛。
10.在一些实施例中，环状核酸引物的长度介于6个核苷酸与100个核苷酸之间。在一些实施例中，与寡核苷酸互补的核酸引物的区段的长度介于16个核苷酸与18个核苷酸之间。
11.在一些实施例中，使用聚合酶执行扩增。在一些实施例中，聚合酶是phi29聚合酶。在一些实施例中，扩增步骤持续约1小时。在一些实施例中，在约37℃下执行扩增步骤。
12.在一些实施例中，每个探针包括与每个其它探针不同的标记。在一些实施例中，经过探针扩增的寡核苷酸双链体可以具有至少15℃的t
m
。在一些实施例中，标记可以是荧光标记。在一些实施例中，荧光标记可以选自由以下组成的组：cy3、cy5、alexafluor555、alexafluor647、alexafluor750、popo
‑
3、toto
‑
3、popro3和topro3。在一些实施例中，荧光标记可以通过接头附着到探针。
13.在一些实施例中，读取样品包括荧光成像。
14.本公开中提供了试剂盒，所述试剂盒包括：多种抗体，每种抗体与唯一的寡核苷酸缀合；多个引物，每个引物特异于唯一的寡核苷酸之一；以及多种染料，每种染料特异于唯一的寡核苷酸之一。
15.本公开的另一方面提供了包括机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实施上文或本文其它地方所述的方法中的任一种。
16.本公开的另一方面提供了系统，所述系统包括一个或多个计算机处理器和与其耦接的计算机存储器。计算机存储器包括机器可执行代码，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实施上文或本文其它地方所述的方法中的任一种。
17.对于本领域技术人员而言，通过以下具体实施方式本公开的另外的方面和优点将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实施例。如将认识到的，本公开能够具有其它不同的实施例，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，而所有这些都不脱离本公开。因此，附图和说明书将在本质上被视为是说明性的而非限制性的。
18.通过引用并入
19.本说明书中提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。
附图说明
20.本公开的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对说明性实施例进行阐述的详细说明和其附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述实施例中利用了本发明的原理，在附图中：
21.图1展示了根据一些实施例的其中使用包含在主链挂锁探针/环状核酸引物中的额外报告序列来执行信号检测的滚环扩增方案。
22.图2展示了根据一些实施例的其中使用识别寡核苷酸的挂锁探针的相同区段(“条
形码序列”)来执行信号检测的滚环扩增方案。
23.图3展示了被编程或以其它方式配置成执行或控制本文所述的方法的计算机系统。
24.图4展示了根据一些实施例的用通过rca扩增的寡核苷酸连接的抗体染色并用荧光标记的探针探查的人新鲜冷冻扁桃体组织。分图a示出了cd45
‑
bx001(暴露时间为50毫秒)和cd4
‑
bx021(暴露时间为20毫秒)。分图b示出了分图a的放大部分。分图c示出了cd2
‑
bx002(暴露时间为20毫秒)。分图d示出了分图c的放大部分。
25.图5展示了根据一些实施例的用与寡核苷酸连接的抗体染色的人新鲜冷冻石蜡包埋的扁桃体组织。分图a和b示出了cd31
‑
cx001(暴露时间为50毫秒)和cd3
‑
cx002(暴露时间为20毫秒)和。分图c描绘了通过去杂交去除标记的探针后的组织样品。分图d和e分别表示分图a和b的放大区域。
26.图6展示了根据一些实施例的使用24标志物抗体组对人类扁桃体进行染色所收集的示例数据。
具体实施方式
27.概述
28.本文提供了用于检测样品元素的方法、系统和试剂盒，其可以用于测量具有空间背景的高参数数据。此类测量可以提供对关键疾病状态或治疗方式的机制理解。在一些情况下，此类测量使得能够开发增强的诊断工具。
29.通过采用单个捕获分子染色步骤与应用标记、成像和去除标记的迭代循环的组合，可以检测样品的多个所关注生物特征。在一些情况下，捕获剂可以固定到样品上。可以在捕获分子染色步骤与迭代循环之间采用如滚环扩增(rca)等扩增步骤，例如以提供信号扩增。
30.将捕获剂与样品结合可以允许对样品的元素(例如，所关注生物特征)的最终检测。捕获分子染色步骤可以包括使包括多个所关注生物特征的样品与多种捕获剂接触，使得每种捕获剂能够与不同的所关注生物特征结合。在一些情况下，每种捕获剂可以与不同的寡核苷酸缀合。
31.固定步骤可以在捕获剂的结合之后，使得捕获剂可以固定到样品上。这种固定步骤可以允许在组织表面上执行随后的扩增步骤。在一些情况下，这种固定步骤可以允许在扩增后进行可靠的多路复用和/或迭代标记和成像步骤。
32.寡核苷酸可以各自与环状核酸引物接触以为扩增步骤做准备。在一些情况下，环状核酸引物在与寡核苷酸接触之前可以是非环状的，并且一旦与寡核苷酸接触就会被环化。在一些情况下，非环状核酸一旦与寡核苷酸接触就可以通过连结使其环化。例如，在一些情况下，环状核酸引物可以是rca反应的模板。在一些情况下，非环状核酸引物在通过连结环化为环状核酸引物后可以作为rca的模板。此类引物可以包括与寡核苷酸的区段互补的区段，所述寡核苷酸与捕获剂结合。在一些情况下，此类引物可以包括探针区段。当在扩增步骤期间拷贝探针区段时，探针区段的拷贝可以与核酸探针互补。在一些情况下，探针区段可以具有与核酸探针相同的序列。在一些情况下，每种寡核苷酸可以与不同的环状核酸引物接触。
33.在应用环状核酸之后，可以执行rca反应以扩增样品。可以在捕获剂结合之后，并且在一些情况下，在交联或固定步骤之后，在样品的表面上执行rca反应。与如免疫荧光法或免疫组织化学法等没有执行此类扩增的类似方法相比，rca可以提供增强的灵敏度。rca可以包括例如与寡核苷酸结合的环状核酸探针的等温扩增，使得环状核酸探针充当rca反应的引物在一些情况下，如当环状核酸引物具有探针区段时，rca反应可以导致为标记的探针创建多个结合位点。
34.在rca反应之后，可以使经过扩增的寡核苷酸的子集与包括标记的探针接触。这些探针可以是可以与每个rca反应中创建的探针区段的拷贝结合的核酸序列。在一些情况下，这些探针可以是可以与每个rca反应中创建的探针区段的拷贝互补的核酸序列。在一些情况下，每个探针可以与子集中的经过扩增的寡核苷酸之一结合。在一些情况下，对子集中的每个不同的经过扩增的寡核苷酸使用不同的探针序列。在一些情况下，子集中的每个经过扩增的寡核苷酸可以与一个探针序列结合。以这种方式，与经过扩增的寡核苷酸的子集中的寡核苷酸相关联的每个所关注生物特征可以与不同的探针相关联。这可以允许对每个所关注生物特征进行检测。
35.在探针杂交之后可以读取样品以确定探针中的每个探针的结合模式。此读取可以指示关于通过捕获剂与探针中的每个探针相关联的所关注生物特征的空间信息。在一些情况下，读取样品可以包括检测探针中的一个或多个探针上的标记。可以使用适于检测标记的任何可接受的方法来完成读取。例如，如果标记是染料标记或荧光标记，则可以通过分别用白光或荧光显微镜使样品成像来完成。作为另一个实例，如果标记是酶标记，则可以通过向酶提供底物、允许反应发生以及检测反应的产物来完成。
36.在读取样品之后，可以将标记灭活或去除。在一些情况下，可以从探针上去除标记，而探针保留在经过扩增的寡核苷酸上。在一些情况下，可以将带有其标记的探针从经过扩增的寡核苷酸中去除。在一些情况下，标记可以被灭活，使得不再从与标记相关联的探针中检测到信号。灭活或去除步骤可以允许随后几轮的样品读取，以确定不同探针集合的结合模式。
37.可以用可以与寡核苷酸的不同子集结合的不同标记探针集合重复接触和读取。在一些情况下，包括先前未探查的经过扩增的寡核苷酸的经过扩增的寡核苷酸的子集可以各自与包括标记的探针接触。在一些情况下，新子集中的每个经过扩增的寡核苷酸可以与不同于新子集中的其它经过扩增的寡核苷酸的不同探针结合。在一些情况下，每个探针只能与新子集中的一个经过扩增的寡核苷酸结合。
38.可以执行读取步骤来读取新的标记集合，以确定新的探针集合的结合模式。因此，读取可以指示关于与第一次迭代不同的所关注生物特征的空间信息。在一些情况下，可以重复去除或灭活标记、接触和读取步骤。在一些情况下，重复可以一直持续到检测到预定数量的或所有所关注生物特征为止。
39.本文提供的方法可以提供与其它测定法(如免疫组织化学法或免疫荧光法)相比可以提供更高灵敏度的扩增策略。这些方法可以允许测定的多路复用，并且在一些情况下可以实现对低水平标志物或可用抗体可能相对较弱的标志物的检测。
40.在本文的一些方法中，扩增rca反应可以允许信号的扩增，这可以增加检测分子相对于每个抗体分子的化学计量。与其它测定相比，此化学计量可以增加至少5倍、至少15倍、
至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少5000倍或至少10000倍。
41.在一些情况下，本文提供的方法可以允许对可能低于其它检测测定的检测极限的标志物进行检测，所述其它检测测定包含不具有扩增步骤的一些其它测定以及具有扩增步骤的一些其它测定。
42.此类方法的实例在图1的4个步骤中展示。在第一步中，与寡核苷酸连接的抗体可以与样品(样品未示出)结合。此寡核苷酸可以包括“条形码”或能够结合环状核酸引物的区域。在此图示中，整个寡核苷酸可以用作条形码。在其它实例中，可以小于整个寡核苷酸的寡核苷酸的一部分可以用作条形码。可以设计环状核酸引物(“挂锁探针”)，使得一端可以是条形码的一部分的反向补体(第一结合序列)，并且另一端可以是条形码的另一部分的补体(第二结合序列)。这两个末端之间可以是具有探针序列的区域。在第二步中，环状核酸引物可以通过第一和第二结合序列与寡核苷酸杂交，使得环状核酸引物呈圆形。环状核酸引物的末端可以连结。在第三步中，可以执行rca，从而延伸寡核苷酸，得到经过扩增的寡核苷酸，所述经过扩增的寡核苷酸可以包括可以与挂锁探针以重复方式互补的一串核酸。值得注意的是，探针序列可以在此经过扩增的寡核苷酸中重复多次。在第4步中，可以将经过扩增的寡核苷酸与标记的探针一起温育，所述标记的探针可以各自包括可以与探针序列互补的核酸序列。此类探针可以与可检测的标记连接。标记的探针可以与经过扩增的寡核苷酸上的探针序列杂交，并且可以例如通过成像来检测。在一些情况下，这种方法可以被称为1型rca方法。
43.此类方法的另一个实例在图2的4个步骤中展示。在第一步中，与寡核苷酸连接的抗体可以与样品(样品未示出)结合。此寡核苷酸可以包括“条形码”或可以能够结合环状核酸引物的区域。在此图示中，整个寡核苷酸可以用作条形码。在其它实例中，可以小于整个寡核苷酸的寡核苷酸的一部分可以用作条形码。可以设计环状核酸引物(“挂锁探针”)，使得一端可以是条形码的一部分的反向补体(第一结合序列)，并且另一端可以是条形码的另一部分的补体(第二结合序列)。当寡核苷酸在下一步中连结成圆形时，这两个报告序列可以构成探针序列。在第二步中，环状核酸引物可以通过第一和第二结合序列与寡核苷酸杂交，使得环状核酸可以呈圆形。环状核酸引物的末端可以连结。在第三步中，可以执行rca，从而延伸寡核苷酸，得到经过扩增的寡核苷酸，所述经过扩增的寡核苷酸可以包括可以与挂锁探针以重复方式互补的一串核酸。值得注意的是，探针序列可以在此经过扩增的寡核苷酸中重复多次。在第4步中，可以将经过扩增的寡核苷酸与标记的探针一起温育，所述标记的探针可以各自包括可以与探针序列互补的核酸序列。此类探针可以与可检测的标记连接。标记的探针可以与经过扩增的寡核苷酸杂交，并且可以例如通过成像来检测。在一些情况下，这种方法可以被称为2型rca方法。
44.样品
45.样品可以是生物样品。样品可以是新鲜的、冷冻的或固定的(例如，化学固定的)。样品可以是动物、植物、细菌、真菌或原生生物样品。在一些情况下，样品可以是人、小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊、猴、兔、果蝇、青蛙、线虫或土拨鼠的样品。样品可以包括细胞(例如，分离的细胞、永生化细胞、原代细胞、培养的细胞或组织或生物体的细胞)、生物组织、生物流体、匀浆，或者可以是未知样品。在一些情况下，样品可以包括病原体。病原体可以是经过培养的
或未经培养的。病原体可以是样品的感染。在一些情况下，病原体可以是从中采集样品的生物体的细胞、流体、组织、器官或微生物组的感染。在一些情况下，样品可以包括病原体，所述病原体是酵母细胞、细菌细胞、病毒、病毒载体或朊病毒。
46.样品可以是组织切片。在一些情况下，组织切片可以指已经从受试者获得、任选地固定、切片并装在平面表面(例如，显微镜载玻片)上的一片组织。
47.样品可以是平面样品。在一些情况下，样品可以固定在表面上。在一些情况下，表面可以是载玻片、平板、孔、管、膜、薄膜或珠。在一些情况下，样品可以接触载玻片。可以将接触载玻片的样品附着到载玻片上，使得有效地固定样品。这可以例如通过固定或冷冻样品来完成。同样，可以使用相同或类似的附着技术将样品固定在另一种类型的表面上。
48.在一些情况下，样品可以是福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)的组织切片。ffpe可以指一片组织，例如，已经从受试者获得、固定在例如福尔马林或甲醛(例如，3％
‑
5％福尔马林或甲醛的磷酸盐缓冲盐水溶液)或布安溶液(bouin solution)中、包埋在蜡中、切成薄切片并且然后固定在显微镜载玻片上的活体组织切片。
49.样品可以是非平面样品。非平面样品可以是基本上不平坦的样品，例如，已经通过如透明脂质交换丙烯酰胺杂交刚性成像相容性组织
‑
水凝胶(clarity)等折射率匹配技术制成透明的(例如，淋巴结、脑、肝等的)整个或部分器官支架。参见，例如，roberts等人,《可视化实验杂志(j vis exp.)》2016；(112):54025。可以使用如苄醇/苯甲酸苄酯(babb)或苄醚等清洁剂来使样本透明。
50.可以使用醛、醇、氧化剂、汞、苦味酸盐或hope固定剂来固定样品。在一些情况下，可以使用丙酮、甲醛、福尔马林、多聚甲醛、乙醇或甲醇来固定样品。可替代地，可以使用热固定来固定样品。可以通过浸入或灌注来实现固定。
51.在一些情况下，生物样品可以被冷冻。在一些情况下，生物样品可以在低于0℃、低于
‑
10℃、低于
‑
20℃、低于
‑
30℃、低于
‑
40℃、低于
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50℃、低于
‑
60℃、低于
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70℃或低于
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80℃的条件下冷冻。
52.在一些情况下，生物样品可以以三维形式固定。所述三维形式可以是冷冻块、石蜡块或冷冻液体。例如，生物样品可以是最佳切割温度(oct)化合物中的冷冻动物组织块。这种组织块可以被冷冻或固定。在一些情况下，可以切开组织块以露出表面，所述表面可以是抗体或抗体片段接触的表面。有时，可以将块切成薄片，使得块的连续表面可以被抗体或抗体片段接触。在这种情况下，可以获取三维或近似三维数据的数据。
53.所关注生物特征
54.样品可以包括所关注生物特征。所关注生物特征可以包括可以使用本文所述的方法测量的样品的任何部分。在一些情况下，所关注生物特征可以包括可以通过与捕获剂结合来指示的样品的一部分。所关注生物特征可以是如用于标准化的如管家特征等对照特征(例如，肌动蛋白)、可以鉴定细胞的一部分的特征(例如，与细胞核、核膜、内质网、线粒体、细胞膜或细胞的其它部分相关联的蛋白质)、可以鉴定细胞类型的特征(例如，细胞表面标志物或在特定细胞类型中表达的蛋白质，如免疫细胞或癌细胞)或另一种所关注特征。在一些情况下，所关注生物特征可以是如癌症、糖尿病、心脏病、肺病、自身免疫性疾病、炎性疾病等疾病或另一种类型的疾病的标志物。在一些情况下，所关注生物特征可以是损伤的标志物或在伤口愈合期间存在的标志物。在一些情况下，所关注生物特征可以是可以指示健
康细胞的标志物。在一些情况下，所关注生物特征可以是用于诊断、药物发现、研究、鉴定或优化目的的所关注特征。在一些情况下，所关注生物特征可以是抗原。在一些情况下，所关注生物特征可以包括细胞壁、细胞核、细胞质、膜、角蛋白、肌纤维、胶原、骨、蛋白质、核酸(例如，mrna或基因组dna等)、脂肪等。所关注生物特征还可以例如使用与寡核苷酸连接的捕获剂通过免疫组织学方法来指示。
55.样品可以包括可以使用本文中的方法检测的许多所关注生物特征。在一些情况下，本文中的方法的多路复用特征(例如，允许去除标记同时保持捕获剂在样品上完整，从而允许所述方法在单个样品上几次或多次迭代)可以用于检测许多所关注生物特征。在一些情况下，可以检测到至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个或至少100个所关注生物特征。在一些情况下，可以检测到约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个或约100个所关注生物特征。在一些情况下，比使用其它方法相比，使用本方法可以在样品中检测到更多的生物特征，所述其它方法如非多路复用方法、必须从样品中剥离捕获剂的方法、不包含将捕获剂固定样品或与样品交联的方法、没有扩增的方法或具有与rca不同的扩增方法的方法。
56.所关注生物特征可以包括标志物。标志物可以是如蛋白质等可以告知细胞的类型、疾病状态、致病性、衰老或其它性质的细胞内分子。在一些情况下，标志物可以告知细胞类型，如淋巴细胞、t细胞、b细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、生殖细胞、干细胞、神经细胞、癌细胞、健康细胞、衰老细胞、感染细胞或属于特定器官的细胞(例如，心脏细胞、支持细胞、肝细胞、真皮细胞、甲状腺细胞、肺细胞、肠细胞、扁桃体细胞、肌肉细胞、骨细胞、视网膜细胞如视杆细胞或视锥细胞，或另一种器官的细胞)。在一些情况下，可以使用标志物鉴定病原体。
57.标志物可以是疾病标志物。疾病标志物可以是可以在形状、活性、数量、位置或是否存在于具有给定疾病状态的细胞方面发生改变的标志物(例如，蛋白质)。例如，疾病标志物可以包括癌症标志物(例如，乳腺癌标志物、胰腺癌标志物、淋巴瘤标志物、头颈癌标志物、胃癌标志物、睾丸癌标志物、白血病标志物、肝细胞癌标志物、肺癌标志物、黑色素瘤标记、卵巢癌标志物、甲状腺癌标志物或另一种类型的癌症的标志物)、传染病标志物(例如，由病原体引起的疾病的标志物，如病原体上的标志物或被病原体感染的细胞或组织的标志物)或遗传性疾病标志物。
58.标志物可以是诊断标志物。诊断标志物可以是例如体内特定的生物化学物质，所述生物化学物质具有特定的分子特征，使其可用于检测疾病、测量疾病进展或治疗效果，或用于测量所关注过程。
59.标志物可以是低水平标志物，如低水平表面标志物。
60.捕获剂
61.捕获剂可以是可以与样品结合的分子。在一些情况下，捕获剂可以与样品的所关注生物特征结合。在一些情况下，捕获剂可以与样品中的生物特征上的互补位点特异性结
合。简而言之，所关注生物特征可以是可以使用本文所述的方法使用捕获剂检测的样品的特征。在一些情况下，所关注生物特征可以被捕获剂结合。
62.捕获剂可以是能够结合生物特征的分子。在一些情况下，捕获剂可以包括蛋白质、肽、适体或寡核苷酸。在一些情况下，捕获剂可以包括抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段可以包括分离的抗体或其抗原结合片段、纯化的抗体或其抗原结合片段、重组抗体或其抗原结合片段、经修饰的抗体或其抗原结合片段或合成的抗体或其抗原结合片段。应当理解，本文所述的抗体可以如本领域已知的那样进行修饰。
63.作为抗体或其抗原结合片段的捕获剂可以包括可变区。在一些情况下，可变区可以包括抗体或其抗原结合片段的一部分，所述部分可以接触样品或与样品特异性结合，以与所关注生物特征结合。可变区可以指抗体轻链的可变区、抗体重链的可变区或抗体轻链的可变区和抗体轻链的可变区的组合。在一些情况下，结合不同所关注生物特征的捕获剂可以包括在氨基酸序列、蛋白质修饰、三维结构或其组合方面不同的可变区。
