棘白菌素B母核降解杂质的去除方法与流程

棘白菌素b母核降解杂质的去除方法
技术领域
1.本发明属于抗真菌药物领域，具体涉及一种棘白菌素b母核降解杂质的去除方法。


背景技术：

2.由于广谱抗真菌药物的大量使用，真菌耐药性逐渐增强。在一些免疫抑制患者包括hiv感染者、器官移植者以及那些患有其他疾病而症进行免疫治疗的患者中，真菌感染无论是其发生频率还是感染种类都在不断地增加。因此，迫切需要寻找新的安全有效的抗真菌药物。
3.20世纪70年代发现的棘白菌素类药物为一组天然产物，结构由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成，通过非竞争性作用机制抑制β-(1,3)-d-葡聚糖的合成，导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用。其作用机制独特，不良反应率低，作为一种可杀死真菌的药物表现出抗菌谱广，活性强的特点，是治疗免疫抑制患者和免疫正常患者真菌感染的重要选择药物。迄今上市的棘白菌素类抗真菌抗生素有三个：卡泊芬净(默沙东，商品名cancidas)、米卡芬净(安斯泰来，商品名mycamine)和阿尼芬净(辉瑞，商品名eraxis)。由于棘白菌素b(echinocandin b，简称为ecb)亚油酸侧链的存在，其具有一定的溶血毒性；以ecb为先导化合物，通过酰胺水解酶脱去亚油酸侧链，得到棘白菌素b母核(echinocandin b nucleus，简称为ecbn)；通过化学合成的方法，在ecbn上连接对戊氧基三联苯甲酸侧链，得到阿尼芬净(anidulafungin，ly303366)。
4.在实际生产中，需要纯化ecbn，再用于化学合成。cn102336817a公开了一种棘白菌素b母核的分离方法，该方法使用树脂吸附、洗脱的方法，使用大量的有机溶剂冲洗，且终产品色素残留多，纯度和收率偏低，极大制约了棘白菌素b母核的生产。cn104447961a公开了一种棘白菌素b母核的纯化方法，先将棘白菌素母核转化上柱至大孔吸附树脂吸附，用含脂肪醇的无机酸水溶液洗脱，再经硅胶柱层析得到纯度为97％的棘白菌素b母核。cn107759668a公开了一种高纯度棘白菌素b母核或其盐的纯化方法，将样品上柱于高效液相制备色谱再用含水有机溶剂的洗脱。cn107778359a公开了一种提纯棘白菌素b母核的方法，先将转化液固液分离，浓缩除去水分，加入有机溶剂结晶，得到棘白菌素b母核。cn105566457a公开了一种棘白菌素b母核的纯化方法，采用c18反相制备柱分离纯化粗品，0.2％乙酸铵水溶液：甲醇＝94:6(v/v)解吸，得到纯度99％的棘白菌素b母核。
5.由于棘白菌素b母核不稳定，在受热、遇碱或长时间放置条件下，极易降解产生降解杂质，降低了产品纯度。采用现有技术的方法重新精制，操作繁琐，成本较高，且不利于环保。目前报道的棘白菌素母核的纯化方法并不单独针对棘白菌素b母核降解杂质。因此亟需一种针对棘白菌素b母核降解杂质去除的方法。


