基质附着区和促进基因表达的用途的制作方法

基质附着区和促进基因表达的用途
1.相关申请的交叉引用本技术根据35 u.s.c.
ꢀ§
119(e)要求2018年12月7日提交的美国临时申请序列号62/776,643的利益，其全部内容通过引用并入本文。


背景技术：

2.基因序列的转录（即mrna的生成）在许多不同的水平受到控制。转录起始位点或启动子具有不同的强度，并且给定基因的转录起始频率也可以通过增强子序列增加。转录过程中的暂停可以影响转录速率，从而影响在给定时间段内产生的转录物的量。前体mrna剪接、聚腺苷酸化和切割的速率也可以影响由转录单位产生的mrna的水平。此外，mrna分子内的序列可以调节其从细胞核到细胞质的转运、以及其转换率（即其细胞质稳定性）。
3.体外的多肽（例如治疗性抗体、生长因子）的表达对于制药工业而言是重要的，并且使蛋白表达最大化的方法是有需要的。
4.概述本发明描述了一种用于评估基质附着区（mar）的强度的新技术，并且表明了该技术可用于鉴定以前未知的新的mar序列。本发明还描述了嵌合mar序列。
5.本发明还描述了核苷酸构建体，所述核苷酸构建体包括顺式mar位置（placement）和相关的其他序列，以用于感兴趣的基因（goi）的最佳表达。
6.因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种重组多核苷酸，其包含：编码序列；启动子，其被配置为启动编码序列的转录；以及基质附着区（mar）核心，其选自seq id no: 1、5、9和13和与seq id no: 1、5、9和13中任何一个具有至少75%序列同一性（sequence identity）的核酸序列，其中mar核心能够附着到哺乳动物细胞核基质。
7.另一个实施方案提供了一种将编码序列转染到细胞的方法，其包含：在用于将第一和第二多核苷酸转染到细胞中的条件下，将细胞与包含编码序列和用于启动编码序列的转录的启动子的第一多核苷酸和包含选自seq id no: 1、5、9和13和与seq id no: 1、5、9和13中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列的基质附着区（mar）核心的不连接的（unlinked）第二多核苷酸接触，其中mar核心能够附着到哺乳动物细胞核基质。
8.本发明还提供了嵌合基质附着区（mar），其包含：（a）mar核心，其选自seq id no: 1、5、9和13和与seq id no: 1、5、9和13中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，其中mar核心能够附着到哺乳动物细胞核基质；（b）5’侧翼区，其选自seq id no: 2、6、10、14、18、22、26、30和34和与seq id no: 2、6、10、14、18、22、26、30和34中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列；以及（c）3’侧翼区，其选自seq id no: 3、7、11、15、19、23、27、31和35和与seq id no: 3、7、11、15、19、23、27、31和35中的任何一个具有至少75%序列同一性的核酸序列，其中mar核心、5’侧翼区和3’侧翼区不是来自相同的天然mar。
附图说明
9.图1比较了两种mar序列（作为对照的mar x29（一种已知的mar），以及通过本发明
的技术鉴定的mar斑马鱼（zebrafish））的强度。
10.图2展示了使用不包含任何mar序列的构建体作为对照，mar斑马鱼核心的强度。
11.图3是实施例2中所描述的含有mar核心的构建体的载体图。
12.图4是如实施例2中所描述的不包含mar核心元件的对照构建体的载体图。
13.详细描述i. 定义所有的数字标示（包括范围），例如ph、温度、时间、浓度和分子质量，都是近似值，其通过0.1的增量变化（+）或（
‑
）。应当理解的是，尽管并非总是明确地表明，但术语“约”位于所有的数字标示之前。还应当理解的是，尽管并非总是明确地表明，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物是本领域已知的。
14.如说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文中明确地规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“所述”包含复数形式。例如术语“一种/一个多核苷酸”包括多种多核苷酸，包括其混合物。