64.包括抗体或其抗原结合片段的捕获剂可以包括抗体或抗体片段可以包括igg、igm、多克隆抗体、单克隆抗体、scfv、纳米抗体、fab或双抗体。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段可以来源于小鼠、大鼠、兔、人、骆驼科或山羊。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段可以针对人、小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊、猴、兔、果蝇、青蛙、线虫或土拨鼠抗原产生。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段可以针对动物、植物、细菌、真菌或原生生物抗原产生。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段可以针对病毒、病毒载体或朊病毒产生。
65.在一些情况下，方法可以包括用多种捕获剂标记样品。此步骤涉及在捕获剂可以与样品中的所关注生物特征结合的条件下，使样品(例如，装在如显微镜载玻片等平面上的ffpe切片)与所有捕获剂全体接触。用于使抗体和适体与样品中的位点结合的方法是众所周知的。
66.捕获剂可以处于缓冲液中。在一些情况下，可以将捕获剂应用于缓冲液中的样品。包括捕获剂的缓冲液可以具有可以允许捕获剂在捕获剂可以与所关注生物特征结合的状态下被配置或折叠的性质。在一些情况下，包括捕获剂的缓冲液可以具有可以促进捕获剂与所关注生物特征结合的特性。在一些情况下，包括捕获剂的缓冲液可以具有对捕获剂无破坏性、对寡核苷酸无破坏性、对样品无破坏性或对所关注生物特征无破坏性的性质。
67.捕获剂可以对所关注生物特征具有特异性。在一些情况下，捕获剂可以仅对一个所关注生物特征具有特异性。在一些情况下，捕获剂可以对所关注生物特征具有特异性，所述特异性大于所述捕获剂对不同所关注生物特征的特异性。在一些情况下，捕获剂可以对一个所关注生物特征具有特异性，所述特异性远大于其对其它所关注生物特征的特异性，使得其可以用于可靠地检测第一个所关注生物特征。
68.捕获剂可以对样品的元素具有亲和力。在一些情况下，亲和力可以指抗体能够与元素结合的速度或强度。有时可以用解离常数(kd)来描述亲和力。捕获剂的kd可以不超过10
‑4m、不超过10
‑5m、不超过10
‑6m、不超过10
‑7m、不超过10
‑8m、不超过小于10
‑9m、不超过10
‑
10
m、不超过10
‑
11
m、不超过10
‑
12
m、不超过10
‑
13
m或不超过10
‑
14
m。在一些情况下，捕获剂的kd可以为约10
‑4m、约10
‑5m、约10
‑6m、约10
‑7m、约10
‑8m、约10
‑9m、约10
‑
10
m、约10
‑
11
m、约10
‑
12
m、约10
‑
13
m或约10
‑
14
m。
69.捕获剂可以在所关注生物特征上的结合位点处与所关注生物特征结合。这种结合
位点例如可以是表位。在一些情况下，表位可以是所关注生物特征的一部分。在这种情况下，所关注生物特征可以包括抗原。在一些情况下，表位可以结合作为抗体或其抗原结合片段的捕获剂。在这种情况下，抗体或其抗原结合片段的可变区可以在其表位处结合所关注生物特征。
70.在一些情况下，捕获剂可以过量地应用于样品。
71.在一些情况下，在捕获剂与样品接触之后，可以允许将其温育一段时间。在一些情况下，捕获剂可以在样品上温育持续至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少1.5小时、至少2小时、至少2.5小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时或至少6小时。在一些情况下，捕获剂可以在样品上温育持续不超过30秒、不超过1分钟、不超过2分钟、不超过3分钟、不超过4分钟、不超过5分钟、不超过10分钟、不超过15分钟、不超过20分钟、不超过25分钟、不超过30分钟、不超过35分钟、不超过40分钟、不超过45分钟、不再不超过50分钟、不超过55分钟、不超过60分钟、不超过1.5小时、不超过2小时、不超过2.5小时、不超过3小时、不超过3.5小时、不超过4小时、不超过4.5小时、不超过5小时、不超过5.5小时或不超过6小时。在一些情况下，捕获剂可以在样品上温育持续30秒与6小时之间、30秒与3小时之间、30秒与60分钟之间、30秒与45分钟之间、30秒与30分钟之间、30秒与15分钟之间、30秒与5分钟之间、30秒与1分钟之间、1分钟与6小时之间、1分钟与3小时之间、1分钟与60分钟之间、1分钟与45分钟之间、1分钟与30分钟之间、1分钟与15分钟之间、1分钟与5分钟之间、5分钟与6小时之间、5分钟与3小时之间、5分钟与60分钟之间、5分钟与45分钟之间、5分钟与30分钟之间、5分钟与15分钟之间、15分钟与6小时之间、15分钟与3小时之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、15分钟与30分钟之间、30分钟与6小时之间、30分钟与3小时之间、30分钟与60分钟之间、30分钟与45分钟之间、45分钟与6小时之间、45分钟与3小时之间、45分钟与60分钟之间、60分钟与6小时之间或60分钟与3小时之间。
72.在一些情况下，在样品与捕获剂接触之后，可以允许捕获剂在给定温度下在样品上温育。捕获剂可以在以下温度下在样品上温育：约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃或约55℃。在一些情况下，捕获剂可以在以下温度下温育：至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少11℃、至少12℃、至少13℃、至少14℃、至少15℃、至少15℃、至少16℃、至少17℃、至少18℃、至少19℃、至少20℃、至少21℃、至少22℃、至少23℃、至少24℃、至少25℃、至少26℃、至少27℃、至少28℃、至少29℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃或至少55℃。在一些情况下，捕获剂可以在以下温度下温育：不超过4℃、不超过5℃、不超过6℃、不超过7℃、不超过8℃、不超过9℃、不超过10℃、不超过11℃、不超过12℃、不超过13℃、不超过14℃、不超过15℃、不超过16℃、不超过17℃、不超过18℃、不超过19℃、不超过20℃、不超过21℃、不超过22℃、不超过23℃、不超过24℃、不超过25℃、不超过26℃、不超过27℃、不超过28℃、不超过29℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃、不超过45℃、不超过50℃或不超过55℃。在一些情况下，捕获剂可以在以下温度下温育：4℃与55℃之间、4℃与50℃之间、4℃与45℃之间、4℃与40℃
之间、4℃与35℃之间、4℃与30℃之间、4℃与25℃之间、4℃与20℃之间、4℃与15℃之间、4℃与10℃之间、10℃与55℃之间、10℃与50℃之间、10℃与45℃之间、10℃与40℃之间、10℃与35℃之间、10℃与30℃之间、10℃与25℃之间、10℃与20℃之间、10℃与15℃之间、15℃与55℃之间、15℃与50℃之间、15℃与45℃之间、15℃与40℃之间、15℃与35℃之间、15℃与30℃之间、15℃与25℃之间、15℃与20℃之间、20℃与55℃之间、20℃与50℃之间、20℃与45℃之间、20℃与40℃之间、20℃与35℃之间、20℃与30℃之间、20℃与25℃之间、25℃与55℃之间、25℃与50℃之间、25℃与45℃之间、25℃与40℃之间、25℃与35℃之间、25℃与30℃之间、30℃与55℃之间、30℃与50℃之间、30℃与45℃之间、30℃与40℃之间、30℃与35℃之间、35℃与55℃之间、35℃与50℃之间、35℃与45℃之间、35℃与40℃之间、40℃与55℃之间、40℃与50℃之间、40℃与45℃之间、45℃与55℃之间、45℃与50℃之间或50℃与55℃之间。
73.在一些情况下，在样品与捕获剂接触之后，可以将过量的捕获剂洗掉。在一些情况下，可以使用洗涤缓冲液执行洗涤步骤。洗涤缓冲液可以是能够洗掉过量的捕获剂而不会显著影响样品、结合的捕获剂或与捕获剂结合的寡核苷酸的任何缓冲液。在一些情况下，洗涤缓冲液可以包括pbs、pbs
‑
t、tbs、tbs
‑
t水、盐水或克雷布氏缓冲液(kreb's buffer)。
74.可以在一次或多次洗涤中洗掉过量的捕获剂。在一些情况下，洗涤可以执行约1次、约2次、约3次、约4次、约5次或约6次。在一些情况下，洗涤可以执行至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次或至少6次。在一些情况下，洗涤可以执行不超过1次、不超过2次、不超过3次、不超过4次、不超过5次或不超过6次。在一些情况下，洗涤可以执行1次与6次之间、1次与5次之间、1次与4次之间、1次与3次之间、1次与2次之间、2次与6次之间、2次与5次之间、2次与4次之间、2次与3次之间、3次与6次之间、3次与5次之间、在3次与4次之间、4次与6次之间、4次与5次之间或5次与6次之间。
75.每次洗涤可以持续约10秒、约15秒、约30秒、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟或约15分钟。每次洗涤可以持续至少10秒、至少15秒、至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟或至少15分钟。在一些情况下，洗涤可以持续不到10秒。每次洗涤可以持续最多10秒、最多15秒、最多30秒、最多1分钟、最多2分钟、最多3分钟、最多4分钟、最多5分钟、最多10分钟或最多15分钟。在一些情况下，洗涤可以持续15分钟以上。每次洗涤可以介于10秒与15分钟之间、10秒与10分钟之间、10秒与5分钟之间、10秒与1分钟之间、10秒与30秒之间、30秒与15分钟之间、30秒与10分钟之间、30秒与5分钟之间、30秒与1分钟之间、1分钟与15分钟之间、1分钟与10分钟之间、1分钟与5分钟之间、5分钟与15分钟之间、5分钟与10分钟之间或10分钟与15分钟之间。
76.洗涤温度可以为约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃或约55℃。在一些情况下，洗涤温度可以为至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少11℃、至少12℃、至少13℃、至少14℃、至少15℃、至少15℃、至少16℃、至少17℃、至少18℃、至少19℃、至少20℃、至少21℃、至少22℃、至少23℃、至少24℃、至少25℃、至少26℃、至少27℃、至少28℃、至少29℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃或至少55℃。在一些情况下，洗涤温度可以为不超过4℃、不超过5℃、不超
过6℃、不超过7℃、不超过8℃、不超过9℃、不超过10℃、不超过11℃、不超过12℃、不超过13℃、不超过14℃、不超过15℃、不超过16℃、不超过17℃、不超过18℃、不超过19℃、不超过20℃、不超过21℃、不超过22℃、不超过23℃、不超过24℃、不超过25℃、不超过26℃、不超过27℃、不超过28℃、不超过29℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃、不超过45℃、不超过50℃或不超过55℃。在一些情况下，洗涤温度可以介于4℃与55℃之间、4℃与50℃之间、4℃与45℃之间、4℃与40℃之间、4℃与35℃之间、4℃与30℃之间、4℃与25℃之间、4℃与20℃之间、4℃与15℃之间、4℃与10℃之间、10℃与55℃之间、10℃与50℃之间、10℃与45℃之间、10℃与40℃之间、10℃与35℃之间、10℃与30℃之间、10℃与25℃之间、10℃与20℃之间、10℃与15℃之间、15℃与55℃之间、15℃与50℃之间、15℃与45℃之间、15℃与40℃之间、15℃与35℃之间、15℃与30℃之间、15℃与25℃之间、15℃与20℃之间、20℃与55℃之间、20℃与50℃之间、20℃与45℃之间、20℃与40℃之间、20℃与35℃之间、20℃与30℃之间、20℃与25℃之间、25℃与55℃之间、25℃与50℃之间、25℃与45℃之间、25℃与40℃之间、25℃与35℃之间、25℃与30℃之间、30℃与55℃之间、30℃与50℃之间、30℃与45℃之间、30℃与40℃之间、30℃与35℃之间、35℃与55℃之间、35℃与50℃之间、35℃与45℃之间、35℃与40℃之间、40℃与55℃之间、40℃与50℃之间、40℃与45℃之间、45℃与55℃之间、45℃与50℃之间或50℃与55℃之间。
77.寡核苷酸
78.寡核苷酸可以是分子，所述分子可以是核苷酸链。本文所述的寡核苷酸可以包括核糖核酸。本文所述的寡核苷酸可以包括脱氧核糖核酸。在一些情况下，寡核苷酸可以具有任何序列，包含用户指定的序列。
79.有时，寡核苷酸可以包括g、a、t、u、c或能够与互补核苷酸进行可靠地碱基配对的碱基。7
‑
脱氮
‑
腺嘌呤、7
‑
脱氮
‑
鸟嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、2
‑
脱氮
‑2‑
硫代
‑
鸟苷、2
‑
硫代
‑7‑
脱氮
‑
鸟苷、2
‑
硫代
‑
腺嘌呤、2
‑
硫代
‑7‑
脱氮
‑
腺嘌呤、异鸟嘌呤、7
‑
脱氮
‑
鸟嘌呤、5,6
‑
二氢尿苷、5,6
‑
二氢胸腺嘧啶、黄嘌呤、7
‑
脱氮
‑
黄嘌呤、次黄嘌呤，7
‑
脱氮
‑
黄嘌呤、2,6
‑
二氨基
‑7‑
脱氮嘌呤、5
‑
甲基
‑
胞嘧啶、5
‑
丙炔基
‑
尿苷、5
‑
丙炔基
‑
胞苷、2
‑
硫代
‑
胸腺嘧啶或2
‑
硫代
‑
尿苷是此类碱基的实例，但许多其它碱基是已知的。例如，寡核苷酸可以包括lna、pna、una或吗啉代寡聚物。本文所使用的寡核苷酸可以含有天然或非天然核苷酸或键。
80.寡核苷酸的长度可以为至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个或至少100个核苷酸。在一些情况下，寡核苷酸的长度可以介于10
‑
30个核苷酸之间、10
‑
50个核苷酸之间、10
‑
70个核苷酸之间、10
‑
100个核苷酸之间、20
‑
50个核苷酸之间、20
‑
70个核苷酸之间、20
‑
100个核苷酸之间、30
‑
50个核苷酸之间、30
‑
70个核苷酸之间、30
‑
100个核苷酸之间、40
‑
70个核苷酸之间、40
‑
100个核苷酸之间、50
‑
70个核苷酸之间、50
‑
100个核苷酸之间、60
‑
70个核苷酸之间、60
‑
80个核苷酸之间、60
‑
90个核苷酸之间或60
‑
100个核苷酸之间。在一些情况下，寡核苷酸的长度可以为不超过5个、不超过10个、不超过15个、不超过20个、不超过25个、不超过30个、不超过35个、不超过40个、不超过45个、不超过50个、不超过55个、不超过60个、不超过65个、不超过70个、不超过75个、不超过80个、不超过85个、不超过90个、不超过95个或不超过100个核苷酸。
81.在一些情况下，寡核苷酸可以是完全单链的。在一些情况下，寡核苷酸可以是部分双链的。部分双链区域可以位于寡核苷酸的3'末端、位于寡核苷酸的5'末端或位于寡核苷酸的5'末端与3'末端之间。在一些情况下，可能有多于一个的双链区。
82.在一些情况下，寡核苷酸可以具有二级结构。在一些情况下，寡核苷酸可以具有三级结构。一些寡核苷酸可以具有自身能够折叠(例如，如果寡核苷酸的一个区域与寡核苷酸的另一区域互补)以产生包括单链的一个或多个双链区的结构。
83.在一些情况下，能够结合环状核酸引物的寡核苷酸的区段可以在寡核苷酸的单链区或寡核苷酸的未折叠区中暴露。在一些情况下，能够结合环状核酸引物的寡核苷酸的区段可以在寡核苷酸的双链区或折叠区中，使得寡核苷酸融化时，这种环状核酸引物可以结合。
84.在一些情况下，寡核苷酸可以与捕获剂缀合或结合。在一些情况下，可以使用捕获剂上的任何合适的化学部分直接将寡核苷酸与捕获剂缀合或结合。在一些情况下，寡核苷酸可以例如通过连结与捕获剂酶促连接。在一些情况下，寡核苷酸可以例如通过非共价相互作用如生物素/链霉亲和素相互作用或其等同物、通过适体或第二抗体或通过蛋白
‑
蛋白相互作用如亮氨酸
‑
拉链标签相互作用等间接与捕获剂连接。
85.在一些情况下，可以使用点击化学或类似方法将寡核苷酸与捕获剂结合。点击化学可以指一类生物相容的小分子反应，其可以允许如寡核苷酸和捕获剂等分子的结合。点击反应可以是一锅反应，并且在一些情况下不受水的干扰。点击反应可以产生最少的副产物、无害的副产物或没有副产物。巨大的热力学力可以驱动点击反应。在一些情况下，点击反应可以被快速和/或不可逆地驱动至高产率的单个反应产物(例如，与捕获剂缀合的寡核苷酸)，并且可以具有高反应特异性。点击反应可以包含但不限于[3+2]环加成反应、巯
‑
烯反应、狄尔斯
‑
阿尔德反应(diels
‑
alder reactions)、反电子需求狄尔斯
‑
阿尔德反应、[4+1]环加成反应、亲核取代反应、类似羰基化学的脲形成或碳
‑
碳双键的加成反应(例如，二羟基化反应)。
[0086]
在一些情况下，这种寡核苷酸的一个或多个区段可以与环状核酸引物的核酸的一个或多个区段互补。这种区段的长度可以介于3与30个核酸之间、3与20个核酸之间、3与10个核酸之间、5与30个核酸之间、5与20个核酸之间、5与10个核酸之间、10与30个核酸之间、10与20个核酸之间或20与30个核酸之间。在一些情况下，这种区段的长度可以为至少3个核酸、至少5个核酸、至少10个核酸、至少15个核酸、至少20个核酸、至少25个核酸或至少30个核酸。在一些情况下，这种区段的长度可以为不超过3个核酸、不超过5个核酸、不超过10个核酸、不超过15个核酸、不超过20个核酸、不超过25个核酸长或不超过30个核酸。
[0087]
固定和交联。
[0088]
捕获剂可以固定到样品上。在一些情况下，只有与所关注生物特征结合的捕获剂才能固定到样品上。在一些情况下，所有与所关注生物特征结合的捕获剂都可以固定到样品上。在一些情况下，可以在过量(例如，未结合)的捕获剂被洗掉之后将捕获剂固定到样品上。
[0089]
在一些实施例中，捕获剂可以与样品交联或固定到样品上，从而防止捕获剂在后续步骤期间解离。在一些情况下，交联可以防止捕获剂在rca反应期间或一个或多个标记的失活或去除期间解离。因此，捕获剂与样品的固定或交联可以允许在样品上(而不是在溶液
中)执行rca反应，并且可以通过准许执行多次读取迭代而允许测定的多路复用，因为可以在不干扰捕获剂的情况下去除或灭活标记。此交联步骤可以使用任何胺
‑
胺交联剂(例如甲醛、二琥珀酰基氨基丁酸酯或具有类似作用的另一种试剂)进行，但是如果需要，可以使用多种其它化学品使捕获剂与样品交联。
[0090]
环状核酸引物
[0091]
本文中的环状核酸引物可以是可以用作rca反应的模板的核酸分子。在一些情况下，可以使寡核苷酸与环状核酸引物接触，并且可以根据环状核酸引物的序列使用rca反应来延长寡核苷酸。
[0092]
环状核酸引物可以是分子，所述分子可以是环状的核苷酸链。在一些情况下，环状核酸引物没有末端，使得如果使用环状核酸引物执行聚合酶链反应扩增，则扩增将不受引物长度的限制。
[0093]
核酸引物可以是分子，所述分子可以是环状的核苷酸链。环状可以意指链中每个核酸的3'末端可以与链中另一个核酸的5'末端连接，并且链中每个核酸的5'末端可以与链中另一个核酸的3'末端连接。本文所述的环状核酸引物可以包括核糖核酸。本文所述的环状核酸引物可以包括脱氧核糖核酸。在一些情况下，环状核酸引物可以具有任何序列，包含用户指定的序列。
[0094]
有时，环状核酸引物可以包括g、a、t、u、c或能够与互补核苷酸进行可靠地碱基配对的碱基。7
‑
脱氮
‑
腺嘌呤、7
‑
脱氮
‑
鸟嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、2
‑
脱氮
‑2‑
硫代
‑
鸟苷、2
‑
硫代
‑7‑
脱氮
‑
鸟苷、2
‑
硫代
‑
腺嘌呤、2
‑
硫代
‑7‑
脱氮
‑
腺嘌呤、异鸟嘌呤、7
‑
脱氮
‑
鸟嘌呤、5,6
‑
二氢尿苷、5,6
‑
二氢胸腺嘧啶、黄嘌呤、7
‑
脱氮
‑
黄嘌呤、次黄嘌呤，7
‑
脱氮
‑
黄嘌呤、2,6
‑
二氨基
‑7‑
脱氮嘌呤、5
‑
甲基
‑
胞嘧啶、5
‑
丙炔基
‑
尿苷、5
‑
