一种矮牵牛花药发育相关PhDof4基因及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种矮牵牛花药发育相关phdof4基因及其应用。

背景技术：

dof基因家族蛋白是植物特有的一类转录调控因子，除了与本家族蛋白互作，还与其它家族蛋白成员互作，其在植物组织分化、种子发育、逆境胁迫、植物生理代谢等方面具有重要的调控作用。自1993年从玉米中鉴定报道了第一个zmdof1(mnb1a)转录因子以来，已在多种单子叶植物和双子叶植物中发现了dof基因。其中拟南芥基因组中存在37个dof基因(yanagisawa，2002)，水稻基因组中存在30个(lijavetzkyetal，2003)，大麦中有26个(moreno-risuenoetal，2007b)，大豆中有28个(wangetal，2007)，南瓜(kisuetal，1998)、烟草(baumannetal，1999)、小麦(chenetal，2005)和马铃薯(pleschetal，2001)等植物中也都存在dof基因。dof蛋白一般由200～400个氨基酸组成，具有特异和高度保守的dna结合域，即位于n末端由52个氨基酸组成的dof域。dof蛋白以其dof结构域与不同的植物特异性基因的启动子相互作用，在每一个dof蛋白的dna结合序列中均存在有aaag序列。aaag序列和其反向互补序列cttt是dof蛋白识别的核心序列。除了dof结构域外，dof蛋白包含的另一个主要的结构域是位于c末端的调控结构域。与保守的dof结构域不同，转录调控结构域的氨基酸序列较为多变，不具保守性，它很可能通过与不同类型调控蛋白或物质的反应，受不同途径信号的调控而激活或抑制基因的转录。这种多样性可能是dof功能多样性的基础之一。

矮牵牛(petuniahybrida)属茄科(solanaceae)碧冬茄属(petunia)，是世界上最重要的园艺观赏植物之一，因生长周期短，遗传背景清晰，生长周期短，可进行种子、扦插、嫁接等繁殖，一直以来作为研究花卉基因功能与花发育分子机制的模式植物。从矮牵牛中分离并克隆相关的dof基因并揭示其功能，有利于研究dof基因家族在植物生长发育中的分子调控机理，以进一步应用于植物的性状改良。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种矮牵牛花药发育相关基因phdof4。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述矮牵牛花药发育相关基因phdof4的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种矮牵牛花药发育相关基因phdof4，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述的矮牵牛花药发育相关基因phdof4的表达蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

含有所述的矮牵牛花药发育相关基因phdof4的载体、重组菌或细胞。

优选地，所述的矮牵牛花药发育相关基因phdof4的载体，为peasy-blunt-phdof4或phdof4-rnai。

所述的矮牵牛花药发育相关基因phdof4在调控植物花药育性或植物形态中的应用。

优选地，所述的花药发育相关基因phdof4在调控植物花药育性中的应用，包括如下步骤：

1)构建含有矮牵牛花药发育相关基因phdof4的载体；

2)将所构建的矮牵牛花药发育相关基因phdof4的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到花药败育的转基因植物株系。

优选地，所述的花药发育相关基因phdof4在调控植物形态中的应用，包括如下步骤：

1)构建含有矮牵牛花药发育相关基因phdof4的载体；

2)将所构建的矮牵牛花药发育相关基因phdof4的载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到叶色变浓绿、植株变矮小或节间缩短的转基因植物株系。

优选地，所述的含有矮牵牛花药发育相关基因phdof4的载体是phdof4-rnai。

优选地，所述的植物为矮牵牛。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

(1)本发明公开了一种矮牵牛phdof基因家族成员phdof4基因。其核苷酸序列如seqidno.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示；

(2)本发明基于前期的研究和生物信息学分析软件初步预测了基因功能，通过基因克隆得到基因序列全长，通过real-timepcr确定其表达模式，通过亚细胞定位、构载体及转基因等技术鉴定和分析了其基因功能，发现转基因植株相对于ck，叶色浓绿、花期提前、植株更加矮小、节间缩短，在花药发育方面出现花药变小、畸形、败育等现象，对转基因植株进行了套袋收种，植株的结实率大大降低，子房变小，每果种子量大大减少。上述结果表明，phdof4在花药发育方面发挥了重要调控作用；