15.术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸还是其类似物。多核苷酸可以包括被修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可以在组装多核苷酸之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。在聚合之后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分偶联。该术语也指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施方案包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
16.ii. 新的基质附着区（mar）序列本发明描述了一种经由电脑（in silico）量化mar元件的强度的方法，以及使用该方法量化从序列数据库中鉴定的新的mar序列的强度。
17.通过序列比较和结构
‑
活性分析，本发明人发现mar元件可以由中央富含at的核心区和含有转录因子结合基序的5'和3'侧翼区组成。
18.核心区可以富含(atat)n微卫星。结合基序可以靶向satb1、nmp4、cebp、fast和hox转录因子。mar可以结合的其他细胞核基质蛋白包括：arbp蛋白（附着区结合蛋白），其识别mar中的共有序列atttca
c
/
g
ttgtaaaa；nmp
‑
2蛋白，仅定位于细胞核基质中；sp1、atf、ccaat、c/ebp和ap
‑
1转录因子；酵母acbp蛋白（ars共有结合蛋白），其与ars元件相互作用；组织特异性人satb1蛋白，其主要在胸腺中表达，其与特殊的一类一条链上有a、t或c，但没有g的富含at的mar的小沟结合；matrin 3蛋白（一种人和大鼠细胞的内部细胞核基质网络的酸性蛋白），matrin f/g；转录蛋白因子rfp。
19.分析结果帮助发明人寻找新的mar序列，从而发现了与阳性对照mar x29相比在促进基因表达方面高效的四个新的mar序列（arope et al. (2013) plos one 8(11): e79262）。
20.本发明进一步证明，这些新鉴定的mar序列的核心可以与来自其他mar的5’和3’侧翼区形成功能性mar，提供另外的有用的嵌合mar序列。
21.因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种重组多核苷酸，其包含：编码序列；启动子，其被配置为启动编码序列的转录；以及本文所述的基质附着区（mar）核心及其变
体。这种新的mar核心的实施例列于表1中。参见，例如，seq id no: 1、5、9和13。
22.基质附着区或mar是真核生物的染色体的dna中细胞核基质附着的序列。作为将真核生物的基因组在细胞核内组织成功能单元的结构dna组件，mar可以在细胞核内介导染色质的结构组织。这些元件构成染色质支架的dna的锚点，并且用于将染色质组织成结构域。由mar元件介导的染色质的动态和复杂组织在基因表达的调节中起着重要作用。
23.mar核心的变体是与参考mar核心（例如，seq id no: 1、5、9和13）具有一定序列同一性（例如，至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%）并具有预期的mar功能（例如，附着到哺乳动物核基质的能力）的核酸序列。
24.在一些实施方案中，mar核心的变体富含at，例如在序列中具有至少75%、80%、85%、90%或95%的a或t。
25.mar核心能够与mar的5’侧翼区（例如seq id no: 2、6、10、14和18中的任何一个或其变体（与seq id no: 2、6、10、14和18中的任何一个具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列））一起存在。在一些实施方案中，5’侧翼区位于mar核心的5’侧，并距离mar核心100个核苷酸之内。
26.在一些实施方案中，mar核心能够与mar的3’侧翼区（例如seq id no: 3、7、11、15和19中的任何一个或其变体（与seq id no: 3、7、11、15和19中的任何一个具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列））一起存在。在一些实施方案中，3’侧翼区位于mar核心的3’侧，并距离mar核心100个核苷酸之内。
27.包括mar核心、5’侧翼区和3’侧翼区的非限制性mar序列包括seq id no: 4、8、12和16和与seq id no: 4、8、12和16中的任何一个具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列，其中mar核心能够附着到哺乳动物细胞核基质。
28.iii. 嵌合mar序列正如所提供的，这些新鉴定的mar序列的核心能够与来自其他mar的5’和3’侧翼区形成功能性mar，提供另外的有用的嵌合mar序列。