丙炔基
‑
胞苷、2
‑
硫代
‑
胸腺嘧啶或2
‑
硫代
‑
尿苷是此类碱基的实例，但许多其它碱基是已知的。
[0095]
环状核酸引物可以包括可以与寡核苷酸的一个或多个区段互补的区段。这种区段的长度可以介于3与30个核酸之间、3与20个核酸之间、3与10个核酸之间、5与30个核酸之间、5与20个核酸之间、5与10个核酸之间、10与30个核酸之间、10与20个核酸之间或20与30个核酸之间。在一些情况下，这种区段的长度可以为至少3个核酸、至少5个核酸、至少10个核酸、至少15个核酸、至少20个核酸、至少25个核酸或至少30个核酸。在一些情况下，这种区段的长度可以为不超过3个核酸、不超过5个核酸、不超过10个核酸、不超过15个核酸、不超过20个核酸、不超过25个核酸长或不超过30个核酸。在一些情况下，这种区段的长度可以为15个核酸、16个核酸、17个核酸、18个核酸、19个核酸或20个核酸。这种区段的长度可以介于15个核酸与20个核酸之间、15个核酸与19个核酸之间、15个核酸与18个核酸之间、15个核酸与17个核酸之间、15个核酸与16个核酸之间、16个核酸与20个核酸之间、16个核酸与19个核酸之间、16个核酸与18个核酸之间、16个核酸与17个核酸之间、17个核酸与20个核酸之间、17个核酸与19个核酸之间、17个核酸与18个核酸之间、18个核酸与20个核酸之间、18个核酸与19个核酸之间或19个核酸与20个核酸之间。
[0096]
环状核酸引物可以包括探针区段。探针区段可以是当被拷贝时拷贝可以与核酸探针互补的区段。探针区段的长度可以介于3与30个核酸之间、3与20个核酸之间、3与10个核酸之间、5与30个核酸之间、5与20个核酸之间、5与10个核酸之间、10与30个核酸之间、10与20个核酸之间或20与30个核酸之间。在一些情况下，探针区段的长度可以为至少3个核酸、
至少5个核酸、至少10个核酸、至少15个核酸、至少20个核酸、至少25个核酸或至少30个核酸。在一些情况下，探针区段的长度可以为不超过3个核酸、不超过5个核酸、不超过10个核酸、不超过15个核酸、不超过20个核酸、不超过25个核酸长或不超过30个核酸。在一些情况下，这种区段的长度可以为15个核酸、16个核酸、17个核酸、18个核酸、19个核酸或20个核酸。这种区段的长度可以介于15个核酸与20个核酸之间、15个核酸与19个核酸之间、15个核酸与18个核酸之间、15个核酸与17个核酸之间、15个核酸与16个核酸之间、16个核酸与20个核酸之间、16个核酸与19个核酸之间、16个核酸与18个核酸之间、16个核酸与17个核酸之间、17个核酸与20个核酸之间、17个核酸与19个核酸之间、17个核酸与18个核酸之间、18个核酸与20个核酸之间、18个核酸与19个核酸之间或19个核酸与20个核酸之间。
[0097]
在一些情况下，环状核酸引物可以包括探针区段和与寡核苷酸的一个或多个区段互补的区段两者。在一些情况下，这种环状核酸引物的长度可以为约30个核酸、约40个核酸、约50个核酸、约60个核酸、约70个核酸、约80个核酸、约90个核酸、约100个核酸、约110个核酸或约120个核酸。在一些情况下，这种环状核酸引物的长度可以为至少30个核酸、至少40个核酸、至少50个核酸、至少60个核酸、至少70个核酸、至少80个核酸、至少90个核酸、至少100个核酸、至少110个核酸或至少120个核酸。在一些情况下，这种环状核酸引物的长度可以为不超过30个核酸、不超过40个核酸、不超过50个核酸、不超过60个核酸、不超过70个核酸、不超过80个核酸、不超过90个核酸、不超过100个核酸、不超过110个核酸或不超过120个核酸。在一些情况下，这种环状核酸引物的长度可以介于30个核酸与120个核酸之间、30个核酸与110个核酸之间、30个核酸与100个核酸之间、30个核酸与90个核酸之间、30个核酸与80个核酸之间、30个核酸与70个核酸之间、30个核酸与60个核酸之间、30个核酸与50个核酸之间、30个核酸与40个核酸之间、40个核酸与120个核酸之间、40个核酸与110个核酸之间、40个核酸与100个核酸之间、40个核酸与90个核酸之间、40个核酸与80个核酸之间、40个核酸与70个核酸之间、40个核酸与60个核酸之间、40个核酸与50个核酸之间、50个核酸与120个核酸之间、50个核酸与110个核酸之间、50个核酸与100个核酸之间、50个核酸与90个核酸之间、50个核酸与80个核酸之间、50个核酸与70个核酸之间、50个核酸与60个核酸之间、60个核酸与120个核酸之间、60个核酸与110个核酸之间、60个核酸与100个核酸之间、60个核酸与90个核酸之间、60个核酸与80个核酸之间、60个核酸与70个核酸之间、70个核酸与120个核酸之间、70个核酸与110个核酸之间、70个核酸与100个核酸之间、70个核酸与90个核酸之间、70个核酸与80个核酸之间、80个核酸与120个核酸之间、80个核酸与110个核酸之间、80个核酸与100个核酸之间、80个核酸与90个核酸之间、90个核酸与120个核酸之间、90个核酸与110个核酸之间、90个核酸与100个核酸之间、100个核酸与120个核酸之间、100个核酸与110个核酸或110个核酸与120个核酸之间。
[0098]
在一些情况下，环状核酸引物可以是挂锁引物。在一些情况下，挂锁引物可以是线性寡核苷酸，所述线性寡核苷酸在与连接到捕获剂的寡核苷酸接触后可以融合形成环状寡核苷酸。
[0099]
挂锁探针的5'末端的氨基酸可以被设计成与寡核苷酸的一部分的反向补体互补，而挂锁探针的3'末端的氨基酸可以被设计成与寡核苷酸的3'末端的一部分的补体互补。以这种方式，当挂锁探针接触寡核苷酸时，可能发生碱基对杂交，使得挂锁探针以环形方式与条形码序列结合。
[0100]
环状核酸探针在接触寡核苷酸之前可以是环状的。
[0101]
环形核酸探针可以是线性核酸引物，所述线性核酸引物在与寡核苷酸接触时呈环形。在这种情况下，引物可以在环状核酸探针的5'末端和3'末端处与寡核苷酸互补。在一些情况下，引物的5'末端上的以下数量的核酸可以与寡核苷酸上的核酸互补：至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个。在一些情况下，引物的3'末端上的以下数量的核酸可以与寡核苷酸上的核酸互补：至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个。在一些情况下，引物的5'末端上的以下数量的核酸可以与寡核苷酸上的核酸互补：不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个或不超过12个。在一些情况下，引物的3'末端上的以下数量的核酸可以与寡核苷酸上的核酸互补：不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个或不超过12个。在一些情况下，引物的5'末端上的以下数量的核酸可以与寡核苷酸上的核酸互补：3个与12个之间、3个与11个之间、3个与10个之间、3个与9个之间、3个与8个之间、3个与7个之间、3个与6个之间、3个与5个之间、3个与4个之间、4个与12个之间、4个与11个之间、4个与10个之间、4个与9个之间、4个与8个之间、4个与7个之间、4个与6个之间、4个与5个之间、5个与12个之间、5个与11个之间、5个与10个之间、5个与9个之间、5个与8个之间、5个与7个之间、5个与6个之间、6个与12个之间、6个与11个之间、6个与10个之间、6个与9个之间、6个与8个之间、6个与7个之间、7个与12个之间、7个与11个之间、7个与10个之间、7个与9个之间、7个与8个之间、8个与12个之间、8个与11个之间、8个与10个之间、8个与9个之间、9个与12个之间、9个与11个之间、9个与10个之间、10个与12个之间、10个与11个之间或11个与12个之间。在一些情况下，引物的3'末端上的以下数量的核酸可以与寡核苷酸上的核酸互补：3个与12个之间、3个与11个之间、3个与10个之间、3个与9个之间、3个与8个之间、3个与7个之间、3个与6个之间、3个与5个之间、3个与4个之间、4个与12个之间、4个与11个之间、4个与10个之间、4个与9个之间、4个与8个之间、4个与7个之间、4个与6个之间、4个与5个之间、5个与12个之间、5个与11个之间、5个与10个之间、5个与9个之间、5个与8个之间、5个与7个之间、5个与6个之间、6个与12个之间、6个与11个之间、6个与10个之间、6个与9个之间、6个与8个之间、6个与7个之间、7个与12个之间、7个与11个之间、7个与10个之间、7个与9个之间、7个与8个之间、8个与12个之间、8个与11个之间、8个与10个之间、8个与9个之间、9个与12个之间、9个与11个之间、9个与10个之间、10个与12个之间、10个与11个之间或11个与12个之间。
[0102]
可以使用已建立的寡核苷酸合成方法来合成寡核苷酸和环状核酸引物，以得到任何期望的核苷酸序列。合成寡核苷酸的方法是本领域众所周知的。此类方法的范围可以从标准酶消化然后是核苷酸片段分离(参见例如，sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(cloning:a laboratory manual)》,第三版，纽约冷泉港,(2000年)；wu等人，《基因生物技术方法(methods in gene biotechnology)》(crc出版社，纽约，n.y.，1997)和《分子生物学方法(methods in molecular biology)》中的“重组基因表达方案(recombinant gene expression protocols)”,第62卷(tuan编辑,新泽西州托托瓦胡玛纳出版社(humana press,totowa,n.j.),1997)，其公开内容通过引用并入本文)到纯合成方法，例如使用milligen或beckman系统1plus dna合成仪(例如，马萨诸塞州伯灵顿milligen
‑
biosearch
与2.5mm mgcl2之间、1.5mm mgcl2与2.0mm mgcl2之间、2.0mm mgcl2与4.0mm mgcl2之间、2.0mm mgcl2与3.5mm mgcl2之间、2.0mm mgcl2与3.0mm mgcl2之间、2.0mm mgcl2与2.5mm mgcl2之间、2.5mm mgcl2与4.0mm mgcl2之间、2.5mm mgcl2与3.5mm mgcl2之间、2.5mm mgcl2与3.0mm mgcl2之间、3.0mm mgcl2与4.0mm mgcl2之间、3.0mm mgcl2与4.5mm mgcl2之间或3.5mm mgcl2与4.0mm mgcl2之间。
[0114]
用于扩增的缓冲液可以包括氯化钾(kcl)。缓冲液可以包括至少1mm kcl、至少5mm kcl、至少10mm kcl、至少15mm kcl或至少20mm kcl。
[0115]
用于扩增的缓冲液可以包括不超过1mm kcl、不超过5mm kcl、不超过10mm kcl、不超过15mm kcl或不超过20mm kcl。
[0116]
用于扩增的缓冲液可以包括约1mm kcl、约5mm kcl、约10mm kcl、约15mm kcl或约20mm kcl。
[0117]
用于扩增的缓冲液可以包括1mm kcl与20mm kcl之间、1mm kcl与15mm kcl之间、1mm kcl与10mm kcl之间、1mm kcl与5mm kcl之间、5mm kcl与20mm kcl之间、5mm kcl与15mm kcl之间、5mm kcl与10mm kcl之间、10mm kcl与20mm kcl之间、10mm kcl与15mm kcl之间或15mm kcl与20mm kcl之间。
[0118]
在一些情况下，用于扩增的缓冲液可以包括dmso。缓冲液可以包括至少0.5％v/v dmso、至少1％v/v dmso、至少2％v/v dmso、至少3％v/v dmso、至少4％v/v dmso、至少5％v/v dmso、至少6％v/v dmso、至少7％v/v dmso、至少8％v/v dmso、至少9％v/v dmso、至少10％v/v dmso、至少15％v/v dmso、至少20％v/v dmso、至少25％v/vdmso或至少30％v/v dmso。
[0119]
用于扩增的缓冲液可以包括不超过0.5％v/v dmso、不超过1％v/v dmso、不超过2％v/v dmso、不超过3％v/v dmso、不超过4％v/v dmso、不超过5％v/v dmso、不超过6％v/v dmso、不超过7％v/v dmso、不超过8％v/v dmso、不超过9％v/v dmso、或不超过10％v/v dmso、不超过15％v/v dmso、不超过20％v/v dmso、不超过25％v/v dmso或不超过30％v/v dmso。
[0120]
用于扩增的缓冲液可以包括约0.5％v/v dmso、约1％v/v dmso、约2％v/v dmso、约3％v/v dmso、约4％v/v dmso、约5％v/v dmso、约6％v/v dmso、约7％v/v dmso、约8％v/v dmso、约9％v/v dmso、约10％v/v dmso、约15％v/v dmso、约20％v/v dmso、约25％v/v dmso或约30％v/v dmso。
[0121]
用于扩增的缓冲液可以包括dmso，其介于0.5％v/v dmso与30％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与25％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与20％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与15％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与10％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与9％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与8％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与7％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与6％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与5％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与4％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与3％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与2％v/v dmso之间、0.5％v/v dmso与1％v/v dmso之间、1％v/v dmso与30％v/v dmso之间、1％v/v dmso与25％v/v dmso之间、1％v/v dmso与20％v/v dmso之间、1％v/v dmso与15％v/v dmso之间、1％v/v dmso与10％v/v dmso之间、1％v/v dmso与9％v/v dmso之间、1％v/v dmso与8％v/v dmso之间、1％v/v dmso与7％v/v dmso之间、1％v/v dmso与6％v/v dmso之间、1％v/v dmso与
5％v/v dmso之间、1％v/v dmso与4％v/v dmso之间、1％v/v dmso与3％v/v dmso之间、1％v/v dmso与2％v/v dmso之间、2％v/v dmso与30％v/v dmso之间、2％v/v dmso与25％v/v dmso之间、2％v/v dmso与20％v/v dmso之间、2％v/v dmso与15％v/v dmso之间、2％v/v dmso与10％v/v dmso之间、2％v/v dmso与9％v/v dmso之间、2％v/v dmso与8％v/v dmso之间、2％v/v dmso与7％v/v dmso之间、2％v/v dmso与6％v/v dmso之间、2％v/v dmso与5％v/v dmso之间、2％v/v dmso与4％v/v dmso之间、2％v/v dmso与3％v/v dmso之间、3％v/v dmso与30％v/v dmso之间、3％v/v dmso与25％v/v dmso之间、3％v/v dmso与20％v/v dmso之间、3％v/v dmso与15％v/v dmso之间、3％v/v dmso与10％v/v dmso之间、3％v/v dmso与9％v/v dmso之间、3％v/v dmso与8％v/v dmso之间、3％v/v dmso与7％v/v dmso之间、3％v/v dmso与6％v/v dmso之间、3％v/v dmso与5％v/v dmso之间、3％v/v dmso与4％v/v dmso之间、4％v/v dmso与30％v/v dmso之间、4％v/v dmso与25％v/v dmso之间、4％v/v dmso与20％v/v dmso之间、4％v/v dmso与15％v/v dmso之间、4％v/v dmso与10％v/v dmso之间、4％v/v dmso与9％v/v dmso之间、4％v/v dmso与8％v/v dmso之间、4％v/v dmso与7％v/v dmso之间、4％v/v dmso与6％v/v dmso之间、4％v/v dmso与5％v/v dmso之间、5％v/v dmso与30％v/v dmso之间、5％v/v dmso与25％v/v dmso之间、5％v/v dmso与20％v/v dmso之间、5％v/v dmso与15％v/v dmso之间、5％v/v dmso与10％v/v dmso之间、5％v/v dmso与9％v/v dmso之间、5％v/v dmso与8％v/v dmso之间、5％v/v dmso与7％v/v dmso之间、5％v/v dmso与6％v/v dmso之间、6％v/v dmso与30％v/v dmso之间、6％v/v dmso与25％v/v dmso之间、6％v/v dmso与20％v/v dmso之间、6％v/v dmso与15％v/v dmso之间、6％v/v dmso与10％v/v dmso之间、6％v/v dmso与9％v/v dmso之间、6％v/v dmso与8％v/v dmso之间、6％v/v dmso与7％v/v dmso之间、7％v/v dmso与30％v/v dmso之间、7％v/v dmso与25％v/v dmso之间、7％v/v dmso与20％v/v dmso之间、7％v/v dmso与15％v/v dmso之间、7％v/v dmso与10％v/v dmso之间、7％v/v dmso与9％v/v dmso之间、7％v/v dmso与8％v/v dmso之间、8％v/v dmso与30％v/v dmso之间、8％v/v dmso与25％v/v dmso之间、8％v/v dmso与20％v/v dmso之间、8％v/v dmso与15％v/v dmso之间、8％v/v dmso与10％v/v dmso之间、8％v/v dmso与9％v/v dmso之间、9％v/v dmso与30％v/v dmso之间、9％v/v dmso与25％v/v dmso之间、9％v/v dmso与20％v/v dmso之间、9％v/v dmso与15％v/v dmso之间、9％v/v dmso与10％v/v dmso之间、10％v/v dmso与30％v/v dmso之间、10％v/v dmso与25％v/v dmso之间、10％v/v dmso与20％v/v dmso之间、10％v/v dmso与15％v/v dmso之间、15％v/v dmso与30％v/v dmso之间、15％v/v dmso与25％v/v dmso之间、15％v/v dmso与20％v/v dmso之间、20％v/v dmso与30％v/v dmso之间、20％v/v dmso与25％v/v dmso之间或25％v/v dmso与30％v/v dmso之间。
[0122]
