一株嗜盐四联球菌及其在酱油生产中的应用的制作方法

本发明涉及一株嗜盐四联球菌及其在酱油生产中的应用，属于微生物食品领域。

背景技术：

酱油是我国的传统发酵调味品，我国是酱油生产及出口大国。酱油是一种以大豆、小麦、麸皮等为原料，由多种微生物共同作用，经长期发酵而形成的具有独特风味的调味品。酱油中含有多种可溶性蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、醇类、酯类、有机酸以及丰富的维生素、无机盐等，营养价值十分丰富。

酱油酿造过程中微生物群落组成、演替和功能代谢对酱油品质有着重要的影响。参与酱油酿造的微生物种类繁多，主要包括曲霉、酵母菌、乳酸菌以及其他细菌。嗜盐四联球菌(tetragenococcushalophilus)是一类参与酱油发酵的耐盐乳酸菌。

现有技术中已有嗜盐四联球菌(tetragenococcushalophilus)生产风味物质的相关报道，但现有的嗜盐四联球菌(tetragenococcushalophilus)在酱油发酵过程中产风味物质的种类较少且含量较低，对酱油风味的增加能力较弱。

因此，发明人设想在酱油发酵过程中筛选出一株能够提高酱油风味的嗜盐四联球菌，以期来提高酱油风味等方面的品质。

技术实现要素：

本发明提供了一株提高酱油品质的嗜盐四联球菌(tetragenococcushalophilus)r44，已于2020年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为cctccno:m2020022。

本发明提供了一种所述嗜盐四联球菌r44的培养方法，所述方法为：将嗜盐四联球菌r44接种至mrs培养基中，20～40℃静置培养50～70h进行活化；将活化后的菌株接种至新鲜mrs培养基中，20～40℃静置培养4～7天。

本发明提供了一种强化酱油中嗜盐四联球菌r44的方法，所述方法是将嗜盐四联球菌r44添加至酱醪中进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述嗜盐四联球菌r44添加的终浓度至少为1.0×10⁶cfu·g^-1酱醪。

本发明提供一种增加酱油风味的方法，所述方法是在酱醪发酵过程中添加所述嗜盐四联球菌r44。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体为：用豆粕、孢子粉、小麦粉制备得到成曲；将成曲与盐水混合得到酱醪，将酱醪在25～40℃发酵，在发酵的第10～20天以1.0×10⁵～1.0×10⁸cfu·g^-1酱醪的添加嗜盐四联球菌r44，酱醪总共发酵70～80天。

在本发明的一种实施方式中，所述嗜盐四联球菌r44的添加量为1.0×10⁵～1.0×10⁷cfu·g^-1酱醪

本发明提供了一种食品发酵剂，具体实施方法是：取200～600μl的嗜盐四联球菌r44接种于10～30mlmrs液体培养基中，30～40℃下活化2至3代，待嗜盐四联球菌r44达到1.0×10⁶cfu/ml以上活菌数时，2000～6000rpm下离心15～25min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度为1.0×10⁵～1.0×10¹⁰cfu/ml时，真空冷冻干燥处理，所得即为发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为0.1～2.0％(w/v)的生理盐水和/或ph值为5～8的0.1～1m磷酸盐缓冲液，冷冻保护剂为10～20％(w/v)的甘油。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为0.9％(w/v)的生理盐水和/或ph值为7的0.2m磷酸盐缓冲液，冷冻保护剂为15％的甘油。

本发明提供了一种利用发酵剂制备酱油的方法，所述方法为将发酵剂以1～10％的添加量添加至酱醪中，在30～40℃中进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将发酵剂以2～4％的添加量添加至酱醪中。

