拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的应用。

背景技术：

植物叶子的锯齿状边缘是一种在遗传和环境方面受到调节的形态特征，在野生型的拟南芥叶中，锯齿仅限于叶的基部。拟南芥中的叶片形状通过利用基于pin的生长素输出蛋白cuc2转录因子系统的边缘中的图案化事件来调节，以定义促进和延迟生长的区域，从而产生形态改变。然而植物叶片的锯齿状边缘的发生难以通过肉眼界定。叶片锯齿状边缘会对植物的生长有一定的影响，分子标记辅助育种技术具有方便快捷、周期短、准确性高、不受种植环境影响等优点，在近年深受农艺工作者的青睐。因此，利用分子生物学手段开发并应用拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记，不但可以对特定拟南芥进行快速识别和品种保护，而且可以结合杂交育种、遗传转化等技术，使基因聚合的分子设计育种成为可能。

近年来，发现了是拟南芥(arabidopsisthaliana)中的第2类kn1-like基因knat3有三种主要的表达模式，分别是：(1)在早期器官发育过程的幼叶，芽和花梗中表达；(2)在发育过程中两个器官交界处及其附近表达，包括幼苗的下胚轴-根边界，成熟花中的花药-细丝连接处，以及伸长的长角果中的胚珠-细丝和花序-长角果；(3)在成熟组织中表达，例如伸长的长角果，成熟叶片的叶柄和大部分根。不同的表达模式可能表明knat3在植物中起着几种不同的作用，因此对该基因进行研究有利于进一步对拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因功能性分子标记进行研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记及应用，旨在解决现有技术中无法准确对拟南芥叶片锯齿状边缘进行准确定位和控制的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记在表达拟南芥叶片形成锯齿状边缘性状的应用；其中，所述功能性分子标记物为knat3，所述knat3的启动子基因序列如seqidno.1所示，所述knat3的编码序列如seqidno.2所示。

以及，一种引物对，所述引物对用于扩增表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物，所述功能性分子标记物为knat3，且所述引物对包括与knat3-f启动子基因序列结合的上游引物和与所述knat3-r启动子基因序列结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如seqidno.3所示，所述下游引物的序列如seqidno.4所示。

以及，种用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。

本发明所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物knat3，通过应用所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物knat3，进而对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行表达，能够快速，准确，高效地鉴定拟南芥叶片边缘地形状，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也为种质资源鉴定中分子标记提供了重要的途径。

本发明所述的用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的引物对，通过应用所述引物对，进而对所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记进行克隆，进而实现对拟南芥叶片锯齿状边缘相关进行表达及性状分析的作用。

本发明所述的用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包括引物对，利用所述引物对，进而对所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物进行克隆，进而实现采用所述试剂盒对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行表达及性状分析的作用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的knat3p:gus在拟南芥第6片莲座叶2mm发育时期gus染色图。

图2是本发明实施例提供的knat3p:gus在拟南芥第6片莲座叶3mm发育时期gus染色图。

图3是本发明实施例提供的knat3p:gus在拟南芥第6片莲座叶4mm发育时期gus染色图。

图4是本发明实施例提供的knat3p:gus在拟南芥第6片莲座叶6mm发育时期gus染色图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明实例提供一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记在表达拟南芥叶片形成锯齿状边缘性状的应用；其中，所述功能性分子标记物为knat3，所述knat3的启动子基因序列如seqidno.1所示，所述seqidno.1如下：

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具体的，所述knat3的编码序列如seqidno.2所示，所述seqidno.2如下：