29.在一个实施方案中，本发明的嵌合mar包括如本文所公开的mar核心，其在5’侧具有5’侧翼区。在一个实施方案中，本发明的嵌合mar包括如本文所公开的mar核心，其在3’侧具有3’侧翼区。在一个实施方案中，本发明的嵌合mar包括如本文所公开的mar核心，其在5’侧具有5’侧翼区且在3’侧具有3’侧翼区。
[0030]5’
侧翼区能够选自本领域已知的或本文公开的任何5’侧翼区或3’侧翼区。在一些实施方案中，5’侧翼区能够选自本领域已知的或本文公开的任何5’侧翼区。
[0031]3’
侧翼区能够选自本领域已知的或本文公开的任何5’侧翼区或3’侧翼区。在一些实施方案中，5’侧翼区能够选自本领域已知的或本文公开的任何3’侧翼区。
[0032]
mar核心、mar 5’侧翼区和mar 3’侧翼区中的每一个也能够被核酸变体（例如，与参考序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性）取代。
[0033]
本文公开的mar核心包括seq id no：1、5、9和13。本文公开的5’侧翼区包括seq id no：2、6、10、14、18、22、26、30和34。本文公开的3’侧翼区包括seq id no：3、7、11、15、19、23、27、31和35。
[0034]
在一些实施方案中，本文新鉴定的mar侧翼序列也能够与本文新发现的或已知的其他核心序列融合以产生新的嵌合mar序列。在一些实施方案中，嵌合mar序列包括表1的
accession no.k03104; uetsuki et al. (1989) j. biol. chem.264:5791
‑
5798; schorpp et al. (1996) nucleic acids res.24:1787
‑
1788; hamaguchi et al. (2000) j. virology74:10778
‑
10784; dreos et al. (2013) nucleic acids res.41(d1):d157
‑
d164以及http://epd.vital
‑
it.ch（在2014年7月16日登入）的真核生物的启动子数据库。
[0045]
载体上还可以包含增强子。非限制性实施例包括在cmv启动子和内含子a序列中的增强子。先前显示五种胚胎干细胞（esc）转录因子占据了超增强子（oct4、sox2、nanog、klf4和esrrb），并且还有许多另外的转录因子有助于esc的控制。另外的六种转录因子（nr5a2、prdm14、tcfcp2l1、smad3、stat3和tcf3）占据了典型的增强子和超级增强子，并且所有这些都富含超级增强子。这些中的任一种或本领域中进一步已知的都可以在本发明中使用。
[0046]
在真核生物的细胞中有活性的聚腺苷酸化信号是本领域已知的，包括但不限于sv40聚腺苷酸化信号、牛生长激素（bgh）聚腺苷酸化信号和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号指导前体mrna的3’末端切割、在切割位点处前体mrna的聚腺苷酸化、和聚腺苷酸化信号下游的转录终止。核心序列aauaaa通常存在于聚腺苷酸化信号中。还可参见cole et al. (1985) mol. cell. biol. 5:2104
‑
2113。
[0047]
可以被用在本发明的载体中的示例性的内含子包括人类/小鼠/大鼠/其他物种巨细胞病毒主要立即早期（mie）基因的β
‑
珠蛋白（globin）内含子和第一内含子（也称为“内含子a”）。
[0048]
可以被包括在本发明的载体中的另外的转录后调控元件包括但不限于cmv mie的5
’‑
非翻译区、人hsp70基因、来自血管内皮生长因子（vegf）基因的sp163序列、以及与腺病毒晚期mrna相关的三联前导序列。参见例如mariati et al. (2010) protein expression and purification69:9
‑
15。
[0049]
在某些实施方案中，本文公开的载体含有编码在真核生物的细胞中起作用的选择标记物（即真核生物的选择标记物）的核苷酸序列，使得当施加适当的选择时，不含有该选择标记物的细胞死亡或者比含有该选择标记物的细胞明显慢得多地生长。在真核生物的细胞中起作用的示例性的选择标记物是谷氨酰胺合成酶（gs）基因；通过在缺乏谷氨酰胺的培养基中培养细胞、或者用l
‑
蛋氨酸亚砜亚胺（l
‑
methioniene sulfoximine）进行选择、或同时使用上述两者来施加选择。在真核生物的细胞中起作用的另一个示例性的选择标记物是编码对新霉素（neo）的抗性的基因；通过在含有新霉素、遗传霉素或g418的培养基中培养细胞而施加选择。另外的选择标记物包括二氢叶酸还原酶（dhfr，赋予对氨甲喋呤的抗性）、嘌呤霉素
‑
n
‑
乙酰转移酶（提供对嘌呤霉素的抗性）和潮霉素激酶（提供对潮霉素b的抗性）。在真核生物的细胞中起作用的另外的选择标记物是在本领域已知的。
[0050]