在一些情况下，用于扩增的缓冲液可以具有指定的ph。用于扩增的缓冲液可以具有以下ph：约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。在一些情况下，缓冲液的ph可以介于6.8与7.0之间、6.9与7.1之间、7.0与7.2之间、7.1与7.3之间、7.2与7.4之间、7.3与7.5之间、7.4与7.6之间、7.5与7.7之间、7.6与7.8之间、7.7与7.9之间、7.8与8.0之间、7.9与8.1之间、8.0与8.2之间、8.1与8.3之间、8.2与8.4之间、8.3与8.5之间、8.4与8.6之间、8.5与8.7之间、8.6与8.8之间、8.7与8.9之间、8.8与9.0之间或8.9与
9.1之间。
[0123]
组分可以包括如本文所述的环状核酸引物。
[0124]
组分可以包括寡核苷酸，如附着到如本文所述的捕获分子的寡核苷酸。
[0125]
组分可以包括一种或多种核苷三磷酸。核苷三磷酸可以包括dna核苷三磷酸(dntp)或rna核苷三磷酸。在一些情况下，ntp组分可以包括腺苷三磷酸(atp)、脱氧腺苷三磷酸(datp)、鸟苷三磷酸(gtp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、胞苷三磷酸(ctp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、胸苷三磷酸(ttp)、脱氧胸苷三磷酸(dttp)、尿苷三磷酸(utp)和/或脱氧尿苷三磷酸(dutp)。在一些情况下，可以提供ntp分子的混合物。在一些情况下，ntp分子的混合物可以包括atp、gtp、ctp和utp。其它ntp分子可以包括datp的互变异构体、dgtp的互变异构体、dctp的互变异构体、datp的互变异构体、dutp的互变异构体。
[0126]
在一些情况下，ntp分子的混合物可以包括atp、gtp、ctp和ttp。在一些情况下，ntp分子的混合物可以包括datp、dgtp、dctp和dutp。在一些情况下，ntp分子的混合物可以包括datp、dgtp、dctp和dttp。在一些情况下，其它ntp分子可以包含在用于rca反应的组分中。
[0127]
在一些情况下，组分可以包括：至少100μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；至少200μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；至少300μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；至少400μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；至少600μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；至少600μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；或datp、dgtp、dctp和dttp各至少700μm。
[0128]
在一些情况下，组分可以包括：不超过100μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；不超过200μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；不超过300μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；不超过400μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；不超过500μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；不超过600μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种或不超过700μm的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种。
[0129]
在一些情况下，组分可以包括：100与700μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；100与600μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；100与500μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；100与400μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；100与300μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；100与200μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；200与700μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；200与600μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；200与500μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；200与400μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；200与300μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；300与700μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；300与600μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；300与500μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；300与400μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；400与700μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；400与600μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；400与500μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；500与700μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；500与600μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种；或600与700μm之间的datp、dgtp、dctp和dttp中的每一种。
[0130]
rca反应可以包括延长步骤。延长可以包括单链dna延长或单链rna延长。延长可以包括根据模板核酸链(即，环状核酸引物)将核苷酸添加到单个寡核苷酸链(即，与捕获剂连
接的寡核苷酸)。核酸到寡核苷酸链的添加可以通过酶(如聚合酶)来介导。
[0131]
延长步骤可以包括在聚合酶可以将核苷酸添加到寡核苷酸的温度下将寡核苷酸(例如，固定到样品上的与捕获剂连接的寡核苷酸)与pcr组分(包含例如聚合酶、缓冲液、环状核酸引物和ntp)一起温育。可以添加核苷酸以形成附加到寡核苷酸末端的核苷酸长链。
[0132]
延长步骤可以在以下温度下发生：至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少37℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃或至少75℃。
[0133]
延长步骤可以在以下温度下发生：不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过37℃、不超过40℃、不超过45℃、不超过50℃、不超过55℃、不超过60℃、不超过65℃、不超过70℃或不超过75℃。
[0134]
延长步骤可以在以下温度下发生：约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃或约75℃。
[0135]
延长步骤可以在以下温度下发生：20℃与75℃之间、20℃与70℃之间、20℃与65℃之间、20℃与60℃之间、20℃与55℃之间、20℃与50℃之间、20℃与45℃之间、20℃与40℃之间、20℃与35℃之间、20℃与30℃之间、20℃与25℃之间、25℃与75℃之间、25℃与70℃之间、25℃与65℃之间、25℃与60℃之间、25℃与55℃之间、25℃与50℃之间、25℃与45℃之间、25℃与40℃之间、25℃与35℃之间、25℃与30℃之间、30℃与75℃之间、30℃与70℃之间、30℃与65℃之间、30℃与60℃之间、30℃与55℃之间、30℃与50℃之间、30℃与45℃之间、30℃与40℃之间、30℃与35℃之间、35℃与75℃之间、35℃与70℃之间、35℃与65℃之间、35℃与60℃之间、35℃与55℃之间、35℃与50℃之间、35℃与45℃之间、35℃与40℃之间、40℃与75℃之间、40℃与70℃之间、40℃与65℃之间、40℃与60℃之间、40℃与55℃之间、40℃与50℃之间、40℃与45℃之间、45℃与75℃之间、45℃与70℃之间、45℃与65℃之间、45℃与60℃之间、45℃与55℃之间、45℃与50℃之间、50℃与75℃之间、50℃与70℃之间、50℃与65℃之间、50℃与60℃之间、50℃与55℃之间、55℃与75℃之间、55℃与70℃之间、55℃与65℃之间、55℃与60℃之间、60℃与75℃之间、60℃与70℃之间、60℃与65℃之间、65℃与75℃之间、65℃与70℃之间或70℃与75℃之间。
[0136]
延长步骤可以持续至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少2.5小时、至少3小时、至少3.5小时、至少4小时、至少4.5小时或至少5小时。
[0137]
延长步骤可以持续不超过1分钟、不超过5分钟、不超过15分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过1.5小时、不超过2小时、不超过2.5小时、不超过4小时、不超过3.5小时、不超过4小时、不超过4.5小时或不超过5小时。
[0138]
延长步骤可以持续约1分钟、约5分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时或约5小时。
[0139]
延伸步骤可以持续1分钟与5小时之间、1分钟与4.5小时之间、1分钟与4小时之间、1分钟与3.5小时之间、1分钟与3小时之间、1分钟与2.5小时之间、1分钟与2小时之间、1分钟与1.5小时之间、1分钟与1小时之间、1分钟与45分钟之间、1分钟与30分钟之间、1分钟与15分钟之间、1分钟与5分钟之间、5分钟与5小时之间、5分钟与4.5小时之间、5分钟与4小时之间、5分钟与3.5小时之间、5分钟与3小时之间、5分钟与2.5小时之间、5分钟与2小时之间、5
分钟与1.5小时之间、5分钟与1小时之间、5分钟与45分钟之间、5分钟与30分钟之间、5分钟与15分钟之间、15分钟与5小时之间、15分钟与4.5小时之间、15分钟与4小时之间、15分钟与3.5小时之间、15分钟与3小时之间、15分钟与2.5小时之间、15分钟与2小时之间、15分钟与1.5小时之间、15分钟与1小时之间、15分钟与45分钟之间、15分钟与30分钟之间、30分钟与5小时之间、30分钟与4.5小时之间、30分钟与4小时之间、30分钟与3.5小时之间、30分钟与3小时之间、30分钟与2.5小时之间、30分钟与2小时之间、30分钟与1.5小时之间、30分钟与1小时之间、30分钟与45分钟之间、45分钟与5小时之间、45分钟与4.5小时之间、45分钟与4小时之间、45分钟与3.5小时之间、45分钟与3小时之间、45分钟与2.5小时之间、45分钟与2小时之间、45分钟与1.5小时之间、45分钟与1小时之间、1小时与5小时之间、1小时与4.5小时之间、1小时与4小时之间、1小时与3.5小时之间、1小时与3小时之间、1小时与2.5小时之间、1小时与2小时之间、1小时与1.5小时之间、1.5小时与5小时之间、1.5小时与4.5小时之间、1.5小时与4小时之间、1.5小时与3.5小时之间、1.5小时与3小时之间、1.5小时与2.5小时之间、1.5小时与2小时之间、2小时与5小时之间、2小时与4.5小时之间、2小时与4小时之间、2小时与3.5小时之间、2小时与3小时之间、2小时与2.5小时之间、2.5小时与5小时之间、2.5小时与4.5小时之间、2.5小时与4小时之间、2.5小时与3.5小时之间、2.5小时与3小时之间、3小时与5小时之间、3小时与4.5小时之间、3小时与4小时之间、3小时与3.5小时之间、3.5小时与5小时之间、3.5小时与4.5小时之间、3.5小时与4小时之间、4小时与5小时之间、4小时与4.5小时之间或4.5小时与5小时之间。
[0140]
在一些情况下，rca可以产生扩增。在一些情况下，较高的扩增可以指示模板(即，环形核酸引物)被拷贝的次数较多。
[0141]
扩增可以被量化为可以与经过扩增的寡核苷酸结合以进行检测的标记探针的数量。例如，10x扩增可以包括可以导致10个标记探针与一个寡核苷酸结合以进行检测的扩增。在一些情况下，较高的扩增可以指示可以与经过扩增的寡核苷酸结合的标记探针的数量较多。数量较多的标记探针可以产生可以被检测到的更高的信号。
[0142]
在一些情况下，rca可以导致至少2x扩增、至少5x扩增、至少10x扩增、至少20x扩增、至少30x扩增、至少40x扩增、至少50x扩增、至少60x扩增、至少70x扩增、至少80x扩增、至少90x扩增、至少100x扩增、至少200x扩增、至少300x扩增、至少400x扩增、至少500x扩增、至少600x扩增、至少700x扩增、至少800x扩增、至少900x扩增、至少1000x扩增、至少5000x扩增或至少10000x扩增。
[0143]
在一些情况下，rca可以导致不超过2x扩增、不超过5x扩增、不超过10x扩增、不超过20x扩增、不超过30x扩增、不超过40x扩增、不超过50x扩增、不超过60x扩增、不超过70x扩增、不超过80x扩增、不超过90x扩增、不超过100x扩增、不超过200x扩增、不超过300x扩增、不超过400x扩增、不超过500x扩增、不超过600x扩增、不超过700x扩增、不超过800x扩增、不超过900x扩增、不超过1000x扩增、不超过5000x扩增或不超过10000x扩增。
[0144]
在一些情况下，rca可以导致扩增，其介于2x扩增与10000x扩增之间、2x扩增与5000x扩增之间、2x扩增与1000x扩增之间、2x扩增与500x扩增之间、2x扩增与100x扩增之间、2x扩增与50x扩增之间、2x扩增与10x扩增之间、10x扩增与10000x扩增之间、10x扩增与5000x扩增之间、10x扩增与1000x扩增之间、10x扩增与500x扩增之间、10x扩增与100x扩增之间、10x扩增与50x扩增之间、50x扩增与10000x扩增之间、50x扩增与5000x扩增之间、50x
扩增与1000x扩增之间、50x扩增与500x扩增之间、50x扩增与100x扩增之间、100x扩增与10000x扩增之间、100x扩增与5000x扩增之间、100x扩增与1000x扩增之间、100x扩增与500x扩增之间、500x扩增与10000x扩增之间、500x扩增与5000x扩增之间、500x扩增与1000x扩增之间、1000x扩增与10000x扩增之间、1000x扩增与5000x扩增之间或5000x扩增与10000x扩增之间。
[0145]
探针
[0146]
探针可以是用于检测所关注生物特征的分子。
[0147]
在将样品与捕获剂结合并实施rca反应之后，方法可以涉及使标记探针集合与样品接触。在一些情况下，如在标记的探针是标记的核酸探针的情况下，接触可以包括使探针与样品特异性杂交。在本文中，探针可以被可区分地标记，以产生标记的探针/寡核苷酸双链体。
[0148]
在一些情况下，可以应用至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个探针。在一些情况下，可以应用不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个探针。在一些情况下，可以应用1个与8个之间的探针、1个与7个之间的探针、1个与6个之间的探针、1个与5个之间的探针、1个与4个之间的探针、1个与3个之间的探针、1个与2个之间的探针、2个与8个之间的探针、2个与7个之间的探针、2个与6个之间的探针、2个与5个之间的探针、2个与4个之间的探针、2个与3个之间的探针、3个与8个之间的探针、3个与7个之间的探针、3个与6个之间的探针、3个与5个之间的探针、3个与4个之间的探针、4个与8个之间的探针、4个与7个之间的探针、4个与6个之间的探针、4个与5个之间的探针、5个与8个之间的探针、5个与7个之间的探针、5个与6个之间的探针、6个与8个之间的探针、6个与7个之间的探针或7个与8个之间的探针。
[0149]
在一些情况下，可以在应用标记的探针之前执行次级核酸扩增步骤，其包含但不限于杂交链反应、支链dna(bdna)扩增等。
[0150]
在一些实施例中，探针的计算熔融温度范围可以为15℃到70℃(例如，20℃
‑
60℃或35℃
‑
50℃)，使得杂交步骤的双链体具有同一范围内的tm。在这些实施例中，可以使用idt寡聚物分析程序(可在idt公司的网站中获得并描述于owczarzy等人,《核酸研究(nucleic acids res.)》2008 36:w163
‑
9)，例如通过使用50mm na+和250nm寡核苷酸的默认设置来计算t
m
。
[0151]
探针可以是t
m
匹配的，其中术语“t
m
匹配”可以指熔融温度在限定范围内的序列，例如，小于15℃、小于10℃或小于5℃的限定温度。显而易见的是，探针可以在5'末端、3'末端或其间的任何位置标记。在一些实施例中，探针可以是可特异性切割的。例如，探针可以含有可切割的接头(例如，光可切割或化学可切割接头)。
[0152]
经过探针扩增的寡核苷酸双链体的t
m
可以为约10℃、约15℃、约20℃、约25℃或约30℃。经过探针扩增的寡核苷酸双链体的t
m
可以为至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃或至少30℃。经过探针扩增的寡核苷酸双链体的t
m
可以为不超过10℃、不超过15℃、不超过20℃、不超过25℃或不超过30℃。经过探针扩增的寡核苷酸双链体的t
m
可以介于10℃与30℃之间、10℃与25℃之间、10℃与20℃之间、10℃与15℃之间、15℃与30℃之间、15℃与25℃之间、15℃与20℃之间、20℃与30℃之间、20℃与25℃之间或25℃与30℃之间。
[0153]
在一些情况下，可以在样品上温育探针以允许与样品的杂交。探针可以在以下温
度下温育：约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃或约55℃。
[0154]
探针可以在样品上温育持续至少10秒、至少15秒、至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟或至少15分钟。在一些情况下，洗涤可以持续不到10秒。
[0155]
探针可以在样品上温育持续最多10秒、最多15秒、最多30秒、最多1分钟、最多2分钟、最多3分钟、最多4分钟、最多5分钟、最多10分钟或最多15分钟。在一些情况下，洗涤可以持续15分钟以上。
[0156]
探针可以在样品上温育持续10秒与15分钟之间、10秒与10分钟之间、10秒与5分钟之间、10秒与1分钟之间、10秒与30秒之间、30秒与15分钟之间、30秒与10分钟之间、30秒与5分钟之间、30秒与1分钟之间、1分钟与15分钟之间、1分钟与10分钟之间、1分钟与5分钟之间、5分钟与15分钟之间、5分钟与10分钟之间或10分钟与15分钟之间。
[0157]
标记
[0158]
标记可以是与探针缀合或连接的可检测分子。如上所述，与单次迭代期间应用的探针连接的标记可以彼此区分，使得这些探针被可区分地标记。
[0159]