(3)本发明矮牵牛phdof4基因可为进一步研究矮牵牛花药发育的分子机制提供参考，为利用基因工程调控植物雄性生殖器官——花药的发育提供有效的分子工具。能够有助于构建矮牵牛雄性不育系，从而促进杂种优势利用，对矮牵牛品种改良以及新品种培育具有实际应用价值。

附图说明

图1为phdof4基因在烟草叶片中的亚细胞定位图；上半部图为携带35s：：gfp：空载体pcamblal300的农杆菌gv3101在烟草下表皮细胞的表达情况图；下半部图为携带35s：：gfp-目的基因phdof4的农杆菌gv3101在烟草下表皮细胞的表达情况图；

图2为phdof4-rnai载体转化矮牵牛植株pcr阳性检测结果图；ck1：阳性对照；ck2：阴性对照；

图3为phdof4-rnai载体转化矮牵牛表型图；

图4为phdof4-rnai载体转化矮牵牛花药的扫描电镜图，ck：野生型；

图5为phdof4-rnai载体转化矮牵牛花药的半薄切片图，ck：野生型；

图6为phdof4-rnai载体转化矮牵牛不同组织部位的phdof4表达分析图，图中，bud：花芽，stem：茎，ck：野生型；

图7为phdof4-rnai载体转化矮牵牛的叶绿素含量测定结果图，ck：野生型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法，均可参照分子生物学常规实验方法进行，或者按照试剂盒或说明书进行。

实施例1：矮牵牛phdof4基因的cdna克隆与鉴定

植物材料：矮牵牛(petuniahybrida)幻想“w115”品种由南京林业大学风景园林重点实验室提供，播种于南京林业大学风景园林学院生长室，自然条件下播种生长。

基因来源：基于前期课题组已有的矮牵牛花药转录组数据库(未发表)挑选而出并命名，再结合primerpremier5.0设计全长特异性引物。

phdof4-f：5′-aggagacgaggatgatgataagg-3′；

phdof4-r：5′-cactgccatcctgtctgatactt-3′。

从矮牵牛总rna中扩增phdof4基因，具体包括如下步骤：

1)取50-100mg前期保存于-80℃的矮牵牛根、茎、叶及花冻样，采用北京艾德莱公司rna提取试剂盒中的液氮研磨说明书进行总rna的提取。

2)然后用tbe凝胶电泳检测rna质量，用分光光度计检测rna质量。以获得的总rna为模板，按照北京全式金公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cdna第一链，作为目的基因全长扩增模板。

反转录体系(20μl)：1μlgdnaremover，1μlanchoredoligo(dt)18primer(0.5μg/μl)，1μltransscriptrt/rienzymemix，10μl2×txreactionmix，7μltotalrna。

反转录反应条件：42℃30min，85℃5s。

3)将上述cdna稀释10倍，以北京takara生物技术有限公司的primestar高保真酶进行目的基因全长扩增，反应结束后，用1％的琼脂凝胶电泳检测目的条带，如果条带亮且片段长度正确，则参考北京全式金公司提供的切胶回收试剂盒easypureqcickgelextractionkit说明书进行产物回收，如果条带较弱但是片段长度正确，则进行产物富集后再回收。

目的基因全长扩增的反应体系(20μl)具体为：1μlcdna，1μlantisenseprimer(phdof4-f)(10mm)，1μlsenseprimer(phdof4-r)(10mm)，10μlprimestar高保真酶，7μl1ststrandcdna。反应条件：98℃10s；58℃25s，72℃1min，35个循环；72℃5min，16℃∞。

4)最终得到dna全长片段，将其克隆到peasy-blunt载体后，转化大肠杆菌，检测阳性重组克隆后测序，测序获得具有完整编码区的矮牵牛phdof4的cdna序列如seqidno.1所示，长度为1282bp，其编码的蛋白质氨基酸序列如seqidno.2所示，长度为424aa。具体反应体系和反应条件如下：

