本发明涉及微生物培养技术领域，更具体的说是涉及一种促进松材线虫内寄生真菌esteyavermicola生长及产孢的培养基及其制备方法。
背景技术：
松材线虫病(pinewiltdisease)是一种由松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)引起的松树快速枯萎死亡、连片毁灭的危险性病害。由于危害严重、防治困难而受到世界各国的高度重视，被列为重要的危险性森林病害，并被40多个国家立法为重点检疫对象。松材线虫主要通过天牛成虫在健康树上补充营养和在衰弱树上产卵所造成的伤口侵入寄主松树体内。松材线虫最初起源于美国，经木材贸易传入日本、中国大陆、中国台湾韩国、墨西哥、葡萄牙和西班牙，并相继发生了松材线虫病。目前我国松材线虫病已扩散到江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、云南等14个省、192个县(市)、674个乡镇，毁灭松林500多万亩，给国民经济造成巨大损失。
松材线虫病的防控已成为世界性难题，但目前缺少行之有效的防治方法。世界上普遍采取的措施是切断传播源和传播途径，阻止松材线虫的传播。目前采用的方法有砍伐病木，切断传播源；利用诱捕剂诱杀松褐天牛，空中与地面喷洒化学药剂如噻虫啉、杀螟松乳剂等防治天牛，应用天牛的捕食性或寄生性天敌如肿腿蜂(sclerodermaspp.)、花绒寄甲(dastarcuslongulus)、朽木坚甲(alleculafuliginosa)和啄木鸟(dendrocopsspp.)等防治天牛，以及利用白僵菌等真菌防治天牛等；树干注射化学药剂如阿维菌素、虫线清、植物提取剂苦豆碱等防治松材线虫；利用马尾松、火炬松和日本黑松杂交，选育抗病品种等方法。由于松褐天牛危害的隐蔽性，化学防治一般难于奏效，而且会造成环境污染、对非靶标生物的毒副作用，同时由于树干注射等防治方法的局限性，一种防治效率高、操作性强、绿色环保的防治方法成为迫切需求。
利用微生物农药防治松材线虫病是当前国际上的研究热点。esteyavermicola是世界上第一个被报道的松材线虫内寄生真菌。该菌能产生新月形和杆状两种不同类型的孢子，其中新月形的孢子对松材线虫具有很高的侵染活力。室内平板测定、野外注射试验和温室喷洒试验均验证了esteyavermicola具有优异的防治松材线虫病的效果。
esteyavermicola真菌在传统固体培养上生长速度较慢，产孢率不高，特别是具有粘附并致死松材线虫的新月形孢子比例不高，影响了esteyavermicola真菌的工厂化生产产率。因此，提供一种促进松材线虫内寄生真菌esteyavermicola生长及产孢的培养基及其制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种促进松材线虫内寄生真菌esteyavermicola生长及产孢的培养基及其制备方法，缩短esteyavermicola的生长周期，提高esteyavermicoa的产孢率，特别是提高具有粘附并致死松材线虫的新月形孢子的比例。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种促进松材线虫内寄生真菌esteyavermicola生长及产孢的培养基，具体组成如下：马铃薯170-230g/l，葡萄糖15-25g/l，琼脂17-23g/l，氯化钙4-6g/l；ph为6-9。
进一步，一种促进松材线虫内寄生真菌esteyavermicola生长及产孢的培养基，具体组成如下：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，氯化钙4-6g/l；ph为6-9。
进一步，所述马铃薯为去皮马铃薯。
进一步，所述ph为7。
进一步，一种促进松材线虫内寄生真菌esteyavermicola生长及产孢的培养基的制备方法，具体步骤如下：
(1)将马铃薯去皮切碎，加水煮沸，纱布过滤，收集滤液；
(2)加入葡萄糖、琼脂、氯化钙，加蒸馏水，调节ph值，定容；
(3)将定容后的溶液于121℃，1.05×105pa下高压灭菌20min，得到培养基。
进一步，步骤(2)加水煮沸30min。