可区分地标记的探针可以包括可区分标记。可以基于激发波长、发射波长、强度或某些其它性质来区分这些标记。在一些实施例中，荧光标记的标记探针集合可以包括用一个或多个可区分荧光标记对标记的探针。
[0160]
可用于本方法的合适的可区分荧光标记对包含cy3和cy5(安玛西亚公司(amersham inc.)，新泽西州皮斯卡塔韦)、quasar 570和quasar 670(生物研究技术公司(biosearch technology)，加利福尼亚州诺瓦托)、alexafluor555和alexafluor647(分子探针公司(molecular probes)，俄勒冈州尤金)、bodipy v
‑
1002和bodipy v1005(分子探针公司，俄勒冈州尤金)、alexafluor 750、popo
‑
3和toto
‑
3(分子探针公司，俄勒冈州尤金)以及popro3和topro3(分子探针公司，俄勒冈州尤金)。另外的合适的可区分的可检测标记可以在以下中找到：kricka等人(《临床生物化学年鉴(ann clin biochem.)》39:114
‑
29,2002)；ried等人(《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.)1992:89:1388
‑
1392)；以及tanke等人(《欧洲人类遗传学杂志(eur.j.hum.genet.)》1999 7:2
‑
11)等。在一些实施例中，可以使用三种或四种可区分染料。具体所关注荧光染料包含：呫吨染料，例如，荧光素和罗丹明染料，如异硫氰酸荧光素(fitc)、6羧基荧光素(通常以缩写fam和f表示)、6羧基
‑
2',4',7',4,7
‑
六氯荧光素(hex)、6羧基4',5'二氯2',7'二甲氧基荧光素(joe或j)、n,n,n',n'四甲基6羧基罗丹明(tamra或t)、6羧基x罗丹明(rox或r)、5羧基罗丹明6g(r6g5或g5)、6羧基罗丹明6g(r6g6或g6)和罗丹明110；花青染料，例如，cy3、cy5和cy7染料；香豆素，例如，伞形酮；苯并酰亚胺染料，例如赫斯特(hoechst)33258；菲啶染料，例如德克萨斯红(texas red)；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，例如，bodipy染料和喹啉染料。在发明应用中常用的具体所关注荧光团包含：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、fam、荧光素氯三嗪、荧光素、r110、曙红、joe、r6g、四甲基罗丹明、tamra、丽丝胺、萘并荧光素、德克萨斯红、cy3和cy5等。如上所述，在探针的每个子集内，可以选择荧光团，使得其彼此可区分，即可独立地检测，这意味着即使当标记是混合的也可以独立地检测和测量标
记。换言之，即使当标记共同定位时(例如，在相同的管中或在切片的相同区域中)，每个标记存在的标记量(例如，荧光量)也可单独测定。
[0161]
标记可以是前荧光团、次级可激活荧光团、荧光蛋白、可见染剂、多色条形码、质量标签(例如，同位素或限定大小的聚合物)、用于无标记检测的结构标签、辐射敏感标签(由thz相机激活)、放射性标签或吸光度标签(例如仅吸收特定频率的光)。在一些实施例中，寡核苷酸可以递送酶、所述酶递送荧光团，或者可以存在信号的酶促扩增。在一些情况下，可以在一些情况下通过荧光共振能量转移(fret)、拉曼光谱(raman spectroscopy)、红外检测或磁/电检测来生成标记的可检测信号。
[0162]
在一些情况下，标记可以包括酶。在这种情况下，酶可以介导可检测物质在生物样品上沉积。在一些情况下，这种可检测物质的沉淀可以构成信号放大。例如，标记可以包括能够介导酪胺信号放大的辣根过氧化物酶或经工程化以具有类似于辣根过氧化物酶的性质的合成酶。例如，酶可以使用如过氧化氢等底物来介导氧化还原反应，以介导染料或标记(如染料或标记物缀合的导酪)到表面的沉淀以供检测。
[0163]
接头
[0164]
在本文的组合物中，不同的分子可以通过一个或多个接头连接。例如，捕获剂可以通过接头附着到寡核苷酸。作为另一个实例，探针可以通过接头附着到探针。
[0165]
接头可以包括直接键或原子，如氧或硫；单元，如nr1、c(o)、c(o)nh、so、so2、so2nh；或原子链，如经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的烯基、经取代的或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：o、s、s(o)、so2、n(r1)2、c(o)、可切割连接基团、经取代的或未经取代的芳基、经取代的或未经取代的杂芳基、经取代的或未经取代的杂环基；其中r1是氢、酰基、脂肪族的或经取代的脂肪族的。
[0166]
在一些情况下，接头可以是核酸接头。“核酸接头”可以是将化合物(例如，亲和分子)的两个部分与标记部分连接的核酸。核酸接头可以是单链的、完全双链的或部分双链的。核酸接头可以具有任何长度。例如，核酸接头的长度可以为1个核苷酸到约100个核苷酸。当核酸接头为双链时，接头可以包括约6个到约100个连续碱基对的双链区。然而，双链区可以被双链体的链中的一条或两条链中的一个或多个单链区中断。进一步地，双链核酸接头可以包括双链区的一端或两端的单链突出端。此外，核酸接头可以包括本文所述的一种或多种核酸修饰。核酸接头可以通过非核酸接头附着到化合物。
[0167]
在一些情况下，接头可以是“非核酸接头”，其可以是不是核酸接头的任何接头。
[0168]
接头可以共价或非共价地连接分子。因此，在一些实施例中，可以使用非核酸接头将捕获剂与寡核苷酸共价连接在一起。例如，可以通过选自由以下组成的组的接头将捕获剂与寡核苷酸共价连接在一起：键、琥珀酰亚胺基
‑4‑
(n
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
甲酸
酯(smcc)接头、磺基
‑
smcc接头、琥珀酰亚胺基
‑6‑
肼基
‑
烟酰胺(s
‑
hynic)接头、n
‑
琥珀酰亚胺基
‑4‑
甲酰基苯甲酰胺(s
‑
4fb)接头、双芳基腙键(来自s
‑
hynic/s
‑
4fb反应)、零长度肽键(直接位于亲和分子和核酸上的
‑
cooh与
‑
nh2之间)、间隔子上的两个肽键(来自两个
‑
nh2基团的交联)、三唑键(来自“点击”反应)、磷酸二酯键、硫代磷酸酯键和其任何组合。在另一个实例中，可以通过选自由以下组成的组的接头将探针与标记共价连接在一起：键、琥珀酰亚胺基
‑4‑
(n
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
甲酸酯(smcc)接头、磺基
‑
smcc接头、琥珀酰亚胺基
‑6‑
肼基
‑
烟酰胺(s
‑
hynic)接头、n
‑
琥珀酰亚胺基
‑4‑
甲酰基苯甲酰胺(s
‑
4fb)接头、双芳基腙键(来自s
‑
hynic/s
‑
4fb反应)、零长度肽键(直接位于亲和分子和核酸上的
‑
cooh与
‑
nh2之间)、间隔子上的两个肽键(来自两个
‑
nh2基团的交联)、三唑键(来自“点击”反应)、磷酸二酯键、硫代磷酸酯键和其任何组合。
[0169]
方法
[0170]
生物样品可以在本文所述的方法之前采购或者作为本文所述方法的一部分来制备。生物样品的非限制性实例可以包含组织、细胞或器官。
[0171]
在一些情况下，可以在应用捕获剂之前将蛋白质阻断剂应用于样品。
[0172]
捕获剂(或多种捕获剂)可以在样品上温育。捕获剂可以与寡核苷酸连接，使得每种捕获剂与不同的寡核苷酸连接，如本文所描述的。在一些情况下，一次可以将一种捕获剂与样品同时温育。在一些情况下，可以将2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种捕获剂与样品一起温育。在一些情况下，可以将所有捕获剂与样品同时温育。
[0173]
在一些情况下，捕获剂可以在以下温度下温育：约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃或约45℃。在一些情况下，捕获剂可以在以下温度下温育：至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃或至少45℃。在一些情况下，捕获剂可以在以下温度下温育：不超过4℃、不超过10℃、不超过15℃、不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃或不超过45℃。在一些情况下，捕获剂可以在以下温度下温育：4℃与45℃之间、4℃与40℃之间、4℃与35℃之间、4℃与30℃之间、4℃与25℃之间、4℃与20℃之间、4℃与15℃之间、4℃与10℃之间、10℃与45℃之间、10℃与40℃之间、10℃与35℃之间、10℃与30℃之间、10℃与25℃之间、10℃与20℃之间、10℃与15℃之间、15℃与45℃之间、15℃与40℃之间、15℃与35℃之间、15℃与30℃之间、15℃与25℃之间、15℃与20℃之间、20℃与45℃之间、20℃与40℃之间、20℃与35℃之间、20℃与30℃之间、20℃与25℃之间、25℃与45℃之间、25℃与40℃之间、25℃与35℃之间、25℃与30℃之间、30℃与45℃之间、30℃与40℃之间、30℃与35℃之间、35℃与45℃之间、35℃与40℃之间或40℃与45℃之间。
[0174]
捕获剂可以温育持续约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时或约6小时。在一些情况下，捕获剂可以温育持续至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时或至少6小时。在一些情况下，捕获剂可以温育持续不超过30分钟、不超过1小时、不超过2小时、不超过3小时、不超过4小时、不超过5小时或不超过6小时。在一些情况下，捕获剂可以温育持续30分钟与6小时之间、30分钟与5小时之间、30分钟与4小时之间、30分钟与3小时之间、30分钟与2小时之间、30分钟与1小时之间、1小时与6小时之间、1小时与5小时之间、1小时与4小时之间、1小时与3小时之间、1小时与2小时之间、2小时与6小时之间、2小时与5小时小时之间、介于2小时与4小时之间之间、2小时与3小时之间、3
小时与6小时之间、3小时与5小时之间、3小时与4小时之间、4小时与6小时之间、4小时与5小时之间或5小时与6小时之间。
[0175]
与捕获剂一起温育后，可以洗涤样品以去除过量的捕获剂。洗涤可以包括将缓冲液应用于样品持续一段时间，然后去除缓冲液。在一些情况下，洗涤可以包括轻轻搅动，如通过旋动、摇动、摆动或振动样品。洗涤可以包括对样品应用至少50μl、至少100μl、至少500μl、至少1ml、至少5ml、至少10ml、至少20ml、至少30ml、至少40ml或至少50ml缓冲液。洗涤可以包括对样品应用不超过50μl、不超过100μl、不超过500μl、不超过1ml、不超过5ml、不超过10ml、不超过20ml、不超过30ml、不超过40ml或不超过50ml缓冲液。在一些情况下，洗涤可以包括对样品应用以下量的缓冲液：50μl与50ml之间、50μl与40ml之间、50μl与30ml之间、50μl与20ml之间、50μl与10ml之间、50μl与5ml之间、50μl与1ml之间、50μl与500μl之间、50μl与100μl之间、100μl与50ml之间、100μl与40ml之间、100μl与30ml之间、100μl与20ml之间、100μl与10ml之间、100μl与5ml之间、100μl与1ml之间、100μl与500μl之间、500μl与50ml之间、500μl与40ml之间、500μl与30ml之间、500μl与20ml之间、500μl与10ml之间、500μl与5ml之间、500μl与1ml之间、1ml与50ml之间、1ml与40ml之间、1ml与30ml之间、1ml与20ml之间、1ml与10ml之间、1ml与5ml之间、5ml与50ml之间、5ml与40ml之间、5ml与30ml之间、5ml与20ml之间、5ml与10ml之间、10ml与50ml之间、10ml与40ml之间、10ml与30ml之间、10ml与20ml之间、20ml与50ml之间、20ml与40ml之间、20ml与30ml之间、30ml与50ml之间、30ml与40ml之间或40ml与50ml之间。洗涤缓冲液可以是任何可接受的缓冲液。在一些情况下，洗涤缓冲液可以是例如捕获剂所在的同一缓冲液，或者是另一种缓冲液，如pbs、pbs
‑
t、tbs或tbs
‑
t。洗涤步骤可以持续至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少10分钟或至少15分钟。洗涤步骤可以持续最多10秒、最多30秒、最多1分钟、最多2分钟、最多3分钟、最多4分钟、最多5分钟、最多10分钟或最多15分钟。洗涤步骤可以持续10秒与15分钟之间、10秒与10分钟之间、10秒与5分钟之间、10秒与30秒之间、30秒与15分钟之间、30秒与10分钟之间、30秒与5分钟之间、30秒与1分钟之间、1分钟与15分钟之间、1分钟与10分钟之间、1分钟与5分钟之间、5分钟与15分钟之间、5分钟与10分钟之间或1分钟与15分钟之间。洗涤步骤可以执行1次、2次、3次、4次、5次或更多次。
[0176]
捕获剂可以与样品交联。这种交联可以防止捕获剂在后续步骤期间解离。此交联步骤可以使用任何胺
‑
胺交联剂(例如甲醛、多聚甲醛、二琥珀酰基氨基丁酸酯、n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)或具有类似作用的另一种试剂)进行，但是如果需要，可以使用多种其它化学品使捕获剂与样品交联。
[0177]
在一些情况下，可以在应用环状核酸引物之前将核酸阻断剂应用于样品。在此步骤中可以使用任何可接受的核酸阻断剂，如鲑鱼精子dna或其它市售可得的产品。
[0178]
在一些情况下，核酸阻断剂可以在以下温度下温育：约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃或约45℃。在一些情况下，核酸阻断剂可以在以下温度下温育：至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃或至少45℃。在一些情况下，核酸阻断剂可以在以下温度下温育：不超过4℃、不超过10℃、不超过15℃、不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃或不超过45℃。在一些情况下，核酸阻断剂可以在以下温度下温育：4℃与45℃之间、4℃与40℃之间、4℃与35℃之间、4℃与30℃之间、4℃与25℃之间、4℃与20℃之间、4℃与15℃之间、4℃与10
℃之间、10℃与45℃之间、10℃与40℃之间、10℃与35℃之间、10℃与30℃之间、10℃与25℃之间、10℃与20℃之间、10℃与15℃之间、15℃与45℃之间、15℃与40℃之间、15℃与35℃之间、15℃与30℃之间、15℃与25℃之间、15℃与20℃之间、20℃与45℃之间、20℃与40℃之间、20℃与35℃之间、20℃与30℃之间、20℃与25℃之间、25℃与45℃之间、25℃与40℃之间、25℃与35℃之间、25℃与30℃之间、30℃与45℃之间、30℃与40℃之间、30℃与35℃之间、35℃与45℃之间、35℃与40℃之间或40℃与45℃之间。
[0179]
在一些情况下，阻断步骤可以持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些情况下，阻断步骤可以持续至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟。在一些情况下，阻断步骤可以持续不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过40分钟、不超过50分钟或不超过60分钟。在一些情况下，阻止步骤可以持续10分钟与60分钟之间、10分钟与50分钟之间、10分钟与40分钟之间、10分钟与30分钟之间、10分钟与20分钟之间、20分钟与60分钟之间、20分钟与50分钟之间、20分钟与40分钟之间、20分钟与30分钟之间、30分钟与60分钟之间、30分钟与50分钟之间、30分钟与40分钟之间、40分钟与60分钟之间、40分钟与50分钟之间或50分钟与60分钟之间。
[0180]
可以将环状核酸引物(例如，挂锁探针)应用于样品。环状核酸引物可以在样品上温育，使得环状核酸引物可以与寡核苷酸杂交。
[0181]
在一些情况下，环状核酸引物可以在以下温度下温育：约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃或大约45℃。在一些情况下，环状核酸引物可以在以下温度下温育：至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃或至少45℃。在一些情况下，环状核酸引物可以在以下温度下温育：不超过4℃、不超过10℃、不超过15℃、不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃或不超过45℃。在一些情况下，环状核酸引物可以在以下温度下温育：4℃与45℃之间、4℃与40℃之间、4℃与35℃之间、4℃与30℃之间、4℃与25℃之间、4℃与20℃之间、4℃与15℃之间、4℃与10℃之间、10℃与45℃之间、10℃与40℃之间、10℃与35℃之间、10℃与30℃之间、10℃与25℃之间、10℃与20℃之间、10℃与15℃之间、15℃与45℃之间、15℃与40℃之间、15℃与35℃之间、15℃与30℃之间、15℃与25℃之间、15℃与20℃之间、20℃与45℃之间、20℃与40℃之间、20℃与35℃之间、20℃与30℃之间、20℃与25℃之间、25℃与45℃之间、25℃与40℃之间、25℃与35℃之间、25℃与30℃之间、30℃与45℃之间、30℃与40℃之间、30℃与35℃之间、35℃与45℃之间、35℃与40℃之间或40℃与45℃之间。
[0182]
在一些情况下，环状核酸引物可以在样品上温育持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些情况下，环状核酸引物可以在样品上温育持续至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟。在一些情况下，环状核酸引物可以在样品上温育持续不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过40分钟、不超过50分钟或不超过60分钟。在一些情况下，环状核酸引物可以在样品上温育持续10分钟与60分钟之间、10分钟与50分钟之间、10分钟与40分钟之间、10分钟与30分钟之间、10分钟与20分钟之间、20分钟与60分钟之间、20分钟与50分钟之间、20分钟与40分钟之间、20分钟与30分钟之间、30分钟与60分钟之间、30分钟与50分钟之间、30分钟与40分钟之间、40分钟与60分钟之间、40分钟与50分钟之间或50分钟与60分钟之间。
[0183]
在一些情况下，在将环状核酸引物应用于样品并温育后可以洗涤样品，例如以去
除过量的引物。洗涤可以例如如上所述。
[0184]
在一些情况下，可以连结环状核酸探针。例如，在环状核酸探针在与寡核苷酸杂交之前是线性的情况下，可以在rca反应之前将其连结。可以在连结缓冲液中执行连结。可以应用连结酶(例如，t4 dna连结酶或其它dna或核苷酸连结酶)以促进连结。在一些情况下，连结可以与阻断步骤同时执行。在一些情况下，可以在将环状核酸引物在样品上温育进行杂交的同时执行连结。在一些情况下，连结、杂交和阻断可以同时执行。
[0185]