克隆体系(5μl)：4μlpcrproduct，1μlpeasy-blunt。

室温反应5min后于pcr中进行25℃为时15min恒温克隆反应完成连接。最后将其转化入大肠杆菌trans-t1进行保菌保存。

实施例2：矮牵牛phdof4基因的亚细胞定位

以生长周期40d的本氏烟草作为实验材料。

根据实施例1得到的phdof4全长cdna序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，引物设计如下：

f：5′-ctgcaggggcccggggtcgacatggaacctacgaccggaaat-3′；

r：5′-gcccttgctcaccatggtacctaagctctcattgaaatttgatgacc-3′。

利用上述的引物进行半定量，从矮牵牛cdna中分离包含完整ofr的phdof4。将其orf与pcambia1300中的gfp报告基因5′端融合成一个gfp：：pcambia1300-phdof4嵌合基因，构建了质粒gfp：：pcambia1300-phdof4。酶切验证后，将其和空载体pcambia1300分别通过电转法转化农杆菌，再通过瞬时转化农杆菌并注入烟草叶，结果表明矮牵牛phdof4为定位于细胞核和细胞膜的转录因子(图1)。

瞬时转化农杆菌具体步骤：

1)配菌液缓冲液：10mm.l^-1mgcl2，10mm·l^-1mes，150μm·l^-1乙酰丁香酮。

2)成功转化农杆菌的gv3101、pcambia1300-phdof4融合表达载体、pcambia1300空载、p19辅助载体放在冰上融化。分别取50μl加30mllb液体培养液(含有100mg·l^-1kana)于28℃，200rpm/min摇床避光培养到od600在0.6-1.0之间。在4℃，5000r·min^-1下离心5min收集菌体，用缓冲液对菌体进行重悬，最后将重悬菌液按照比例(od600比值为7∶5)混合，于室温静置2-3h。

3)用1ml医用注射器将含混合菌液注入本式烟草叶背面，培养箱中培养2-3d，激光共聚焦显微镜下观察携带pcambia1300-phdof4的农杆菌gv3101注射烟草下表皮细胞的表达情况，分别于gfp绿色荧光场(gfp)、叶绿体粉色荧光场(chloroplast)、白光场(brightfield)和前三者混合场(merged)下观察，同时以携带空载体pcambla1300的农杆菌gv3101注射烟草下表皮细胞的表达情况为对照，确定矮牵牛phdof4蛋白的亚细胞定位情况。如图1所示，结果表明：表明矮牵牛phdof4为定位于细胞核和细胞膜的转录因子。

实施例3：矮牵牛phdof4基因的基因功能鉴定

1)rnai载体构建，取经测序无变异位点和双酶切验证无误的v097：：phdof4重组质粒与干涉表达载体v139进行lr反应，并进行双pcr菌检，检测正确dof4-rnai-v139的重组质粒用xbai和hindiii限制性内切酶进行单酶切验证，xbai酶切后会产生250bp，500bp，750bp三条带，hindiii酶切则产生一条大于2000bp小于载体长度的一条带，并用凝胶电泳检测。将验证成功的dof4-rnai-v139的重组质粒采用电转法转化eha105，并将连上目的基因的重组质粒和v139载体重组质粒转化农杆菌eha105，为后续转化转基因做准备。相关反应体系和反应条件具体如下：

双酶切反应体系(50μl)：1μl质粒，1μlquickcut酶i，1μlquickcut酶ii，5μl10×quickcutbuffer，ddh2o补至50μl。

上述体系配好后，涡旋混匀，瞬时离心，放置于37℃恒温水浴锅反应1h，最后用1.5％琼脂凝胶检测双酶切情况，并进行切胶回收，最后用核酸测定仪检测回收产物浓度，并用1％琼脂凝胶检测回收是否正确。

rnai载体构建lr重组反应：

取经测序无变异位点和双酶切验证无误的v097：：phdof4重组质粒与干涉表达载体v139进行lr反应，反应体系和具体操作如下，

lr反应体系：25-75ng中间载体v097，小于75ng空载v139，1μllrclonase^tmii，ddh2o补至5μl

涡旋混匀，短暂离心，置于25℃反应6h。进行转化大肠杆菌，方法如前转化过程，在含有spe抗性的板子上培养，双pcr菌检，检测引物：35sf+genef和t35sr+genef

rnai单酶切验证体系如下：

将上述酶切体系放于37℃反应30min-1h，凝胶电泳检测。

注：xμl＝1000ng/质粒浓度(ng·μl^-1)