技术实现要素：

6.基于棘白菌素b母核性质不稳定，极易发生降解产生降解杂质，本发明的目的在于提供一种简单有效且适于放大生产的除去棘白菌素b母核降解杂质的方法。
7.一种棘白菌素b母核降解杂质的去除方法，包括如下步骤：
8.(1)棘白菌素b母核溶液用酸调ph作为上柱液；
9.(2)将上柱液以贯穿模式上柱于大孔吸附树脂柱，收集流出液。
10.优选地，步骤(1)所述棘白菌素b母核溶液是将棘白菌素b母核溶解在甲醇的水溶液中，甲醇水溶液中甲醇体积分数为0～5％；当甲醇的体积分数为0时，即为棘白菌素b母核溶解在水中。
11.优选地，步骤(1)棘白菌素b母核溶液中棘白菌素b母核纯度为85.0～99.9％，棘白菌素b母核降解杂质含量为0.1～6.0％。
12.优选地，步骤(1)所述上柱液棘白菌素b母核的浓度为5～30g/l，进一步优选为10～30g/l。
13.优选地，步骤(1)所述调节ph用的酸为硫酸、磷酸、盐酸、乙酸或柠檬酸，进一步优选为盐酸或乙酸。
14.优选地，步骤(1)棘白菌素b母核浓缩液用酸调节ph为4.0～5.0；进一步优选地，步骤(1)棘白菌素b母核浓缩液用酸调节ph为4.4～4.6。
15.优选地，步骤(2)所述的大孔吸附树脂为聚苯乙烯-二乙烯基树脂，进一步优选为xad1600n、sp825l、hp20ss、nm100，特别优选为sp825l、xad1600n。
16.优选地，步骤(2)所述上柱量为100～200g/l树脂，即每升大孔吸附树脂上柱100～200g棘白菌素b母核。进一步优选地，步骤(2)所述上柱量为150～170g/l树脂。
17.优选地，步骤(2)所述大孔吸附树脂柱为常压色谱柱或中压色谱柱，树脂柱高径比为1～4:1，优选为2～3:1。
18.优选地，步骤(2)上柱流速为3～8bv/h，进一步优选为5～6bv/h；bv指树脂柱的柱床体积。
19.优选地，步骤(2)上柱结束后用ph4.0～5.0的水洗涤0.5～2.0bv；即用0.5～2.0倍树脂柱床体积的ph4.0～5.0的水进行洗涤。进一步优选为用ph4.4～4.6的水洗涤1～1.5bv；bv是树脂柱柱床体积。
20.优选地，步骤(2)上柱过程中适时检测流出液，当棘白菌素b母核开始穿透即连续收集流出液至洗涤结束。
21.本发明采用贯穿模式进行纯化，贯穿模式即流穿模式，含有棘白菌素b母核的上柱液连续上柱至大孔吸附树脂柱，流出液中有棘白菌素b母核穿透泄漏继续上柱。
22.本发明不限定棘白菌素b母核的来源，可参照现有技术的方法制备棘白菌素b母核粗品。另外，贯穿后的大孔吸附树脂用常规再生方式处理即可，例如碱再生、醇再生等。
23.本发明棘白菌素b母核降解杂质去除方法，上柱液中棘白菌素b母核浓度高，树脂处理量大，相对使用树脂较少，且不使用有机溶剂洗脱，操作简便，不使用昂贵设备，大孔树脂柱高径比小，不存在层析柱堵塞等问题，适宜于棘白菌素b母核的粗纯或棘白菌素b母核的精制过程，棘白菌素b母核降解杂质去除率高，处理量大，收率高，适合工业化生产。
附图说明：
24.图1：棘白菌素b母核粗品hplc图谱；
25.图2：棘白菌素b母核收集流出液hplc图谱。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例用于例证的目的，并不用来限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的试验方法，通过按照本领域常规条件或方法或制造厂商所建议的条件。以下实施例所用的试剂均可通过商业途径获得，
27.本发明中棘白菌素b母核及其降解杂质的检测方法为高效液相色谱法，具体检测条件为：
28.色谱柱：agilent zorbax sb-c18，4.6
×
250mm；5μm
29.流动相：流动相a：5g/l磷酸二氢铵水溶液、流动相b：乙腈，按下表进行梯度洗脱；
[0030][0031]
进样量：10μl
[0032]
流速：1.0ml/min
[0033]
柱温：30℃
[0034]
紫外检测波长：214nm
[0035]
棘白菌素b母核的保留时间为15.7min，棘白菌素b母核降解杂质的保留时间为19.6min。
[0036]
降解杂质去除率＝(粗品中降解杂质含量-过柱后降解杂质含量)/粗品中降解杂质含量
×
100％
[0037]
实施例1
[0038]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度95.74％，降解杂质1.31％)，配制浓度为21.2g/l棘白菌素b母核水溶液800ml，用冰醋酸调节ph4.5待用；将sp825l大孔吸附树脂100ml装层析柱(高径比为2:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为5bv/h，收集含棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用150ml ph4.5的水溶液进行洗涤，共接收流出液914ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度96.76％，降解杂质0.08％，棘白菌素b母核回收率96.52％，降解杂质去除率93.8％。
[0039]
实施例2
[0040]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度90.13％，降解杂质2.32％)，溶解在甲醇水溶液中(甲醇体积分数为3％)，配制成浓度为10.4g/l棘白菌素b母核水溶液1500ml，用1mol/l盐酸调节ph至4.5待用；将xad1600n大孔吸附树脂100ml装层析柱(高径比为3:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为6bv/h，收集含棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用100ml ph4.5的水溶液进行洗涤，共接收流出液1530ml，hplc检测，棘
白菌素b母核纯度91.88％，降解杂质0.16％，棘白菌素b母核回收率95.13％，降解杂质去除率93.1％。
[0041]
实施例3
[0042]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度95.74％，降解杂质1.31％)，配制成浓度为5.1g/l棘白菌素b母核水溶液2000ml，用磷酸调节ph4.0待用；将nm100大孔吸附树脂100ml装柱(高径比为4:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为8bv/h，收集含有棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用200ml ph4.0水进行洗涤，共接收流出液2110ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度96.86％，降解杂质0.11％，棘白菌素b母核回收率90.6％，降解杂质去除率91.6％。
[0043]
实施例4