在一些情况下，连结酶可以在以下温度下温育：约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃或约45℃。在一些情况下，连结酶可以在以下温度下温育：至少4℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃或至少45℃。在一些情况下，连结酶可以在以下温度下温育：不超过4℃、不超过10℃、不超过15℃、不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃或不超过45℃。在一些情况下，连结酶可以在以下温度下温育：4℃与45℃之间、4℃与40℃之间、4℃与35℃之间、4℃与30℃之间、4℃与25℃之间、4℃与20℃之间、4℃与15℃之间、4℃与10℃之间、10℃与45℃之间、10℃与40℃之间、10℃与35℃之间、10℃与30℃之间、10℃与25℃之间、10℃与20℃之间、10℃与15℃之间、15℃与45℃之间、15℃与40℃之间、15℃与35℃之间、15℃与30℃之间、15℃与25℃之间、15℃与20℃之间、20℃与45℃之间、20℃与40℃之间、20℃与35℃之间、20℃与30℃之间、20℃与25℃之间、25℃与45℃之间、25℃与40℃之间、25℃与35℃之间、25℃与30℃之间、30℃与45℃之间、30℃与40℃之间、30℃与35℃之间、35℃与45℃之间、35℃与40℃之间或40℃与45℃之间。
[0186]
在一些情况下，连结酶可以在样品上温育持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些情况下，连结酶可以在样品上温育持续至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟。在一些情况下，连结酶可以在样品上温育持续不超过10分钟、不超过20分钟、不超过30分钟、不超过40分钟、不超过50分钟或不超过60分钟。在一些情况下，连结酶可以在样品上温育持续10分钟与60分钟之间、10分钟与50分钟之间、10分钟与40分钟之间、10分钟与30分钟之间、10分钟与20分钟之间、20分钟与60分钟之间、20分钟与50分钟之间、20分钟与40分钟之间、20分钟与30分钟之间、30分钟与60分钟之间、30分钟与50分钟之间、30分钟与40分钟之间、40分钟与60分钟之间、40分钟与50分钟之间或50分钟与60分钟之间。
[0187]
可以对环状核酸引物进行洗涤(例如，以去除过量的引物)。例如可以如上所述执行洗涤。
[0188]
可以使用环状核酸引物作为模板执行进行rca反应以延长寡核苷酸。rca反应可以包括将样品与用于rca的试剂一起温育。例如，可以将样品与bsa、聚合酶(例如，phi29聚合酶或另一种聚合酶)、dntp和适于所选聚合酶的缓冲液(例如，phi29聚合酶缓冲液，如果phi29是所选聚合酶)一起温育。
[0189]
可以在rca反应后洗涤样品(例如，以去除过量的试剂，如过量的聚合酶或过量的dntp)。例如可以如上所述执行洗涤。
[0190]
rca反应可以在约37℃下温育。在一些情况下，rca反应可以在以下温度下温育：约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃或约45℃。在一些情况下，rca反应可以在以下温度下温育：至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃或至少45℃。在一些情况下，rca
反应可以在以下温度下温育：不超过20℃、不超过25℃、不超过30℃、不超过35℃、不超过40℃或不超过45℃。在一些情况下，rca反应可以在以下温度下温育：20℃与45℃之间、20℃与40℃之间、20℃与35℃之间、20℃与30℃之间、20℃与25℃之间、25℃与45℃之间、25℃与40℃之间、25℃与35℃之间、25℃与30℃之间、30℃与45℃之间、30℃与40℃之间、30℃与35℃之间、35℃与45℃之间、35℃与40℃之间或40℃与45℃之间。
[0191]
标记的探针可以在dmso存在的情况下与经延长的寡核苷酸一起温育。dmso可以调节探针与经过扩增的寡核苷酸的杂交，并且在一些情况下，dmso可以具有使经延长的寡核苷酸松开或解开的效果，以帮助促进探针的结合。
[0192]
探针可以应用于样品。可以例如通过移液、擦拭、倾倒、滴入或以其它方式将含有探针的溶液引入样品中来执行样品的应用，使得探针有机会接触经延长的寡核苷酸。
[0193]
探针可以应用于溶液中的样品，例如本文所述的缓冲液中。可以以足以覆盖与具有经延长的寡核苷酸的捕获剂接触的样品区域的体积应用探针。在一些情况下，可以以足以覆盖整个样品的体积应用探针。在一些情况下，可以对样品应用以下量的探针：至少5μl、至少10μl、至少15μl、至少20μl、至少30μl、至少40μl、至少50μl、至少60μl、至少70μl、至少80μl、至少90μl、至少100μl、至少200μl、至少300μl、至少400μl或至少500μl。在一些情况下，可以对样品应用以下量的探针：不超过5μl、不超过10μl、不超过15μl、不超过20μl、不超过30μl、不超过40μl、不超过50μl、不超过60μl、不超过70μl、不超过80μl、不超过90μl、不超过100μl、不超过200μl、不超过300μl、不超过400μl、不超过500μl。在一些情况下，可以对样品应用以下量的探针：5μl与500μl之间、50μl与500μl之间、100μl与500μl之间、200μl与500μl之间、300μl与500μl之间、400μl与500μl之间、5μl与400μl之间、50μl与400μl之间、100μl与400μl之间、200μl与400μl之间、300μl与400μl之间、5μl与300μl之间、50μl与300μl之间、100μl与300μl之间、200μl与300μl之间、5μl与200μl之间、50μl与200μl之间、100μl与200μl之间、5μl与100μl之间、50μl与100μl之间或5μl与50μl之间。
[0194]
应用于样品的探针可以在溶液中，例如在缓冲液中。探针在溶液中的浓度可以为至少
[0195]
在将探针应用于样品使得其通过捕获剂和经延长的寡核苷酸与样品的所关注生物特征相关联之后，可以读取或检测探针，以鉴定和/或量化所关注生物特征。多个探针可以与每个所关注生物特征相关联，从而与其它方法相比放大信号。可以如下所述执行读取。
[0196]
读取
[0197]
可以读取样品以确定探针中的一种或多种探针的结合模式。在一些情况下，可以读取样品以确定探针中的每种探针的结合模式。探针的结合模式可以指示寡核苷酸和缀合的捕获剂的空间信息，进而可以指示所关注生物特征的空间信息。
[0198]
在已经洗涤样品去除任何未杂交的标记探针之后，方法可以包括读取样品以获得可以从中确定在先前步骤中杂交的探针的子集中的每个子集的结合模式的图像。此步骤可以使用任何方便的读取方法来完成，并且在一些实施例中，例如，可以使用配备有适用于每个荧光团的滤波器的荧光显微镜或通过使用双带通或三带通滤波器装置单独读取不同探针的杂交以观察多个荧光团(参见例如美国专利第5,776,688号)。
[0199]
在一些情况下，在同一迭代期间，可以在另一个所关注生物特征与标记相关联的同时读取与标记相关联的每个所关注生物特征。在同一迭代期间读取的标记可以不同。如
果两个标记在使用读取介质进行检测时可相互区分，则可以认为两个标记是不同的。例如，如果在使用显微镜成像时两个荧光分子的信号例如因激发波长、发射波长、强度或一些其它性质而彼此不同，则可以认为两个荧光分子是不同的。
[0200]
每个读取步骤可以生成样品图像，其显示探针的子集的结合模式。在一些实施例中，方法可以进一步包括分析、比较或重叠图像中的至少两个图像。在一些实施例中，方法可以进一步包括重叠所有图像，以产生显示所有捕获剂与样品的结合模式的图像。所使用的图像分析模块可以转换来自每个荧光团的信号以产生多个假彩色图像。图像分析模块可以重叠多个假彩色图像(例如，在每个像素处叠加假彩色)以获得复用假彩色图像。可以将多个图像(例如，未加权的或加权的)转换成单一假彩色，例如以表示以特定捕获剂的结合为特征的所关注生物特征。可以基于来自用户的手动输入将假彩色分配给特定捕获剂或捕获剂的组合。在某些方面，图像可以包括仅与所关注特征相关联的标记(例如在核隔室中)的强度有关的假彩色。图像分析模块可以被进一步配置成调整(例如，归一化)信号强度或假彩色的强度和/或对比度，以执行卷积运算(如强度或假彩色的模糊或锐化)，或执行任何其它合适的操作来增强图像。图像分析模块可以执行上述操作中的任何操作以排列从连续图像获得的像素和/或模糊或平滑化从连续图像获得的像素上的强度或假彩色。
[0201]
在一些实施例中，可以在z方向上以不同焦平面拍摄样品的图像。这些光学切片可以用于重建样品的三维图像。可以使用共聚焦显微镜术拍摄光学切片，但是其它方法是已知的。可以在计算机上实施图像分析方法。在某些实施例中，通用计算机可以被配置成用于本文公开的方法和程序的功能布置。这种计算机的硬件架构是本领域技术人员所熟知的，并且可以包括硬件组件，其包含一个或多个处理器(cpu)、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、内部或外部数据存储介质(例如，硬盘驱动)。计算机系统还可以包括用于处理并向显示装置输出图形信息的一个或多个图形板。上述组件可以通过计算机内部的总线适当地互连。计算机可以进一步包括用于与如监视器、键盘、鼠标、网络等通用外部组件通信的适当接口。在一些实施例中，计算机能够进行并行处理或可以是被配置用于并行或分布式计算的网络的一部分，以提高对本发明方法和程序的处理能力。在一些实施例中，从存储介质读取的程序代码可以写入到插入计算机中的扩充板或连接到计算机的扩充单元中提供的存储器中，并且扩充板或扩充单元中提供的cpu等实际上可以根据程序代码的指令执行部分或所有操作，以便完成以下描述的功能。在其它实施例中，可以使用云计算系统来执行方法。在这些实施例中，可以将数据文件和编程导出到云计算机，所述云计算机运行程序，并向用户返回输出。
[0202]
灭活和去除
[0203]
标记可以被灭活或去除。灭活或去除可以允许方法的多路复用，使得与没有灭活或去除步骤相比可以检测到更多的所关注生物特征。
[0204]
在读取样品后，方法可以包括灭活或去除与经过扩增的寡核苷酸相关(即，与其杂交)的标记，从而使多种捕获剂和其相关的经过扩增的寡核苷酸仍然与样品结合。与样品相关的标记可以通过多种方法去除或灭活，包含但不限于变性(在这种情况下标记和探针整体可以释放并且可以洗掉)，通过切割探针中的键(在这种情况下探针和部分探针可以释放并且可以洗掉)，通过切割探针和与探针杂交的经过扩增的寡核苷酸(以释放可以洗掉的片段)，通过切割探针与标记之间的键(在这种情况下标记可以被释放并且可以洗掉并且可以
洗掉)，通过如使用限制酶切割经过扩增的寡核苷酸(在这种情况下经过扩增的寡核苷酸和标记的探针可以洗掉)，或者通过使标记本身失活(例如，通过破坏标记中的键，从而阻止标记产生信号，或者通过向标记引入淬灭剂来阻止信号的检测)。在可接受的去除方法(如提供的去除方法)中，附着到其它抗体(例如，与尚未检测到的所关注生物特征结合的抗体)的未杂交的经过扩增的寡核苷酸是完整的，并且可以与在下一个循环中使用的标记探针的集合自由杂交。在一些实施例中，荧光可以通过基于光的漂白、基于过氧化物的漂白或通过可切割接头切割与核苷酸连接的荧光团(例如，使用tcep作为切割试剂)来灭活。
[0205]
在一些实施例中，去除步骤是通过变性从样品中去除杂交探针使其它捕获剂(即，未与探针杂交的捕获剂)和其相关的寡核苷酸仍然与样品结合来完成的。在其它实施例中，去除步骤不是通过变性从样品中去除杂交探针使其它捕获剂(即，未与探针杂交的捕获剂)和其相关的寡核苷酸仍然与样品结合来完成的。在这些实施例中，可以通过切割与样品相关的探针中的至少一个键或将探针连接至标记的接头来去除标记，从而使标记从探针释放。此切割可以通过酶促、化学或通过曝光来完成。可替代地，可以通过光漂白或通过化学改变标记来灭活标记。
[0206]
如果去除步骤不是通过变性从样品中去除杂交探针来完成的，则可以使用各种基于化学品的方法、酶催化方法或光切割方法。例如，在一些实施例中，探针可以含有化学键或光可切割键，使得其可以通过暴露于化学品或光而片段化。在一些实施例中，例如，可以用限制酶或双链dna特异性内切核酸酶(片段酶)切割双链体(因为其是双链的)。在一些实施例中，探针可以含有尿嘧啶(其可以被user切割)，或者可以含有包含错配的发夹，其可以使用错配特异性内切核酸酶切割。在这些实施例中的一些实施例中，在切割后，含有标记的探针片段的tm可能不够高而不能保持与寡核苷酸碱基配对，并且因此，片段可以与寡核苷酸解离。在一些实施例中，探针和标记可以通过光可切割或可化学切割的接头连接。此接头的切割可以使标记从样品释放。在其它实施例中，探针可以是rna，并且可以使用rna酶降解探针。在一些实施例中，可以使用酶促可切割键。例如，酯可以用酯酶切割，并且聚糖可以用糖酶切割。可替代地，可以通过修饰标记来灭活标记本身。在一个实例中，可以光漂白染料，但其它方法是已知的。
[0207]
在一些实施例中，在读取样品后，方法可以包括(e)通过变性(即，通过使标记的探针没有从寡核苷酸退火并将其洗掉)从样品中去除在步骤(c)中杂交的探针，从而使(b)的捕获剂和其相关寡核苷酸仍然与样品结合。此步骤可以通过以下来完成：使用任何合适的化学变性剂，例如甲酰胺、dmso、尿素或离液剂(例如，氯化胍等)；使用立足点释放策略(toehold release strategy)(参见，例如，kennedy
‑
darling,《化学生物化学(chembiochem.)》2014 15:2353
–
2356)；或使用加热、碱、拓扑异构酶或单链结合剂(例如，ssbp)。此步骤也可以通过具有更高亲和力的寡核苷酸(例如pna)的杂交来实现。在一些情况下，可以通过将样品在70％到90％甲酰胺(例如，75％到85％甲酰胺)中温育至少1分钟(例如，1到5分钟)的时间、随后洗涤来去除探针。如果需要，可以重复此变性步骤，以便去除所有杂交探针。显而易见的是，此步骤不是酶促实施的，即不使用如dna酶或限制酶等核酸酶，并且不会导致例如探针或寡核苷酸中的任一个中的任何共价键的裂解或从样品中去除捕获剂中的任一种。在此步骤中，探针/寡核苷酸双链体的链彼此分开(即，变性)，并且分离的探针(其现在在溶液中是游离的)被洗掉，使得捕获剂和其相关的寡核苷酸完整且处于适
当位置。
[0208]
如果使用可切割键(例如，在探针中或将探针连接到标记上，则可切割接头应该能够使用刺激(例如，光或其环境变化)被选择性地切割，而不会破坏附着到抗体的寡核苷酸中的键。在一些实施例中，可切割键可以是二硫键，其可以使用还原剂(例如，β
‑
巯基乙醇等)容易地破坏。可以采用的合适的可切割键包含但不限于以下：碱基可切割位点，如酯，特别是琥珀酸酯(可用例如氨或三甲胺切割)、季铵盐(可用例如二异丙胺切割)和氨基甲酸酯(可用氢氧化钠水溶液切割)；酸可切割位点，如苄醇衍生物(可使用三氟乙酸切割)、替考拉宁糖苷配基(可用三氟乙酸切割，随后用碱洗涤)、乙缩醛和硫缩醛(也可用三氟乙酸切割)、硫醚(可用例如hf或甲酚切割)和磺酰(可用三氟甲烷磺酸、三氟乙酸、茴香硫醚等切割)；亲核试剂可切割位点，如邻苯二甲酰胺(可用经取代的肼切割)、酯(可用例如三氯化铝切割)；和weinreb酰胺(可用氢化铝锂切割)；以及其它类型的化学可切割位点，包含硫代磷酸酯(可用银或汞离子切割)和二异丙基二烷氧基甲硅烷基(可用氟离子切割)。其它可切割键对于本领域技术人员而言是显而易见的，或者在相关文献和教科书中描述(例如，brown(1997)《当代有机合成(contemporary organic synthesis)》4(3)；216
‑
237)。在一些实施例中，可切割键可以被酶切割。
[0209]
在特定实施例中，可以采用光可切割(“pc”)接头(例如，uv可切割接头)。使用的合适的光可切割接头可以包含基于邻硝基苄基的接头、苯甲酰基接头、烷氧基苯偶姻接头、铬芳烃络合物接头、npssmpact接头和新戊二醇接头，如guillier等人(《化学评论(chem rev.)》2000年6月14日；100(6):2091
‑
158)描述的。可以在本发明方法中采用的示例性连接基团可以描述于guillier等人，同上和olejnik等人(《酶学方法(methods in enzymology.)》1998291:135
‑
154)，并进一步描述于u.s.p.n.6,027,890；olejnik等人(《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad sci)》,92:7590
‑
94)；ogata等人(《分析化学(anal.chem.)》2002 74:4702
‑
4708)；bai等人(《核酸研究(nucl.acids res.)》2004 32:535
‑
541)；zhao等人(《分析化学》2002 74:4259
‑
4268)；以及sanford等人(《材料化学(chem mater.)》1998 10:1510
‑
20)，并且可从ambergen公司(马萨诸塞州波士顿；nhs
‑
pc
‑
lc
‑
生物素)、连接技术公司(link technologies，苏格兰贝尔斯希尔)、飞世尔科技公司(fisher scientific，宾夕法尼亚州匹兹堡)和calbiochem
‑
novabiochem公司(加利福尼亚州拉荷亚)购买。
[0210]
迭代方法
[0211]
本文的方法可以包括重复的步骤。在一些情况下，这可以包括重复所述方法的步骤。与不重复这些步骤所实现的相比，这可以允许检测到更多所关注生物特征。
[0212]
在去除探针之后，样品可以与标记探针的不同集合杂交，所述标记探针可以与经过扩增的寡核苷酸的不同子集结合(例如，两个到四个标记探针的第二子集，其中探针是可区分标记的)，并且可以重新读取样品以产生示出最近杂交的探针子集中的每一个的结合模式的图像。通过这种方式，在读取样品的不同迭代中，可以检测到不同的所关注生物特征。在读取样品之后，可以例如通过变性或另一种方法(如上所述)从样品中去除探针，并且可以用可区分标记的探针的另一个不同集合重复杂交和读取步骤，所述可区分标记的探针可以与经过扩增的寡核苷酸的另一个不同子集结合。换言之，方法可以包括用两个到四个标记的核酸探针的不同子集多次重复杂交、标记去除或灭活和读取步骤，其中每个子集中
的探针是可区分标记的，并且在每次重复之后例如通过变性或另一种方法去除探针(除最后一次重复之外)以产生样品的多个图像，其中每个图像对应于标记的核酸探针的子集。可以重复杂交/读取/标记去除或灭活步骤，直到分析了所有所关注生物特征。
[0213]
可以选择所用的核苷酸序列以通过非特异性吸附或通过与内源基因组序列(rna或dna)的结合来最小化背景染色。同样，杂交和洗涤缓冲液可以被设计成通过非特异性吸附或通过与内源基因组序列(rna或dna)结合或通过与其它报告序列结合来最小化背景染色。
[0214]
除了上述标记方法之外，可以在执行上述方法之前或之后使用细胞学染色对样品进行染色。在这些实施例中，染剂可以是例如，鬼笔环肽(phalloidin)、钆双胺(gadodiamide)、吖啶橙、俾斯麦棕(bismarck brown)、钡、考马斯蓝(coomassie blue)、甲酚紫、结晶紫、dapi、苏木精、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、赫斯特染剂、碘、孔雀石绿、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇(正式名称：四氧化锇)、罗丹明、番红、磷钨酸、四氧化锇、四氧化钌、钼酸铵、碘化镉、碳酰肼、氯化铁、六胺、三氯化铟、硝酸镧、醋酸铅、柠檬酸铅、硝酸铅(ii)、高碘酸、磷钼酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银、氯金酸钠、硝酸铊、氨基硫脲、乙酸双氧铀、硝酸双氧铀、硫酸氧钒或其任何衍生物。染剂可能对任何所关注特征具有特异性，如蛋白质或蛋白质类、磷脂、dna(例如，dsdna、ssdna)、rna、细胞器(例如，细胞膜、线粒体、内质网、高尔基体、核包膜等)，或细胞的隔室(例如，细胞溶质、核成分等)。染剂可以增强细胞内或细胞外结构的对比度或成像。在一些实施例中，样品可以用苏木精和曙红(h&e)染色。
[0215]
试剂盒
[0216]
本公开还提供了含有用于实践如上所述的本发明方法的试剂的试剂盒。
[0217]
试剂盒可以包括两种或多种与寡核苷酸连接的捕获剂。试剂盒可以被构造成使得每种不同的捕获剂与不同的寡核苷酸连接。在一些情况下，捕获剂可以与寡核苷酸预连接。在一些情况下，捕获剂可以与寡核苷酸分开包装，例如，其中试剂盒包括用于使捕获剂与寡核苷酸连接的说明书。在一些情况下，试剂盒可以包括用于使捕获剂与寡核苷酸连接的一种或多种试剂。
[0218]
试剂盒可以包括环状核酸引物。试剂盒可以被构造成使得每个不同的寡核苷酸对应于不同的环状核酸引物。环状核酸引物可以被连接，或者被预环化。在一些情况下，环状核酸引物可以是线性的(例如，挂锁探针)。在这种情况下，试剂盒可以包括用于使核酸引物例如在与寡核苷酸结合之后环化的说明书。在一些这种情况下，试剂盒可以包括用于连结环状核酸引物的试剂，如连结酶、缓冲液或其它试剂。