本发明提供了一种所述嗜盐四联球菌r44在制备豆粕发酵食品中的应用，所述豆粕发酵食品包括豆瓣酱、酱油。

本发明提供了一种所述发酵剂在制备豆粕发酵食品中的应用，所述豆粕发酵食品包括豆瓣酱、酱油。

本发明的有益效果

本发明的公开的嗜盐四联球菌(tetragenococcushalophilus)r44，耐盐，具有很好的增香效果，可以提升酱油的风味，酱油中的挥发性物质总量提高了154.5％，其中醇类、酸类、酯类、酚类、醛类和杂合类分别提高了159.2％、206.4％、373.8％、123.6％、62.3％和349.6％。酱油中总氨基酸含量比对照提高了14.6％，甜味氨基酸提高了13.4％。

生物材料保藏

tetragenococcushalophilusr44，于2020年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:m2020022。

附图说明

图1为嗜盐四联球菌r44发酵的酱油中主要挥发性物质含量。

具体实施方式

配制mrs培养基：蛋白胨10.0g·l^-1、牛肉粉5.0g·l^-1、酵母粉4.0g·l^-1、葡萄糖20.0g·l^-1、磷酸氢二钾2.0g·l^-1、乙酸钠5.0g·l^-1、柠檬酸三铵2.0g·l^-1、硫酸镁0.2g·l^-1、硫酸锰0.1g·l^-1、吐温-801.0g·l^-1。使用时添加100g·l^-1nacl，调ph至7.0。

实施例1：强化嗜盐四联球菌r44的酱油发酵

(1)菌株培养

嗜盐四联球菌r44的培养：从-80℃冰箱中取出保存的嗜盐四联球菌r44，接种至mrs培养基中，30℃静置培养60h，按1％体积比的接种量转接至新鲜mrs培养基中，30℃静置培养至od600达到1.2。

(2)酱油发酵工艺

制曲工艺：将豆粕用1.2倍质量的水浸泡2h，在121℃下灭菌15min，冷却至室温；按原料干重(豆粕和小麦颗粒混合后总重)接入1.5‰质量比米曲霉孢子粉，先把孢子粉与适量炒熟的小麦颗粒混合均匀，然后再和豆粕、小麦颗粒(豆粕、小麦颗粒的质量比为6:4)充分拌匀；在生化培养箱中进行30℃培养，制曲过程中湿度控制在90％左右，适时翻曲，制曲60h，曲料表面长满黄绿色菌丝即为成曲。

发酵工艺：将成曲与20％(w/v)的盐水以体积比1:1.8的比例混合；将混合后的酱醪分装入2l坛子中，30℃发酵75d；发酵第1周每天搅拌一次，第2-6周每两天搅拌一次，后期每周搅拌两次。

菌株的添加方式：酱醪发酵第15天时添加嗜盐四联球菌r44，使菌株在酱醪中的终浓度为1.0×10⁶cfu·g^-1酱醪。

实施例2：嗜盐四联球菌r44数量的测定

为了确定可以通过添加菌株起到在酱油发酵过程强化嗜盐四联球菌r44的作用，对嗜盐四联球菌r44的数量采用平板计数法进行测定。称取1g酱醪倒入盛有灭菌玻璃珠和99ml生理盐水锥形瓶中混匀，梯度稀释(分别稀释为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)，稀释后涂布到mrs(含0.1g·l^-1纳他霉素，100g·l^-1nacl)平板，30℃培养4-6d后计数。嗜盐四联球菌r44为兼性厌氧菌，平板培养周期长、菌落小。

结果表明添加嗜盐四联球菌r44，可使酱醪中该类菌数量比未添加嗜盐四联球菌球菌r44对照增加1.9-3.0个数量级，最高达到1.0×10⁸cfu·g^-1，后期逐渐减少，稳定在1.0×10⁷cfu·g^-1。因此，添加嗜盐四联球菌r44可以起到在酱油发酵过程中提高该菌浓度，起到强化该菌株的作用。

实施例3：嗜盐四联球菌r44对酱油总酸含量的影响

在第15、20、25、30、35、40、45、60和75天进行取样。分别取100g酱醪于离心管中，12000r·min^-1离心30min，取上清液并用孔径为0.22μm的滤膜过滤进行理化指标测定。酱醪总酸含量的测定采用酸度计法(具体步骤参照h,tekina,musam.determinationoffattyacid,tocopherolandphytosterolcontentsoftheoilsofvariouspoppy(papaversomniferuml.)seeds.[j].grasasyaceites.2009,60(4):375-381.)。