atggcgtttcatcacaatcatctctcacaagacctctccttcaatcatttcaccgaccaacaccaacctcacctccgcaaccgcctcctcctcctccgcaacagcaacaacatttccaagaagcaccgcctcctaattggttaaacacagcgcttcttcgttcctcagataacaacaataacttcctcaacctccacacagccaccgctaacaccacaaccgcaagcagctccgattctccttcctccgccgccgccgccgccgctgctaaccagtggctatctcgctcctcctctttcctccaacgaaacaacaacaacaacgcttccatagtcggagatgggatcgatgatgtcaccggaggagcagacactatgattcagggagagatgaaaaccggcggtggagaaaacaaaaacgacggcggaggagctacggcggcggatggagtagtgagctggcagaatgcgagacacaaggcggagatcctttcgcatcctctttacgagcagcttttgtcggcgcacgttgcttgtttgagaatcgcgactccggttgatcagcttccgagaatcgatgctcagcttgctcagtctcaacacgtcgtcgctaaatactcagctttaggcgccgccgctcaaggtctcgtcggcgacgataaagaacttgaccagttcatggtatataaatttcagatttttttgttctataattttataattaacgatttcataattatacttagcacaaattttaataatacacaccgacttaggtttcttgatttttgaaatcttaaaatattaaaatcaagatttgtgtttttagggataaacaagactaaaatcccaaaaaaagagcttatgatataataatggtcatgatgatgaagaaaatacaaattttgttctttgtgtttattgtgtgtttgattaatgttttttttatggtgtagacacattatgtgttgctactgtgttcatttaaagagcaattgcaacaacatgtgcgtgttcatgcaatggaagctgtgatggcttgttgggagattgagcagtctcttcaaagcttaacaggtgagaaaatgaatcctgtgattagctcatgaatccaatagttagttttatgacattgacaagttttgtgttttattggtgagattaggagtgtctcctggagaagggatgggagcaacaatgtctgacgatgaagatgaacaagtagagagtgatgctaatatgttcgatgggggattagatgtgttgggttttggtcctttgattcctactgagagtgagaggtcgttgatggaaagagttagacaagaacttaaacatgaactcaaacaggtaataatcaacaaacttgttctttgaactagttcatgaactaacaatgtagagggctttgtcttgttgatgaaaagggttacaaggagaagatagtagacataagagaggagatattaaggaagagaagagctgggaagttaccaggagataccacctctgttctcaaagcttggtggcaatctcattccaaatggccttaccctactgtgagttcactcatctaacatctctttataacttcttcaagttcattcattgagccataaccaaatattggtttgtaggaggaagataaggcgaggttggtgcaagagacaggtttgcagctaaaacagataaacaattggttcatcaatcagagaaagaggaactggcatagcaatccatcttcttccactgtattgaagaacaaacgcaaaaggtattattatactttaatatagtcttgtaacataaccgaaaaacttatggatcggactcaaagaagactgaaacttttgtttgtctgatgaaagcaatgcaggtgacaatagcggaagagagcggttcgcgtagaaacaacaaacatatgatgtgaattggggaggtggaagatgggatttgaaagcagggttttagggatttaaagttgagaattttatggaggagtttggattatacagagagaggggacagtattagaaagtaactttttgtgcaattacatagtaacgtagtttggttatgtgattatgcccatatattttattaagtagcacacaaaccaaaaagaaaatatgaaaactgaagatgcaggcttttgtttaatgttttttgtttgtttgtctgcatgagttttttttttatgaaccatcagataatcatcatcatcatccataatatatcttgtgaataaagatagtgagagaggagaacattgggatgcacaagttttcttaatctactagtatatgttacgcattgaccaggtgcatatgttaatttgtatcgcaccacttggttagcttaatctatgtgactattatacagtatatgtttcg。

本发明所述的拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物knat3，通过应用所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物knat3，进而对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行表达，能够快速，准确，高效地鉴定拟南芥叶片边缘地形状，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也为种质资源鉴定中分子标记提供了重要的途径。

相应的，本发明提供了一种引物对，所述引物对用于扩增表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物，所述功能性分子标记物为knat3，且所述引物对包括与knat3-f启动子基因序列结合的上游引物和与所述knat3-r启动子基因序列结合的下游引物；其中，所述上游引物的序列如seqidno.3所示，所述下游引物的序列如seqidno.4所示。

其中，所述上游引物的序列如seqidno.3所示，所述seqidno.3如下：

5‘-cgggatcctattatgggtatgtggaggggaac-3’。

所述下游引物的序列如seqidno.4所示，所述seqidno.4如下：

5‘-gttcggtgaaatgattgaaggagag-3’。

本发明所述的用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记的引物对，通过应用所述引物对，进而对所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记进行克隆，进而实现对拟南芥叶片锯齿状边缘相关进行表达及性状分析的作用。