[0219]
试剂盒可以包括用于将捕获剂与样品交联的试剂。在一些情况下，这种试剂盒可以包括多聚甲醛、甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、其组合或能够使捕获剂与样品交联的另一种化学品。在一些情况下，试剂可以预混合，例如作为交联缓冲液。在一些情况下，试剂可以是分开的，附有混合在一起(例如，以制备交联缓冲液)的说明书。在一些情况下，例如，如果试剂通常是可获得的，则试剂盒可能不提供试剂，但可以提供用于制备交联缓冲液并使用其使捕获剂与样品交联的说明。
[0220]
试剂盒可以包括用于进行滚环扩增反应的试剂。此类试剂可以是例如bsa、聚合酶(例如，phi29聚合酶或另一种聚合酶，如本文所述的那些聚合酶)、dntp和/或适用于聚合酶
的反应缓冲液。在一些情况下，试剂盒可以另外包括用于进行滚环扩增的说明书。
[0221]
试剂盒可以包括探针，每个探针包括标记。试剂盒可以被构造成使得每个不同的寡核苷酸可以对应于不同的探针。探针可以例如通过本文所述的接头与标记连接。在一些情况下，探针可以与标记预连接。在一些情况下，探针可以与标记分开包装，例如，其中试剂盒包括用于使标签与探针连接的说明书。
[0222]
试剂盒可以包括用于对结合了标记探针的样品成像的说明。在一些情况下，这种试剂盒可以包括允许成像方案的多路复用的说明书和/或试剂。例如，试剂盒可以包括用于以化学方式去除、灭活、淬灭、切割或去杂交探针或标记的说明书和/或试剂。
[0223]
除了以上提及的组分之外，试剂盒可以进一步包含用于使用试剂盒的组分实践本发明方法的说明，即用于样品分析的说明。用于实践本发明方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在如纸或塑料等基材上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒的容器或其组分的标签中(即与包装或分包装有关)等。在其它实施例中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，cd
‑
rom、软盘等)上的电子存储数据文件存在。在又其它实施例中，试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了用于例如通过因特网从远程源获得说明书的手段。此实施例的实例可以是包含网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
[0224]
计算机系统
[0225]
本公开提供了被编程为实施本公开的方法的计算机系统。图3示出了被编程或以其它方式配置成执行本文所述的方法的计算机系统301。计算机系统301可以例如被配置成控制以下的递送：1)包括多种与本文所述的捕获剂缀合的寡核苷酸的溶液；2)洗涤缓冲液；3)固定剂；4)环状核酸引物；以及5)用于对样品执行rca反应的试剂或这些组分的任何子集。计算机系统301可以调节本公开的方法的各个方面，例如，所递送的捕获剂的量、捕获剂温育的持续时间、洗涤的长度和时间、所递送的固定剂的量、固定剂温育的持续时间、所递送的环状核酸引物的量、环状核酸的杂交、pcr扩增方案(包含循环的时间、温度等)、所递送的探针的量、探针温育的持续时间和/或探针的检测(包含控制成像设备和/或软件)。计算机系统301可以是用户的电子装置或相对于电子装置远程定位的计算机系统。电子装置可以是移动电子装置。
[0226]
计算机系统301包含中央处理单元(cpu，在本文中也被称为“处理器”和“计算机处理器”)305，所述中央处理单元可以是单核或多核处理器或用于并行处理的多个处理器。计算机系统301还包含存储器或存储器位置310(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存存储器)、电子存储单元315(例如，硬盘)、用于与一个或多个其它系统通信的通信接口320(例如，网络适配器)以及外围装置325，如高速缓存、其它存储器、数据存储区和/或电子显示适配器。存储器310、存储单元315、接口320和外围装置325通过通信总线(实线)如母板与cpu 305通信。存储单元315可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统301可以借助于通信接口320可操作地耦接到计算机网络(“网络”)330。网络330可以是互联网、互联网和/或外联网、或与互联网通信的内联网和/或外联网。网络330在一些情况下是电信网络和/或数据网络。网络330可以包含可以实现如云计算等分布式计算的一个或多个计算机服务器。在一些情况下，网络330借助于计算机系统301可以实施对等网络，所述对等
网络可以实现将装置耦接到计算机系统301以充当客户端或服务器。
[0227]
cpu 305可以执行一系列机器可读指令，所述一系列机器可读指令可以体现在程序或软件中。指令可以存储在如存储器310的存储器位置中。指令可以涉及cpu 305，所述指令可以随后编程或以其它方式配置cpu 305以实现本公开的方法。由cpu 305执行的操作的实例可以包含取得、解码、执行和写回。
[0228]
cpu 305可以是电路，如集成电路的一部分。系统301的一个或多个其它组件可以包含在电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(asic)。
[0229]
存储单元315可以存储文件，如驱动程序、库和保存的程序。存储单元315可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。计算机系统301在一些情况下可以包含一个或多个另外的数据存储单元，所述一个或多个另外的数据存储单元位于计算机系统301外部，如定位在通过内联网或互联网与计算机系统301通信的远程服务器上。
[0230]
计算机系统301可以通过网络330与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统301可以与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包含个人计算机(例如，便携式pc)、平板或平板pc(例如，ipad、galaxy tab)、电话、智能电话(例如，iphone、安卓使能的装置、)或个人数字助理。用户可以通过网络330访问计算机系统301。
[0231]
可以通过存储在计算机系统301的电子存储位置上(例如存储器310或电子存储单元315上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码实施如本文所描述的方法。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器305执行。在一些情况下，代码可以从存储单元315检索并且存储在存储器310上以供处理器305随时访问。在某些情形下，可以排除电子存储单元315，并且机器可执行指令存储在存储器310上。
[0232]
代码可以被预先编译和配置成用于与具有被适配成执行所述代码的处理器的机器一起使用，或可以在运行期间进行编译。代码可以以编程语言供应，可以选择所述编程语言以实现以预先编译或类编译(as
‑
compiled)的方式执行代码。
[0233]
本文提供的系统和方法的各方面(如服务器301)可以体现在编程中。技术的各个方面可以被视为通常呈机器(或处理器)可执行代码和/或相关联的数据形式的“产品”或“制品”，所述机器可执行代码和/或相关联的数据在一种类型的机器可读介质上执行或在所述一种类型的机器可读介质中实施。机器可执行代码可以存储在电子存储单元，如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存存储器)或硬盘上。“存储区”类型介质可以包含计算机、处理器等的任何或全部有形存储器或其相关联的模块，如可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储的各种半导体存储器、磁带驱动、硬盘驱动等。软件的全部或部分有时可以通过互联网或各种其它电信网络通信。此类通信例如可以实现将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器中，例如从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元素的另一种类型的介质包含如通过有线和光学陆地线网络以及在各个空中链路之上跨本地装置之间的物理接口使用的光波、电波和电磁波。承载此类波的物理元素，如有线或无线链路、光学链路等还可以被视为承载软件的介质。如本文所使用的，除非限制为非暂时性、有形“存储”介质，否则如计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
[0234]
因此，机器可读介质(如计算机可执行代码)可以采取许多形式，包含但不限于有
形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包含例如光盘或磁盘，如一个或多个任何计算机中的存储装置中的任何存储装置等，如可以用于实施附图中示出的数据库等。易失性存储介质包含动态存储器，如此计算机平台的主存储器。有形的传输介质包含同轴电缆；铜线和光纤，其包含包括计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号的形式，或声波或光波的形式，如在射频(rf)和红外(ir)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包含例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其它磁性介质、cd
‑
rom、dvd或dvd
‑
rom、任何其它光学介质、穿孔卡、纸带、任何其它带有孔图案的物理存储介质、ram、rom、prom和eprom、闪存
‑
eprom、任何其它存储器芯片或存储器盒、传输数据或指令的载波、传输这种载波的电缆或链路或计算机可以从其读取编程代码和/或数据的任何其它介质。计算机可读介质中的这些形式的许多形式可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列承载到处理器以供执行。
[0235]
计算机系统301可以包含电子显示器1135或与所述电子显示器通信，所述电子显示器包括用户界面(ui)340，所述用户界面用于提供例如用于执行本文所述的方法的指令、用户对方法的各个步骤的控制或对所收集图像的分析。ui的实例包含但不限于图形用户界面(gui)和基于web的用户界面。
[0236]
本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法来实施。算法在由中央处理单元305执行时可以通过软件来实施。算法可以例如控制本文所述的方法、创建寡核苷酸/环状核酸引物/探针集合或分析所收集的图像和/或数据。
[0237]
实例
[0238]
实例1：在新鲜冷冻组织上扩增
[0239]
将人新鲜冷冻扁桃体组织应用到载玻片上，并用丙酮固定。将组织水合并用缓冲液a(10mm tris和5、10mm mgcl2、150mm nacl、0.1％triton
×
100)洗涤。然后将组织样品用1.6％多聚甲醛固定，并再次用缓冲液a洗涤。将组织与抗体在缓冲液a中一起温育持续3小时xx分钟，所述抗体与包括条形码的寡核苷酸连接，所述条形码表示为cd45
‑
bx001(特定于cd45)、cd4
‑
bx002(特定于cd4)和cd2
‑
bx021(特定于cd2)。每个寡核苷酸包括如表1中所呈现的条形码序列：
[0240]
表1：条形码序列
[0241]
条形码id条形码序列seq.id.bx0015'
‑
ctgatggtttaggactac
‑
3'1bx0025'
‑
gattggtccactaacgta
‑
3'2bx0215'
‑
ctattatcatgaggagcg
‑
3'3
[0242]
然后将样品用缓冲液a洗涤xx次，每次xx分钟以去除过量的抗体，并且将抗体用1.6％冷低聚甲醛、冷甲醇和bs3固定到样品上。载玻片保持在4℃下直至扩增步骤。
[0243]
接下来，使寡核苷酸与用作环状核酸探针的挂锁探针接触。挂锁探针序列在表2中给出：
[0244]
表2：挂锁探针序列
[0245][0246]
挂锁探针的5'末端的氨基酸被设计成与条形码序列的一部分的反向补体互补，而挂锁探针的3'末端的氨基酸被设计成与条码序列的3'末端的一部分的补体互补。通过这种方式，当挂锁探针与条形码序列接触时，发生碱基对结合，使得挂锁探针以环形方式与条形码序列结合。
[0247]
将挂锁探针在连结缓冲液中在样品上温育，使得与寡核苷酸结合的挂锁探针连结成环状。连结缓冲液另外包括t4 dna连结酶(连结酶)和鲑鱼精子dna(用于阻断)。连结缓冲液的配方可以在表3找到。
[0248]
表3：连结缓冲液
[0249]
成分量t4 dna连结缓冲液1x挂锁探针250nmt4 dna连结酶0.05u/μlssc缓冲液1x鲑鱼精子dna300ng/ml
[0250]
然后将样品在pbs中洗涤以去除dna连结酶、探针和鲑鱼精子dna。
[0251]
然后进行rca反应以扩增寡核苷酸。将条形码与phi29聚合酶在扩增缓冲液中于37℃下温育1小时。扩增缓冲液的配方可以在表4中找到。
[0252]
表4：扩增缓冲液
[0253]
成分量bsa1mg/mlphi29聚合酶1u/μldntp250μmphi29聚合酶缓冲液1x
[0254]
将样品洗涤并在20％dmso中温育10分钟，并且然后与标记的探针一起温育5分钟。然后将样品用20％dmso洗涤，随后用1xac1洗涤，并使用荧光显微镜成像。表5提供了特异于所使用条形码的标记探针的序列。
[0255]
表5：标记探针序列
[0256][0257]
图4提供了所探查的人新鲜冷冻扁桃体组织的获得的图像。分图a示出了cd45
‑
bx001(暴露时间为50毫秒)和cd4
‑
bx021(暴露时间为20毫秒)。分图b示出了分图a的放大部分。分图c示出了cd2
‑
bx002(暴露时间为20毫秒)。分图d示出了分图c的放大部分。
[0258]
实例2：寡核苷酸设计
[0259]
使用管线创建用于寡核苷酸的滚环扩增的挂锁探针。
[0260]
产生随机的42聚体寡核苷酸，并针对gc含量(36％≤gc％≤55％)、t
m
(66
°
℃≤t
m
≤72
°
℃)、四聚体和均聚物进行过滤。python和biopython用于42聚体生成和过滤。
[0261]
使用perl生成条形码的5聚体、6聚体、7聚体和8聚体寡核苷酸计数表。使用kmer过滤掉具有高计数的序列。
[0262]
使用ncbi
‑
blast软件将条形码与42聚体寡核苷酸进行比对，并将42聚体寡核苷酸与人类基因组、人类转录物、人类rdna、小鼠基因组、小鼠转录物和小鼠rdna进行比对。
[0263]
此时，有96个正在使用的条形码。根据其热力学中点对这96个条形码进行拆分，以使用python创建“粘性末端”序列。表6示出了使用此方法生成的序列。
[0264]
表6：设计的寡核苷酸
[0265][0266]
实例3：ffpe组织上的滚环扩增
[0267]
在载玻片上准备人ffpe扁桃体组织并脱蜡，并在tris/edta缓冲液中进行标准抗原提取方案以准备染色。
[0268]
然后将样品与针对cd31(标记为cx001)和cd3(标记为cx002)的抗体一起温育，其中所述抗体与寡核苷酸连接。在37℃下将样品/抗体/寡核苷酸复合物与对应于寡核苷酸的挂锁探针一起温育2小时。此步骤的连结缓冲液与表3中所述的相同。
[0269]
在37℃下将cx001和cx002与对应的挂锁探针一起温育30分钟以进行连结。挂锁探针被设计成使得在滚环扩增步骤之后，标记的探针与挂锁探针结合相同的序列。
[0270]
然后将与挂锁探针连结的抗体在组织上温育2小时。此步骤的缓冲液与表2中所述的缓冲液相同。
[0271]
用pbs洗涤组织样品，并执行滚环扩增，在37℃下与phi29聚合酶在扩增缓冲液一起温育1小时。扩增缓冲液的配方可以在表4中找到。
[0272]
将组织样品在pbs中洗涤并与1.6％多聚甲醛、冷meoh和bs3一起温育以使抗体与组织交联，随后在pbs中再次洗涤。在4℃下储存组织样品直到成像。
[0273]
洗涤组织样品，并在20％dmso中温育10分钟。然后，将组织样品与标记的探针一起温育5分钟，随后用20％dmso洗涤、用1xac1洗涤并使用荧光显微镜成像。用于杂交的报告子是alexafluor
‑
750
‑
rx001、atto550
‑
rx002。
[0274]
使用透明组织方案将标记的探针去杂交以进行去除，并且再次使用荧光显微镜对组织样品成像以验证标记探针的去除。
[0275]
图5示出了用与来自此实验的寡核苷酸连接的抗体染色的人ffpe扁桃体组织的图像。分图a和b示出了cd31
‑
cx001(暴露时间为50毫秒)和cd3
‑
cx002(暴露时间为20毫秒)和。分图c描绘了通过去杂交去除标记的探针后的组织样品。分图d和e分别表示分图a和b的放大区域。
[0276]
实例4：基于rca的扩增策略
[0277]
对于所使用的所有三个荧光通道(fam、cy3和cy5)，可以在基于rca的策略中采用寡核苷酸标记的抗体(例如，codex抗体)，所述基于rca的策略相对于标准codex技术将抗体信号放大20x，如通过染料标记的寡核苷酸杂交所测量的。
[0278]
使用phi29聚合酶的cdna等温扩增可以是创建重复寡核苷酸序列的拷贝的高效方法。重复序列可以通过为每个抗体缀合位点的codex标记的染料创建多个结合位点来增加与每个codex标记的抗体相关的信号。可以使用标准codex工作流程用例如抗人cd3(克隆：ucht1)、抗人cd19(克隆：hib19)和抗人cd31(克隆：wm59)等抗体对新鲜冷冻扁桃体组织进行染色。可以使用keyence bz
‑
x700倒置显微镜来观察抗体染色。在一些情况下，定量可以使用imagej来评估，并且可以涉及基于分段的算法的使用。可以使用可以从分段分析中生成的集成信号强度值将来自非扩增杂交实验(即当前的codex工作流程)的染色数据与从基于rca的样品中生成的数据进行比较。
[0279]
用于codex检测的rca条件的优化：当前的(非rca)codex工作流程可以包括：1)抗体缀合和面板开发，2)用codex标记的抗体进行组织染色，以及3)codex图像采集和流体循环。当在抗体染色和组织固定之后以及在codex数据采集之前执行时，抗体缀合dna序列的扩增可以是高效的并且具有最小的实验复杂性。在此步骤中，所有结合的codex标记的抗体可以通过多聚甲醛和基于nhs
‑
酯的交联中的一个或两个粘附到组织样本。因此，可以在组
织表面而不是在溶液中执行样品操纵以执行rca步骤。
[0280]
与rca方法相关的参数空间可以包含：cdna和引物热力学性质、聚合酶:底物比率、核苷酸浓度、缓冲液组合物、盐浓度以及温育时间和温度。首先，可以在优化寡核苷酸序列空间的同时，模拟与先前用于扩增与抗体部分缀合的dna的酶和缓冲液条件相关的条件。cdna结构可以有三个成分：1)抗体缀合寡核苷酸(a)的结合位点(a')，2)codex标记的染料(b)的结合位点(b')和3)这两个结合位点之间的序列。仔细研究了codex标记的染料结合区域的寡核苷酸性质以开发现有的codex平台。对于这些序列，重要的是要具有足够的长度和相关的热力学性质，以确保使用优化的codex杂交缓冲液在室温下结合并在存在codex去除缓冲液的情况下完全去除。这些序列中的一组序列可以用作序列b和b'，用于设计用于筛选目的的rca相容性寡核苷酸。对于序列a和a'的设计，可以筛选具有相应不同的热力学性质的不同序列长度。这些dna组分的最佳序列性质应当导致高效的和特异性连结以及使用phi29聚合酶的有效扩增。太短的序列与相关的codex抗体标签的结合可能是无效或短暂，并且因此可能导致信号增强较低或无信号增强。
[0281]