进一步，一种促进松材线虫内寄生真菌esteyavermicola生长及产孢的培养基在培养松材线虫内寄生真菌esteyavermicola中的应用，具体为：将esteyavermicola接种到培养基上培养，培养温度为23-31℃，培养时间为7-14天。
进一步，培养温度为26℃，培养时间为7天。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种促进松材线虫内寄生真菌esteyavermicola生长及产孢的培养基及其制备方法，该培养基提高了松材线虫内寄生真菌esteyavermicola的生长速度，缩短了培育时间；提高了松材线虫内寄生真菌esteyavermicola的产孢率，特别是具有粘附并致死松材线虫的新月形孢子的比例明显升高，为松材线虫内寄生真菌esteyavermicola的使用提供了有利条件。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种促进松材线虫内寄生真菌esteyavermicola生长及产孢的培养基的制备方法，具体步骤如下：
(1)将马铃薯去皮切碎，加1l水，煮沸30min，纱布过滤，收集滤液；
(2)加入葡萄糖20g、琼脂20g、氯化钙5g，加蒸馏水，调节ph值为7，定容至1l；
(3)将定容后的溶液于121℃，1.05×105pa下高压灭菌20min，得到培养基。
实施例2
参照实施例1中培养基的配制方法，ph调整为6-9(表1)。
将培养基在无菌条件下倒入培养皿中，待培养皿中的培养基凝固后，覆盖直径稍小于培养皿的灭菌玻璃纸；然后将活化的松材线虫内寄生真菌esteyavermicola转接到覆盖有玻璃纸的培养基上，接种10个平皿。接种后在26℃培养箱中黑暗培养。
待培养15天后，用直尺量取并统计菌落直径。并将真菌菌落从覆盖玻璃纸的固体培养基上的刮下来，收集大量的菌落，并分为两部分，每部分5个平皿。5个平皿的菌落放到60℃烘箱中，持续烘干两天，称重，并记录真菌菌落干重。另外5个平皿的菌落转到50ml离心管中，加入0.5％吐温80，加入几粒玻璃珠。放到振荡器上震荡，用血球计数板统计产孢量及新月形孢子比例。
表1不同ph条件下培养基中真菌生长及产孢情况
注：表中数值为平均值±标准误(n＝3)，同行数据后上方的字母表示在0.05水平上差异显著。
实施例3
参照实施例1中培养基的配制方法，在培养基中加入不同金属阳离子(表2)，阴离子为氯离子，kcl，cacl2，mgcl2，fecl2，fecl3，不同氯化物设定相同的浓度为5mg/l。接种10个平皿。待真菌培养15天后，将10个平皿均分为两部分，其中5个平皿检测真菌菌落生长速度包括菌落直径和菌落干重，另外5个平皿检测产孢量。每组进行3次重复试验处理。
表2培养基中添加不同金属阳离子的情况下真菌生长和产孢情况
注：表中数值为平均值±标准误(n＝3)，同行数据后上方的字母表示在0.05水平上差异显著；“—”表示菌落未生长。
实施例4
参照实施例1中培养基的配制方法，在培养基中加入不同阴离子(表3)，阳离子为钙离子，cacl2，caco3，caso4，不同该离子化合物设定相同的浓度为5mg/l。接种10个平皿。待真菌培养15天后，将10个平皿均分为两部分，其中5个平皿检测真菌菌落生长速度包括菌落直径和菌落干重，另外5个平皿检测产孢量以及新月形孢子的比率。每组进行3次重复试验处理。
表3培养基中添加不同阴离子的情况下真菌生长和产孢情况
注：表中数值为平均值±标准误(n＝3)，同行数据后上方的字母表示在0.05水平上差异显著。
实施例5
参照实施例1中培养基的配制方法，在培养基中加入不同浓度的氯化钙(表4)，0mg/l，2mg/l，4mg/l，5mg/l，6mg/l，8mg/l。接种10个平皿。待真菌培养15天后，将10个平皿均分为两部分，其中5个平皿检测真菌菌落生长速度包括菌落直径和菌落干重，另外5个平皿检测产孢量。每组进行3次重复试验处理。
表4培养基中添加不同浓度氯化钙的情况下真菌生长和产孢情况
注：表中数值为平均值±标准误(n＝3)，同行数据后上方的字母表示在0.05水平上差异显著。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。