编码上述选择标记物的序列被可操作地连接至启动子和聚腺苷酸化信号。如上所述，在真核生物的细胞中起作用的启动子和聚腺苷酸化信号是在本领域已知的。
[0051]
在某些实施方案中，本文公开的载体可以含有两个或更多个表达盒。例如，含有两个表达盒（其中一个编码抗体重链，另一个编码抗体轻链）的载体可以被用于产生功能性抗体分子。
[0052]
本文公开的载体还含有在原核细胞中起作用的复制起点（即原核复制起点）。在原核细胞中起作用的复制起点在本领域中是已知的，并且包括但不限于大肠杆菌的oric起点；质粒起点，例如psc101起点、pbr322起点（rep）和puc起点；以及病毒（即噬菌体）复制起
york, 2005。
实施例
[0061]
通过参考以下实施例进一步理解本发明，这些实施例旨在纯粹是本发明的示例。本发明的范围不受限于示例性的实施例，其仅意图作为本发明的单个方面的说明。任何功能上等同的方法都在本发明的范围内。根据前面的描述和附图，除本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。这些修改落入所附权利要求的范围内。
[0062]
实施例1.寻找新的mar该实施例开发了一种经由电脑量化基质附着区（mar）元件的强度的方法，以及使用该方法量化一些示例性mar序列的强度。
[0063]
基于基序的mar鉴定进行文献检索以识别与mar鉴定相关的所有基序，特别是寻找mar特异性转录因子、染色质结合域、dna弯曲和dna解旋序列。总结了潜在有用的特征并用于进一步的mar评估。
[0064]
mar元件可以由中央富含at的核心区和含有转录因子结合基序的5’和3’侧翼区组成。核心区可能富含(atat)n微卫星。
[0065]
mar可以包含“mar识别特征”并通常通过包含“mar识别特征”进行分类。二重（bipartite）元件由两个不同的序列aataayaa和awrtaannwwgnnnc组成。其他mar指示序列由各种转录因子和dna结构基序组成。示例性序列包括dna解旋基序、ap
‑
1、a
‑
box和t
‑
box、nmp
‑
2、satb1、hox4d、tef、pit1和fast。
[0066]
通过检索鉴定出4个新的mar元件，分别命名为mar斑马鱼、mar鲤鱼（cyprinus carpio）、mar 12
‑
rp13和mar 17xx_fos。它们以及一些已知元件（mar 1
‑
68、mar s4、mar x29、小鼠c
‑
myc 5mar和spr2a
‑
mar）的完整序列、核心以及核心的5’和3’侧翼区列于表1中。
[0067]
表1. mar序列
注意：在全长序列中，核心区用粗体和下划线表示，侧翼区用下划线表示。
[0068]
实施例2. mar斑马鱼的测试对鉴定的mar元件中的一个（mar斑马鱼）进行实验测试，并与来自文献的最强的已知的mar进行比较，其示出高两倍的效力。
[0069]
体外比较mar斑马鱼（新鉴定的mar元件）与mar x29（对照，参考arope et al. (2013) plos one 8(11): e79262）。
[0070]
然后对不包括全长mar斑马鱼的侧翼区的mar斑马鱼核心进行实验测试，与不包含任何mar序列的构建体进行比较。
[0071]
材料与方法neon 转染是用ct mcb细胞进行的。使用balancd + 4 mm gln 培养基用于转染。通过bio
‑
rad（gene pulser ii设置为900 uf，300 v，电阻0）进行的瞬时转染。细胞在转染的24小时前分裂。第0天生存力和vcd以百万个细胞/ml表示。使用5 μg重链和轻链dna进行转染。10 μg gfp dna被用作外部对照以检查转染效率。通过将甲硫氨酸亚砜亚胺（msx）在导致有利于表达感兴趣的重组蛋白（利妥昔单抗轻链）的细胞生长的选择性压力的水平维持14天产生稳定的库（pool）。在14天补料分批（fed batch）定量分析中比较所得的重组库。通过生物层干涉仪或elisa分析在收获当天和整个培养过程中的滴度。使用仅一种浓度的msx（80 mm）重复上述库生成的实验方法以生成用于测试mar斑马鱼核心的库。
[0072]
结果mar x29和mar斑马鱼的体外比较结果如图1所示。在两种选择标记物浓度（80 mm和100 mm的甲硫氨酸亚砜亚胺（msx））下，mar斑马鱼的表现均明显优于mar x29。因此，该实
施例验证了实施例1中开发的检索和经由电脑的方法。
[0073]
在进一步的实验中，与没有任何mar元件的构建体相比，测试了单独的mar核心序列的效力。如图2所示，mar斑马鱼核心序列比无mar对照产生显著更高的滴度。
[0074]
应该理解的是，虽然已经结合上述实施方案描述了本发明，但是前面的描述和实施例旨在进行说明而不是限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优点和修改对于本发明所属领域的技术人员来说将是显而易见的。