结果发现，添加嗜盐四联球菌r44可使酱油中总酸含量增加10.4％。

表1不同时间酱油样品中的总酸含量(g/kg)

注：control为不添加嗜盐四联球菌r44的酱油发酵，t是添加嗜盐四联球菌r44的酱油发酵。

实施例4：嗜盐四联球菌r44对酱油游离氨基酸含量的影响

游离氨基酸对发酵食品尤其是以蛋白为主要发酵基质的大豆发酵食品独特滋味和香气的形成具有重要贡献，是衡量酱油品质的主要理化指标之一。

游离氨基酸测定采用高效液相色谱法(具体步骤参照仇钰莹.浓香型白酒中氨基甲酸乙酯形成途径解析[d].江南大学硕士学位论文,2016.)。取1ml酱油样品，用5g/l的三氯乙酸稀释20倍后，常温下避光放置30min，用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤取滤液进行测定。

具体结果如表2所示：添加嗜盐四联球菌r44的酱油中总氨基酸含量提高了14.6％，其中谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸和精氨酸分别提高了9.3％、20.4％、13.6％和178.5％。其中谷氨酸是酱油中重要的鲜味来源；丙氨酸是酱油一种特别是自然的芳香物质。为进一步分析嗜盐四联球菌r44对酱油中游离氨基酸的贡献，比较了强化嗜盐四联球菌r44对酱油中甜味氨基酸(甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸和丝氨酸)含量的影响，发现甜味氨基酸提高了13.4％。

表2酱油中游离氨基酸的含量

注：control为不添加嗜盐四联球菌r44的酱油发酵，t是添加嗜盐四联球菌r44的酱油发酵。

实施例5：嗜盐四联球菌r44对酱油中挥发性物质的影响

通过spme-gc-ms分析方法(具体步骤参照胡传旺.酱油发酵过程微生物群落解析及功能研究[d].江南大学硕士学位论文,2017.)研究了添加嗜盐四联球菌r44对酱油风味的影响。

对2种酱油样品(即添加嗜盐四联球菌r44和不添加嗜盐四联球菌r44发酵得到的酱油样品)进行检测，在添加嗜盐四联球菌r44发酵得到的酱油样品中共检测出79种挥发性物质，这些化合物包括15种醇、17种醛、7种酸、16种酯、7种酮类、6种酚和11种杂合化合物；而对照酱油样品中共同检测到的挥发性物质只有43种。对酱油样品的挥发性物质总量分析发现，添加嗜盐四联球菌r44使酱油样品挥发性物质总量较对照增加154.5％，其中醇类、酸类、酯类、酚类、醛类和杂合类分别提高了159.2％、206.4％、373.8％、123.6％、62.3％和269.48％。

表3不同酱油样品中的各类挥发性物质含量(g/kg)

添加嗜盐四联球菌r44可以使酱油中乙醇、异戊醇、异丁醇、苯乙醇、3-甲硫基丙醇、乙酸、异戊酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乳酸异戊酯、3-甲基丁醛、己醛、壬醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、2-戊酮、2.6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等物质的含量增加；其中，愈创木酚、4-乙基愈创木酚和对乙基愈创木酚含量分别是对照的2.1倍、1.6倍和2.4倍；有6种风味物质(3-甲硫基丙醇、异戊酸、乳酸异戊酯、dl-白氨酸乙酯、苯甲酸乙酯、4-乙基愈创木酚)在单独添加嗜盐四联球菌r44的酱油中可以检测到，而在对照组中没有检出。

表4不同酱油样品中主要挥发性物质含量(g/kg)

注：control为不添加嗜盐四联球菌r44的酱油发酵，t是添加嗜盐四联球菌r44的酱油发酵。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。