[0044]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度90.13％，降解杂质2.32％)，配制成浓度为30.4g/l棘白菌素b母核水溶液650ml，用柠檬酸调节ph5.0待用；将hp20ss大孔吸附树脂100ml装柱(高径比为1:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为3bv/h，收集含有棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用100ml ph5.0水进行洗涤，共接收流出液685ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度92.06％，降解杂质0.21％，棘白菌素b母核回收率91.2％，降解杂质去除率90.9％。
[0045]
实施例5
[0046]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度92.76％，降解杂质2.72％)，配制成浓度为27.5g/l棘白菌素b母核水溶液35.2l，用冰醋酸调节ph至4.5待用；将sp825l大孔吸附树脂5000ml装层析柱(高径比为2:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为6bv/h，收集含棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用5000ml ph4.5的水溶液进行洗涤，共接收流出液38.5l，hplc检测，棘白菌素b母核纯度96.13％，降解杂质0.19％，棘白菌素b母核回收率92.3％，降解杂质去除率93.0％。
[0047]
实施例6
[0048]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度90.13％，降解杂质2.32％)，将其配制将浓度为20.4g/l棘白菌素b母核水溶液800ml，用冰醋酸调节ph至4.6待用；将xad1600n大孔吸附树脂100ml装层析柱(高径比为3:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为6bv/h，收集含棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用150mlph4.6的水溶液进行洗涤，共接收流出液885ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度92.16％，降解杂质0.18％，棘白菌素b母核回收率94.0％，降解杂质去除率92.2％。
[0049]
实施例7
[0050]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度85.92％，降解杂质5.36％)，将其配制将浓度为20.2g/l棘白菌素b母核水溶液800ml，用冰醋酸调节ph至4.4待用；将sp825l大孔吸附树脂100ml装层析柱(高径比为2:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为5bv/h，收集含棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用250mlph4.5的水溶液进行洗涤，共接收流出液960ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度90.16％，降解杂质0.40％，棘白菌素b母核回收率91.3％，降解杂质去除率92.5％。
[0051]
实施例8
[0052]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度99.26％，降解杂质0.24％)，将
其配制将浓度为20.3g/l棘白菌素b母核水溶液800ml，用冰醋酸调节ph至4.5待用；将sp825l大孔吸附树脂100ml装层析柱(高径比为2:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为5bv/h，收集含棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用200ml ph4.5的水溶液进行洗涤，共接收流出液940ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度99.51％，降解杂质0.02％，棘白菌素b母核回收率99.51％，降解杂质去除率91.7％。
[0053]
实施例9
[0054]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度90.13％，降解杂质2.32％)，将其配制将浓度为20.0g/l棘白菌素b母核水溶液800ml，用冰醋酸调节ph至4.5待用；将xad16大孔吸附树脂100ml装层析柱(高径比为3:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为5bv/h，收集含棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用100mlph4.5的水溶液进行洗涤，共接收流出液830ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度91.08％，降解杂质0.46％，棘白菌素b母核回收率92.2％，降解杂质去除率80.2％。
[0055]
实施例10
[0056]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度90.13％，降解杂质2.32％)，配制成浓度为10.5g/l棘白菌素b母核水溶液1500ml，用1mol/l盐酸调节ph至4.5待用；将hz816大孔吸附树脂100ml装层析柱(高径比为2:1)，将棘白菌素b母核溶液上柱于树脂柱，上柱流速为6bv/h，收集含棘白菌素b母核的流出液，上柱完毕，用150ml ph4.5的水溶液进行洗涤，共接收流出液1585ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度91.28％，降解杂质0.89％，棘白菌素b母核回收率87.4％，降解杂质去除率61.6％。
[0057]
对比实施例1
[0058]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度95.74％，降解杂质1.31％)，配制浓度为21.2g/l棘白菌素b母核水溶液280ml，用冰醋酸调节ph4.5待用；上高径比6:1，柱体积为1.5l的大孔吸附树脂柱hz806，上柱流速为0.5％bv/min，上柱吸附后用ph4.0的盐酸水溶液2bv洗脱，再用含10％乙醇的ph4.0的盐酸水溶液1bv将棘白菌素b母核集中冲洗下来，洗脱的流速为1％bv/min，收集洗脱液5010ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度97.45％，降解杂质0.67％，棘白菌素b母核回收率90.3％，降解杂质去除率48.8％。
[0059]
对比实施例2
[0060]
称取棘白菌素b母核粗品(棘白菌素b母核hplc纯度95.74％，降解杂质1.31％)，配制浓度为21.2g/l棘白菌素b母核水溶液280ml，用冰醋酸调节ph4.5待用；上高径比为3:1，柱体积为1.5l的大孔吸附树脂柱sp825l，上柱流速为0.5％bv/min，上柱吸附后用ph4.0的盐酸水溶液2bv洗脱，再用含10％乙醇的ph4.0的盐酸水溶液1bv将棘白菌素b母核集中洗下来，洗脱流速为2％bv，收集洗脱液5100ml，hplc检测，棘白菌素b母核纯度98.13％，降解杂质0.61％，棘白菌素b母核回收率91.4％，降解杂质去除率53.4％。