相应的，本发明还提供一种用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。

优选的，所述引物对包括与knat3-f启动子基因序列结合的上游引物和与所述knat3-r启动子基因序列结合的下游引物。

其中，所述上游引物的序列如seqidno.3所示，所述seqidno.3如下：

5‘-cgggatcctattatgggtatgtggaggggaac-3’。

所述下游引物的序列如seqidno.4所示，所述seqidno.4如下：

5‘-gttcggtgaaatgattgaaggagag-3’。

本发明所述的用于表达拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物的试剂盒，所述试剂盒包括引物对，利用所述引物对，进而对所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物进行克隆，进而实现采用所述试剂盒对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行表达及性状分析的作用。

相应的，本发明还提供一种控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因的鉴定方法，所述鉴定方法如下：

s01.提取拟南芥植物的基因组dna；

s02.利用与所述knat3-f启动子基因序列结合的上游引物和所述与所述knat3-r启动子基因序列结合的下游引物对所述基因组dna进行扩增，构建拟南芥tskknat3-promoter-gus表达载体，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥col-o并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；

s03.对所述tskknat3-promoter-gus表达载体进行测序验证，分析所述阳性转基因植物叶片形状，鉴定控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因为功能性分子标记物knat3。

在上述步骤s01中，提取拟南芥植物的基因组dna，优选的，采用ctab法提取所述拟南芥植物的基因组dna。

在本发明优选实施例中，采用ctab法提取拟南芥的dna的方法包括如下步骤：

s011.在液氮中研磨拟南芥的幼嫩叶至粉末，收集800ul所述粉末于离心管中，加入800ul采用65℃预热处理得到的ctab提取液，混合得到第一混合液，将所述第一混合液在65℃的条件下保温处理30分钟；

s012.将保温处理得到的第一混合液加入比例为400：384：16的酚：氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第一混合上清液；

s013.在第一混合上清液中加入比例为768：32的氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第二混合上清液；

s014.在所述第二混合上清液中加入800ul异丙醇，混匀，室温静置10分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心15分钟，收集第三混合上清液；

s015.在所述第三混合上清液中加入800ul的70％乙醇溶液，混匀，再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集沉淀，加入30ul蒸馏水，混匀得到所述拟南芥dna。

在上述步骤s02中，利用与所述knat3-f启动子基因序列结合的上游引物和所述与所述knat3-r启动子基因序列结合的下游引物对所述基因组dna进行扩增，构建拟南芥tskknat3-promoter-gus表达载体，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥col-o并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；

具体的，利用与所述knat3-f启动子基因序列结合的上游引物和所述与所述knat3-r启动子基因序列结合的下游引物对所述基因组dna进行扩增，其中，所述上游引物的序列如seqidno.3所示，所述seqidno.3如下：5‘-cgggatcctattatgggtatgtggaggggaac-3’；所述下游引物的序列如seqidno.4所示，所述seqidno.4如下：5‘-gttcggtgaaatgattgaaggagag-3’。

进一步，对所述基因组dna进行扩增；优选的，所述pcr反应的体系如下：

再用bio-radpcr仪进行qpcr，运用三步法pcr扩增程序，程序如下：

采用上述pcr反应的体系和反应程序对所述基因组dna进行扩增，扩增得到所述功能性分子标记物knat3启动子基因序列。

进一步的，将所述功能性分子标记物knat3启动子基因序列和载体分别进行双酶切得到第一启动子基因序列和第一载体，将第一启动子基因序列和所述第一载体进行连接反应，构建得到克隆载体tskknat3-promoter。

优选的，所述第一载体选自tsk108载体；选择该载体进行试验，有利于后续进行试验。

优选的，将所述功能性分子标记物knat3启动子基因序列和载体分别进行双酶切得到第一启动子基因序列和第一载体的步骤中，所述限制性内切酶选自bamhi和ncoi。在本发明优选实施例中，所述双酶切的温度为36～37℃，所述双酶切的时间为30～35分钟。进一步优选的，当双酶切反应结束后，在80℃条件下处理5分钟，保证限制性内切酶失活，确保双酶切反应结束。