可以基于前述条件进行连结。通过凝胶电泳测得的可再现的连结效率大于90％就可以被认为是成功的。可以对使用以上列出的三个抗体克隆的基于rca的codex筛选实验的结果进行量化，并与从标准codex工作流程中获得的结果进行比较。可以使用等效的暴露时间和其它相关的显微镜设置直接比较信号灵敏度。可以对与缓冲液组合物、酶:底物比率和温育时间有关的各种条件进行筛选，以确定信号强度的最佳增强。信号强度可以至少增加20x。用针对低水平标志物的抗体筛选优化的条件：用于开发rca相容性codex条件的三个抗体克隆靶向人扁桃体组织内的大量细胞表面标志物。这些抗体作为阳性对照很好地发挥作用以确保方法有效。这种信号增强的实用程序可以用于测量不太多的标志物。为此，可以将这些优化的条件应用于检测以前使用标准codex技术难以实现的各种标志物。这些标志物包含：gata
‑
3、t
‑
bet、cd25、pstat1和rorγt。这些标志物中的每个标志物的纯化抗体可以与rca相容性codex序列缀合，并且可以用于对新鲜冷冻人扁桃体、淋巴结和黑色素瘤组织进行染色。这些抗体中的一些抗体可能仍然不能揭示相关的标志物染色。这可能是由于多种原因造成的，包含测试组织内表达的缺乏、抗体缀合导致的抗原结合丧失、丙酮对组织的作用导致的抗原结合丧失(codex染色方案的一部分)或有效信号增强的缺乏。可以使用标准if工作流程执行使用相同克隆和组织样品的对照实验，由聚合物增强的二次抗体进行检测，作为消除这些解释中的一些解释的手段。如果codex可检测到五个标志物中的三个标志物且相关信噪比至少为5，则可以认为这些实验是成功的。
[0282]
实例5：rca增强方法的验证
[0283]
可以使用标记的抗体和相关的寡核苷酸试剂执行多路复用的rca增强方法(例如，codex)，以证明使用添加和去除染料标签的迭代循环开发整个组(例如，40+个标志物)的可行性。相对于标准平台，每个抗体通道可以扩增20x，并且样品之间的信号可以没有重叠，如通过荧光信号和相关标志物的已知染色模式测得的。
[0284]
codex技术基于序列正交探针文库，并控制互补染料标记标签的添加和去除，以揭示每个循环一大组标记抗体的子集。每个探针对可能不会干扰其它序列的信号，并且不会结合内源性dna或rna组分。另外，codex探针对文库可以具有类似的热力学性质，使得可以用同一组缓冲液完成互补染料标签的结合和去除。为了用rca对codex标记的抗体文库实施
codex信号增强，可以存在三个标准中的一个或多个：1)序列正交寡核苷酸集合的设计；2)促进和解离杂交对的高效和可再现条件的优化；以及3)与不能经受扩增过程的抗体结合的寡核苷酸的保护。本公开描述了对通常介于30
‑
40个标志物之间的标准codex抗体组使用rca增强。这可以通过在较小组上(例如，六个标志物)开发满足上述标准中的每个标准的条件来完成。在此资助申请的第ii阶段部分，可以进行更大规模的开发工作以建立rca codex相容性探针集合的完整文库。
[0285]
每个rca寡核苷酸集合可以包括两个区域：抗体寡核苷酸标签的结合区域(a和a')和codex标记的染料的结合区域(b和b')。后面这些序列(b和b')所需的性质应与codex平台的当前实施方案中使用的性质相同。可以确定a和a'的最佳序列长度和对应的熔融温度。可以基于a和b(以及扩展的a'和b')的热力学性质要求使用公开可用的随机dna序列生成器(https://www.random.org/sequences/)设计十组rca相容性codex序列)。可以使用ncbi primerblast(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer
‑
blast/)筛选不同的rca相容性codex标签集合之间的序列重叠以及与内源性人rna和dna组分的重叠。所得的探针集合组可以用于生成六个标志物的抗体组，除了来自先前特定目标的三种经验证的低水平标志物之外，所述抗体组由靶向在筛选和优化实验中使用的大量标志物的三种抗体(cd3、cd19和cd31)构成。每种codex标记的抗体可以单独筛选，以优化抗体染色条件和相关的暴露时间。可以用这六个标志物进行两个循环的rca增强codex实验，揭示了其中一半在第一循环中使用三个标准荧光通道(fam、cy3和cy5)并且一半在第二循环中使用相同的荧光染料。可以测试基于codex平台的当前实施方案的标准杂交和探针去除条件，以确定是否可以有效去除codex标记的染料。这可以通过在codex
‑
标签染料杂交之后和去除之后对染色模式进行成像来测量。可以将测量到阳性染色的荧光信号完全去除，并等同于成功去除背景信号。与在不存在扩增的情况下使用的短寡核苷酸序列相比，可以优化这些条件以适应rca之后dna结构的差异。如果必要，可以筛选各种参数以优化结合的codex标记的染料的去除，所述参数包含：dmso浓度、盐浓度和组合物以及去除缓冲液的温育时间。可以改变b和b'的热力学性质，以促进有效的codex标签染料去除。如果改变缓冲液组合物不能导致有效的codex标签染料去除，则可以进行测试。可以针对每种抗体达到的染色模式和信号来衡量成功，其中在codex实验期间获得的信号在这些值的10％偏差内可以被认为是可接受的。
[0286]
对于rca增强的codex实验的一些实施方案，放大一些抗体信号可能是有用的，但对其它信号可能不是有用的。当同时测量丰度和/或抗体结合效率水平差异很大的标志物时可能就是这种情况。在这些情况下，可能不需要放大极高水平标志物的信号，而是可能需要增加极低水平标志物的信号。phi29聚合酶具有5'
‑
*3'聚合活性和3'
‑
*5'核酸外切酶活性两者。为了将rca步骤并入到codex工作流程中，可能有必要确保与不用于扩增的抗体部分结合的寡核苷酸免受这种潜在的核酸外切酶降解的影响。用于标记抗体的序列可以在3'末端处或附近用已知抑制这种核酸酶活性的共价基团进行修饰，其包含硫代磷酸键、2'
‑
o
‑
甲基
‑
、反向dt、磷酸化和peg间隔子25。可以使用标准codex染色实验来测量外切核酸酶活性，其中与组织结合抗体结合的寡核苷酸理论上在添加phi29聚合酶时将被降解。可以基于防止寡核苷酸降解和合成成本考虑来选择最佳修饰。可以将这些优化的序列并入上述相同的两个循环的codex实验中，其中cd3、cd19和cd31含有修饰以防止phi29聚合酶降解。可以将这些标志物的荧光强度与在不存在phi29的情况下染色的样品进行比较，并且这些值的
偏差在10％以内的信号强度可以验证rca过程期间的序列保真度。
[0287]
信号增强策略扩展到codex平台，用于完整的抗体组和各种标志物类型的测量。作为这项工作的一部分，可以设计和验证多于50个rca相容性codex序列的文库。相应地，可以筛选使用现有codex平台针对当前低于信号阈值的转录因子、细胞信号传导蛋白质和其它潜在的低水平标志物的多个抗体克隆，以用于rca增强的codex方法。另外，可以开发增强的软件分析工具，以实现从跨各种标志物类型的codex数据中提取有意义的生物数据。最后，用于rca增强的codex的试剂和相关分析软件可以部署在两个测试位点以供与潜在客户和现有客户集成使用，以确认集成系统的实用性并为这些部件的生产和制造提供反馈。
[0288]
实例6：寡核苷酸序列文库的设计和筛选
[0289]
可以设计并筛选rca增强的codex相容性寡核苷酸序列的文库，以用于高度多路复用的测定(例如，大于50个参数)。每个寡核苷酸集合可以是正交的序列，并具有类似的扩增性质。在一些情况下，相对于标准codex平台，序列可能导致至少20x的信号增强。可以筛选针对细胞内靶标的抗体以与此平台相容。在一些情况下，这种设计可能产生至少20个经验证的克隆。
[0290]
首先，可以生成rca增强的codex寡核苷酸文库。本公开提供了具有相关rca寡核苷酸组分的预缀合codex标记的抗体，因此用户可以选择现成的抗体组。例如，可以使用50个或更多个启用相容性rca的codex探针集合的文库。另外，可以以缀合试剂盒的形式提供序列，使得用户可以创建自己的rca增强的codex抗体组，用于更多定制应用。50个相容性寡核苷酸对集合的文库大小可以足够大以启用两种途径并产生各种预缀合的codex抗体产物。
[0291]
在说明性实施例中，rca增强的codex寡核苷酸文库的性质可以如下：1)结合的寡核苷酸抗体(a)和检测序列(b)含有正交的序列，使得通道之间没有信号重叠；2)这些序列中的每个序列的热力学性质可以是类似的，使得连结和聚合对于每个集合都是高效且可重现的，并且染料探针的杂交和去除是在相同的缓冲条件下完成的；3)每个寡核苷酸集合(包含检测和扩增序列)不与跨相关物种(包含人和小鼠)的内源性dna和rna组分结合。少数这些寡核苷酸集合的设计和生成可以手动完成；但是，为了生成此大小的文库，可以开发定制软件包，所述定制软件包可以针对这些标准在计算机中进行筛选并创建一组适合于进一步筛选的输出序列。算法或软件包可以生成具有必要热力学性质的候选寡核苷酸序列、筛选这些序列在候选群体内以及针对小鼠和人类转录组和基因组的重叠，并且可以消除具有已知荧光干扰的codex标记的染料序列。可以合成所得的候选序列，并在rca增强的codex实验中筛选有效活性。
[0292]
候选寡核苷酸集合的筛选和验证过程可以涉及多个步骤。首先，可以针对每个集合单独测量连结效率和聚合速率。为此，每个寡核苷酸集合可以与抗人cd3抗体(克隆：ucht1)缀合，并用于对人新鲜冷冻扁桃体组织进行染色。可以基于凝胶电泳确定连结效率，同时可以相对于标准codex实验测量聚合速率，所述标准codex实验可以与非扩增序列直接杂交。连结效率大于90％或聚合速率导致至少20倍的信号增强可以被认为是成功的。接下来，可以针对与扩增序列、检测序列或两者相关的信号重叠来筛选序列。抗小鼠cd45抗体样品可以与来自每个寡核苷酸集合的对应组分缀合，并用于对可以从野生型小鼠中分离的脾细胞样品进行染色。可以将每个样品组合并分散在盖玻片上以进行进一步处理。可以例如通过使用codex仪器通过杂交进行连结、扩增和检测。每个样品可以迭代添加和去除相关的
codex标记的染料。显示信号重叠的序列可以归因于扩增序列、检测序列或两者。信号重叠可能是有问题的，并且可以被消除。基于此分析，可以从候选文库中去除最小的重叠序列集合。最后，可以针对潜在的序列重叠对剩余序列进行筛选，所述潜在的序列重叠可能是由抗体染色步骤期间的关联造成的，其中所有抗体可以在一个步骤中染色。每种抗体可以与独特的、先前验证的抗体克隆缀合，并且可以用于对多个测试组织进行染色，包含人扁桃体、淋巴结和黑色素瘤。可以基于将每个抗体克隆独立染色时显示的已知染色模式与可以由rca增强的codex实验产生的染色的比较确定序列重叠。
[0293]
可以生成至少50个rca增强的codex相容性寡核苷酸集合的文库。对于较小的文库，包含明显少于50个寡核苷酸集合的文库，可以对新设计的序列集合进行类似的工作。可以评估由于这些筛选工作中的每一项而导致失败的寡核苷酸的特性，并且可以根据需要更新初始的寡核苷酸设计算法，以防止序列生成的其它循环中出现类似的失败。
[0294]
可以针对rca增强的codex平台验证抗体克隆。可能是抗小鼠和抗人抗体克隆的超过200种抗体可以通过codex技术验证在新鲜冷冻组织上的用途，并且在一些情况下，大多数靶向大量的细胞表面标志物。rca增强的codex可以提供提高的灵敏度，并且这种提高的灵敏度可以能够检测各种不同的标志物类型。为此，可以筛选和验证靶向较低表达标志物的抗体克隆。在一些情况下，可以筛选和验证靶向较低表达标志物的30
‑
40个另外的抗体克隆。在一些情况下，在存在直接染料缀合的复染剂的情况下，标准抗体筛选过程可以涉及用候选codex标记的抗体对各种测试组织进行染色。可以将所得的信号模式与复染剂的预期染色模式以及公开可用的数据库(例如www.proteinatlas.org/tissue)进行比较。在这些筛选实验期间未能看到抗体信号的原因可以包含由于缀合而引起的抗体信号丢失、测试组织中的表达不足或两者。
[0295]
在一些实施例中，如果一个或多个抗体克隆与抗体缀合不相容，则可以筛选靶向相同抗原的替代克隆。对于一些标志物，表达可能受限于多种组织类型。为了证实在这些情况下的表达，可以使用使用纯化一级抗体和聚合物缀合的二级抗体的标准ihc分析。在一些情况下，可以验证最多约20个抗体克隆或更多与新鲜冷冻组织的rca增强的codex检测相容的克隆。
[0296]
用于codex平台的当前实施方案的一些或全部经验证的抗体组可以与新鲜冷冻组织、福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织或两者的分析相容。
[0297]
实例7：软件分析模块
[0298]
用于处理高参数rca增强的codex数据集的软件分析模块可以含有针对细胞内标志物的染色数据。
[0299]
codex平台的实用程序可以来源于数据和相关的分析工具。首次，组织样品不仅可以针对标志物表达进行分析，而且可以另外针对最多约40个或更多个靶的相关空间组织进行分析。对于codex平台的当前实施方案，测量大量细胞表面标志物并提取所注释细胞类型之间的空间关联可能是有用的。技术进步可以使codex能够检测另外的标志物，从而有可能扩展可以测量的靶的类型。更新的分析管线和相关的软件包使得能够从这些数据集中提取有意义的生物数据。
[0300]
基于分段的高级分析工具可以改善分析。可以利用使用靶向转录因子、信号传导分子和弥漫性细胞外蛋白质的抗体组分析启用rca的codex数据的工具和方法。对于转录因
子、信号传导分子或两者，细胞内定位可能是具有潜在生物学意义的关键参数。区分这些标志物在细胞核内与细胞质内的表达可能很重要。可以使用亚细胞分段算法来映射这些区域中的每个区域，并将对应的荧光信号与此位置相关联。可以使用赫斯特染料来鉴定细胞核。可以通过相对于来自细胞表面标志物的信号减去细胞核来鉴定细胞质。另外的相关参数可以是荧光信号的外观，以及任选地所述荧光信号本质上是点状的还是弥漫的。可以通过分析局部荧光信号并将这些补丁拟合到表示弥漫或点状信号的不同模型来测量此参数。可以任选地基于当前分段算法或组织内的对应空间尺寸或两者在数据输出文件中提供荧光信号的亚细胞定位和相关性质中的一项或两项，所述数据输出文件可以含有组织样品中每个细胞的相关表达数据。这些细胞特征可以用于使用多种现有算法和工具中的一种或多种将细胞聚类，并且在一些情况下，可以对所得的细胞类型进行注释。亚细胞定位指示剂工具的添加可以基于细胞表面标志物表达、基于其细胞状态或两者对细胞进行分类。在一些情况下，分类可以揭示对疾病机制和治疗作用模式的重要见解。
[0301]
机器学习算法可以用于rca增强的codex数据分析。组织数据的分段可以提供对此空间内的单细胞表达谱的见解。在一些情况下，由于接近邻近小区边缘，补偿算法可以减轻这种方法的局限性。在一些情况下，结合使用经典图像分析和机器学习的另一种分段方法可以鉴定和改善细胞补丁。分析工具可以使用这些方法来分析rca增强的codex数据。可以对跨rca增强的codex数据集的参数空间的荧光信号补丁进行分析，并将其用于训练机器学习模型，以映射对应于不同标志物分布的信号的不同组合。在一些情况下，可以使用开源机器学习平台来完成分析。此步骤之后可以是荧光补偿步骤。在此分析中鉴定的补丁的组合可以由单个细胞数据或来自临近细胞的数据或两者组成。细胞边界可能很重要，也可能不重要。在一些情况下，标志物组合的信号强度的特征会成为比较的单位。例如，通过由cd4、cd19、pstat1和ki67信号强度组成的机器学习算法鉴定的补丁可以对应于具有增殖迹象的b细胞旁边的cd4辅助t细胞。在一些情况下，与每个单独细胞相关的信号之间的离散区分可能是不可能的。在一些情况下，可以鉴定标志物组合之间的空间驱动关联。在一些情况下，可以对机器学习模型的数据子集进行训练，并且然后应用所得的模型来提取跨其数据集的其余数据集的数据。在一些情况下，这对用户来说很容易。
[0302]
实例8：rca平台的集成
[0303]
可以集成rca增强的codex平台，包含生物化学试剂和相关的分析工具。可以将此平台部署到测试位点以测试所有组分的相容性，获得结果、反馈或两者。测试位点可以从预先验证的、在测试位点开发的或两者兼有的使用寡核苷酸标记的抗体的rca增强的codex实验中获得和分析数据。
[0304]
在一些情况下，codex平台的灵敏度提高可能导致验证用于此技术的另外的标志物。在一些情况下，codex平台的灵敏度提高可以扩大可以从此类分析中受益的潜在应用的范围。试剂和相关软件包或试剂盒的集合可以启用rca增强的codex。在一些情况下，试剂盒可以与仪器结合使用，以分析多种不同的样品类型。试剂产品可以包含与rca相容性寡核苷酸预缀合的codex抗体、适合由最终用户缀合以开发定制codex抗体组的寡核苷酸序列或两者。可以使用对应的缓冲液执行rca步骤以及标准codex工作流程两者。rca增强的codex数据采集可以在codex仪器上进行，所述仪器可以与显微镜基础设施任选地在实验室中耦接。可以使用工具包对所得的rca增强的codex数据执行分析。
[0305]
测试位点可以配备有codex仪器，并且可以接收一组codex标记的抗体。所述组可以包含约10个、20个、30个、40个或更多个codex标记的抗体。所述组可以包含对应的codex标记的检测染料，可以对所述染料进行优化以用于小鼠组织应用、人体组织应用或两者。在一些情况下，所述组可以包含可以用于创建定制的codex抗体组的缀合材料。可以根据codex抗体的预期调配物提供缓冲液、相关试剂或两者。可以请现场应用科学家对有关rca增强的codex方案的人员进行培训。每个测试位点可以从一种或多种组织类型中收集至少1个、5个、10个、20个、30个、40个或更多个数据集。可以使用rca增强的codex平台收集数据集。可以使用预缀合的codex标记的抗体组来收集数据集。可以设计和创建用于rca增强的codex平台的codex标记的抗体的定制集合。可以将这些抗体添加到预缀合的抗体组中。可以收集另外的数据集。在一些情况下，可以基于使用相同组织样本独立生成的数据的比较来衡量成功。在一些情况下，可以使用不同的显微镜来收集数据。在一些情况下，荧光信号强度的直接比较可能是合适的。在一些情况下，荧光信号强度的比较可能不是最佳度量。在一些情况下，荧光信号强度的比较可能不合适。在一些情况下，可以对信噪比进行比较。在一些情况下，独立数据集的信噪比值在彼此的阈值内可以被认为是成功的。在一些情况下，独立数据集的信噪比值在金标准值的阈值内可以被认为是成功的。阈值可以为约1％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。
[0306]
可以任选地基于相关的生物学功能比较样品之间的抗体染色的特异性，以检测共定位、检测不同标志物的互斥性或两者。
[0307]
实例9：对人扁桃体组织的分析
[0308]
如图6所示，将新鲜冷冻人扁桃体组织样品用24个标志物的抗体组染色。a)在每个循环期间收集核染剂，并用于漂移补偿。图像b
‑
i示出了跨八个循环和三个荧光通道收集的codex数据。信号以红色、绿色和蓝色的顺序列出，并且分别对应于在fam、cy3和cy5通道上收集的数据。b)胶原iv、cd7、ki67；c)cd38、cd31、cd4；d)cd45、cd90、cd19；e)cd15、cd3、cd56；f)cd21、cd34、cd278；g)hla
‑
dr；cd22、cd279；h)cd8、cd57、泛细胞角蛋白；i)cd9、平足蛋白、cd11c。分图j
‑
l中示出了分段管线的实例，其中j)示出了来自单个codex循环的数据的放大覆盖图，k)示出了对应的核染剂，并且l)示出了用于鉴定单个细胞的分段算法的结果。对跨所有通道和循环的每个分段细胞的荧光数据进行整合，并在输出表中列出了相关的空间尺寸。然后可以使用各种现有工具对这些数据进行聚类，并基于已知的细胞类型进行注释。然后可以执行各种下游分析。m)示出了示例热图，其示出了根据用42个codex标记的抗体染色的扁桃体组织样品的标志物对标志物空间相关性。n)示出了扁桃体组织的毛囊区域内的带注释的细胞类型的示例热图相关性分析。
[0309]
尽管本文中已经示出并且描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，这些实施例仅作为示例提供。本发明并不旨在受本说明书内所提供的具体实例限制。尽管已经参考上述说明书描述本发明，但本文中的实施例的描述和说明并不打算以限制意义理解。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的取决于各种条件和变量的特定描绘、配置或相对比例。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明的实施例的各种替代方案。因此，可以设想，本发明还将覆盖任何此类替代方案、修改、变化或等效物。以下权利要求书旨在限定本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和其
等同物的范围内的方法和结构。