2)矮牵牛的遗传转化

采用电转法将构建好的phdof4-rnai载体叶盘法转化矮牵牛。

先将构建好的携带phdof4-rnai载体的农杆菌放在冰上融化，取20μl菌液加入30ml新鲜液体lb培养液(含有100mg·l^-1卡那霉素)，摇菌到od600值为0.4。转移到30ml无菌无酶离心管，5000rpm/min4℃10min，收集菌液。向离心管中加入30mllb液体培养液(不含抗生素)，28℃200rpm/min震荡培养2h。

在矮牵牛顶端取几片嫩叶，表面用75％酒精消毒10s，用ddh2o清洗3-5次，在浸入0.1％氯化汞消毒杀菌30min，再用ddh2o清洗3-5次。将叶片剪成5mm的小方块浸泡在上述配好的溶液中10min，最后将表面菌液吸除干净放在共培养培养基中培养3d。共培养结束后，依次转到筛选培养基、壮芽培养基、生根培养基培养，最终完成转化并进行移栽。

3)矮牵牛的阳性验证

将获得的转基因植株进行dna、rna验证(图2)，表明所检测的转基因植株为阳性。进一步观察阳性转基因植株发现，转基因植株开花时间提前，此外，如图3所示，相对于ck，叶色显著浓绿，植株更加矮小，并且出现节间缩短现象；在花药发育方面，转基因植株出现花药变小、畸形和败育的现象，花粉管萌发和花粉活力检测均证实了这个结果。此外，对花药进行了电镜扫描和半薄切片(图4，图5)，观察到转基因植株的花粉粒数量大大减少，且花粉粒多呈畸形和干瘪，萌发孔几乎不见，花粉粒表面孔纹排列紧密且杂乱，且花粉粒的绒毡层细胞排列很松散，有提前降解的趋势，小孢子母细胞的形状和大小也很不规则。

为了验证转基因植株花药败育表型与phdof4基因表达量的关系，我们以野生型矮牵牛植株作为对照，通过real-timepcr验证phdof4基因在转基因植株中的表达，表明干涉phdof4基因表达的矮牵牛阳性株系存在着基因表达强弱的情况，7个转基因株系l14、l6、l8、l10、l11、l19、l20存在明显表达量的差异(图6)，且表达量与植株的表型相关，phdof4基因在l14株系中表达量最低，该株系花药败育更加明显，以上结果表明phdof4基因调控了矮牵牛花药的育性，phdof4基因表达量降低会导致矮牵牛花药败育。

对矮牵牛叶色浓绿，花粉败育的表型进行进一步的验证，采用分光光度法测定了叶绿素含量(图7)，用醋酸洋红检测了花粉活力，用离体培养液检测了花粉萌发率，进行了花粉形态扫描电镜和半薄切片，以上结果都验证了我们观察的表型变化。

序列表

<110>南京林业大学

<120>一种矮牵牛花药发育相关phdof4基因及其应用

<130>100

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1282

<212>dna

<213>petuniahybrida

<400>1

aggagacgaggatgatgataaggatcagatggaacctacgaccggaaatgagttgcagga60

tgagaattcagatctaacgaaaagtgatatcataaaagagccacctgttgataatgactg120

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<210>2

<211>424

<212>prt

<213>petuniahybrida

<400>2

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151015

gluleuglnaspgluasnseraspleuthrlysseraspileilelys

202530

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115120125

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130135140

tyrproasnglyileglnglnprovalleuvalpheglyserhisala

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165170175

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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325330335

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340345350

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<211>23

<212>dna

<213>phdof4-f引物序列(artificial)

<400>3

aggagacgaggatgatgataagg23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>phdof4-r引物序列(artificial)

<400>4

cactgccatcctgtctgatactt23

<210>5

<211>42

<212>dna

<213>phdof4f引物序列(artificial)

<400>5

ctgcaggggcccggggtcgacatggaacctacgaccggaaat42

<210>6

<211>47

<212>dna

<213>phdof4r(artificial)

<400>6

gcccttgctcaccatggtacctaagctctcattgaaatttgatgacc47