进一步，将第一启动子基因序列和第一载体进行连接反应，构建得到克隆载体tskknat3-promoter。优选的，将第一启动子基因序列和第一载体进行连接反应的步骤中，所述第一启动子基因序列与所述第一载体的摩尔比为(6～6.5):1。选择上述摩尔比进行连接反应，确保所述第一启动子基因序列与所述第一载体能够成功连接，构建得到克隆载体tskknat3-promoter。优选的，所述连接反应的条件如下：在25℃条件下，进行连接反应3小时。

优选的，将构建得到克隆载体tskknat3-promoter进行转化至大肠杆菌trans-t1感受态细胞中。优选的，所述转化方法包括如下步骤：

s021.将10ul克隆载体tskknat3-promoter加入解冻的大肠杆菌trans-t1感受态细胞中，冰浴20～30分钟得到感受态混合物；

s022.将所述感受态混合物放置于42℃条件下热激处理90秒，再进行冰浴4～6分钟；加入600ullb液体培养基混匀，放置于37℃摇床上50min-60min进行活化。

优选的，将活化好的感受态细胞去除，倒于lb(amp+抗性)的固体平板，干燥彻底后倒置过来于37℃恒温培养箱中培养12-16h。观察37℃烘箱里面的平板上长出的菌落克隆，选择特征为圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起和菌落间互相分开的大肠杆菌单克隆进行菌落pcr。优选的，所述菌落pcr的反应体系如下：

再用bio-radpcr仪进行qpcr，运用三步法pcr扩增程序，所述pcr扩增程序如下：

将鉴定出来的阳性菌落送至艾基生物技术有限公司测序。从tair数据库下载目的基因的核酸序列，并在musclealignment网站上将测序结果对照tair网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和tair的基因序列完全匹配则说明所述克隆载体构建成功。

进一步，将所述测序成功的克隆载体tskknat3-promoter与包含gus报告基因的tsk108载体进行lr反应，得到包含knat3-promoter融合gus的表达载体tskknat3-promoter-gus。

优选的，将所述克隆载体tskknat3-promoter与包含gus报告基因的第二载体进行lr反应，得到包含knat3-promoter融合gus的表达载体tskknat3-promoter-gus。

通过上述反应构建得到拟南芥tskknat3-promoter-gus表达载体。

具体的，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥col-o并进行培养及筛选得到阳性转基因植物。

在本发明优选实施例中，所述方法如下：

提取所述表达载体的目的质粒，将所述目的质粒通过农杆菌转化法得到已转化的表达载体的农杆菌菌液；将扩大培养好的已转化的表达载体的农杆菌菌液，在室温下，转速为6000g的条件下离心处理10min，除去上清液得到农杆菌沉淀，将所述沉淀悬浮于5％蔗糖渗透培养液中，使培养液的od600为0.8-1.0，再加入0.010％-0.015％silwetl-77，摇匀，制备得到农杆菌悬浮液；将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染40s；将侵染好的植株平放在铺有湿纸巾的黑色托盘里，遮光处理18-22h后，掀开盖子，将植株放置于人工培养室中，于22℃中连续光照培养得到转基因植物。

进一步，将所述转基因植物进行筛选得到阳性转基因植物；优选的，采用潮霉素抗生素培养基和pcr进行阳性种子的筛选。在本发明优选实施例中，所述筛选的步骤如下：将tl代种子先用75％的酒精浸泡，放在摇床清洗15min。将消毒后的种子均匀地铺展在潮霉素抗性的培养基表面，于4℃冰箱中放置2-3d后，移至人工培养室光照培养(培养室条件：22℃恒温、连续光照)。培养7-10d后可通过萌发的幼苗形态鉴定出转化子。提取抗性平板筛选出的转基因植物的dna，以该dna作为模板，以taqdna聚合酶作为dna聚合酶，开始进行pcr反应，所述pcr反应的体系和程序如下：。

再用bio-radpcr仪进行qpcr，运用三步法pcr扩增程序，所述pcr扩增程序如下：

通过上述反应，制备得到tskknat3-promoter-gus表达载体。

在上述步骤s03中，对所述tskknat3-promoter-gus表达载体进行测序验证，分析所述阳性转基因植物叶片形状，鉴定控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因为功能性分子标记物knat3。

具体的，对所述tskknat3-promoter-gus表达载体进行测序验证，将鉴定出来的阳性植株pcr产物送至艾基生物技术有限公司测序。从tair数据库下载目的基因的核酸序列，并在musclealignment网站上将测序结果对照tair网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和tair的基因序列，完全匹配则说明功能性分子标记物knat3的启动子基因序列被准确克隆，且制备得到植株为阳性转基因植物，所述阳性转基因植物即为将拟南芥tskknat3-promoter-gus表达载体成功转化的植物。

进一步，分析所述阳性转基因植物叶片形状，优选的，分析所述阳性转基因植物叶片形状的方法如下：将所述阳性转基因植物的叶片进行gus染色，分析所述阳性转基因植物叶片形状。

优选的，将所述阳性转基因植物的叶片进行gus染色的方法包括如下步骤：选取拟南芥莲座叶在2mm的gus染色工作液中于37℃温育12小时，再用75％乙醇连续洗涤进行脱色得到终产品，将所述终产品进行分析。

其中，阴性对照材料为白色，gus染色阳性材料为蓝色。所述gus染色阳性材料的蓝色斑点很稳定，在酒精中不褪色。使用蔡司(zeiss)研究级体式显微镜stereodiscover.v8观察拟南芥莲座叶的gus染色情况，拍照并获取图片。使用软件对图片进行进一步处理。

优选的，选用拟南芥低6片莲座叶进行分析比较，目的使为了保证能够明明显看出所述叶片边缘的形状。同时，由于其他植物进行控制鉴定时，均采用第6片叶片进行分析，故本发明采用第6片莲座也进行分析为了更好地进行对比。

具体的，分析所述阳性转基因植物叶片形状，鉴定控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因为功能性分子标记物knat3。通过分析可知，所述阳性转基因植物叶片形状为锯齿状边缘，即所述功能性分子标记物knat3为控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因。

进一步以具体实施例的内容进行说明。

一种控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因的鉴定方法：

提取拟南芥植物的基因组dna；利用与所述knat3-f启动子基因序列结合的上游引物和所述与所述knat3-r启动子基因序列结合的下游引物对所述基因组dna进行扩增，构建拟南芥tskknat3-promoter-gus表达载体，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥col-o并进行培养及筛选得到阳性转基因植物；对所述tskknat3-promoter-gus表达载体进行测序验证，鉴定所述阳性转基因植物叶片形状，分析所述功能性分子标记物knat3是否为控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因。

其中，采用ctab法提取拟南芥的dna的方法包括如下步骤：

在液氮中研磨拟南芥的幼嫩叶至粉末，收集800ul所述粉末于离心管中，加入800ul采用65℃预热处理得到的ctab提取液，混合得到第一混合液，将所述第一混合液在65℃的条件下保温处理30分钟；

将保温处理得到的第一混合液加入比例为400：384：16的酚：氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第一混合上清液；

在第一混合上清液中加入比例为768：32的氯仿：异戊醇的混合溶液，混匀，室温静置1分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集第二混合上清液；

在所述第二混合上清液中加入800ul异丙醇，混匀，室温静置10分钟；再在4℃/12000rpm的条件下离心15分钟，收集第三混合上清液；

在所述第三混合上清液中加入800ul的70％乙醇溶液，混匀，再在4℃/12000rpm的条件下离心2分钟，收集沉淀，加入30ul蒸馏水，混匀得到所述拟南芥dna。

进一步，构建拟南芥tskknat3-promoter-gus表达载体。

拟南芥tskknat3-promoter-gus表达载体的构建方法包括如下步骤：

以提取得到的拟南芥的dna为模板，采用与knat3-f启动子基因序列结合的上游引物和与所述knat3-r启动子基因序列结合的下游引物进行pcr反应扩增得到knat3启动子基因序列，所述pcr反应体系如下：

再用bio-radpcr仪进行qpcr，运用三步法pcr扩增程序，所述pcr扩增程序如下：

将所述knat3启动子基因序列和载体分别采用限制性内切酶bamhi和ncoli进行双酶切，所述双酶切的条件为：在37℃条件下双酶切处理30分钟后，在80℃条件下处理5分钟终止反应，得到第一knat3启动子基因序列和第一载体；

将第一knat3启动子基因序列和所述第一载体进行连接反应，所述连接反应中，第一knat3启动子基因序列和第一载体摩尔比为6：1的添加量进行混合，在25℃连接3h，构建得到克隆载体tskknat3-promoter；

将构建得到克隆载体tskknat3-promoter进行转化至大肠杆菌trans-t1感受态细胞中，所述转化方法包括如下步骤：将10ul克隆载体tskknat3-promoter加入解冻的大肠杆菌trans-t1感受态细胞中，冰浴20～30分钟得到感受态混合物；将所述感受态混合物放置于42℃条件下热激处理90秒，再进行冰浴4～6分钟；加入600ullb液体培养基混匀，放置于37℃摇床上50min-60min进行活化。

将活化好的感受态细胞去除，倒于lb(amp+抗性)的固体平板，干燥彻底后倒置过来于37℃恒温培养箱中培养12-16h。观察37℃烘箱里面的平板上长出的菌落克隆，选择特征为圆形边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起和菌落间互相分开的大肠杆菌单克隆进行菌落pcr，所述菌落pcr的反应体系如下：

再用bio-radpcr仪进行qpcr，运用三步法pcr扩增程序,所述pcr扩增程序如下：

将鉴定出来的阳性菌落送至艾基生物技术有限公司测序。从tair数据库下载目的基因的核酸序列，并在musclealignment网站上将测序结果对照tair网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和tair的基因序列完全匹配则说明所述克隆载体构建成功。

将所述克隆载体tskknat3-promoter与包含gus报告基因的第二载体进行lr反应，到包含knat3-promoter融合gus的表达载体tskknat3-promoter-gus。

进一步，将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥col-o并进行培养及筛选得到阳性转基因植物。将所述表达载体通过农杆菌转化法进行侵染植物拟南芥col-o并进行培养的具体方法如下：

提取所述表达载体tskknat3-promoter-gus的目的质粒，将所述目的质粒通过农杆菌转化法得到已转化的表达载体的农杆菌菌液；将扩大培养好的已转化的表达载体的农杆菌菌液，在室温下，转速为6000g的条件下离心处理10min，除去上清液得到农杆菌沉淀，将所述沉淀悬浮于5％蔗糖渗透培养液中，使培养液的od600为0.8-1.0，再加入0.010％-0.015％silwetl-77，摇匀，制备得到农杆菌悬浮液；将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染40s；将侵染好的植株平放在铺有湿纸巾的黑色托盘里，遮光处理18-22h后，掀开盖子，将植株放置于人工培养室中，于22℃中连续光照培养得到转基因植物。

进一步，鉴定所述阳性转基因植物叶片形状，通过所述阳性转基因植物叶片形状分析控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因。

将所述转基因植物进行筛选得到阳性转基因植物，采用潮霉素抗生素培养基和pcr进行阳性种子的筛选。在本发明优选实施例中，所述筛选的步骤如下：将tl代种子先用75％的酒精浸泡，放在摇床清洗15min。将消毒后的种子均匀地铺展在潮霉素抗性的培养基表面，于4℃冰箱中放置2-3d后，移至人工培养室光照培养(培养室条件：22℃恒温、连续光照)。培养7-10d后可通过萌发的幼苗形态鉴定出转化子。提取抗性平板筛选出的转基因植物的dna，以该dna作为模板，以taqdna聚合酶作为dna聚合酶，开始进行pcr反应，所述pcr反应的体系如下：

再用bio-radpcr仪进行qpcr，运用三步法pcr扩增程序,所述pcr扩增程序如下：

将鉴定出来的阳性植株pcr产物送至艾基生物技术有限公司测序。从tair数据库下载目的基因的核酸序列，并在musclealignment网站上将测序结果对照tair网站上的基因序列信息进行对照分析，直至测序得到的碱基和tair的基因序列，完全匹配则说明该植株为阳性的转基因植株。

进行gus染色，分析所述拟南芥叶片边缘的锯齿形状。

将所述阳性转基因植物的叶片进行gus染色的方法包括如下步骤：选取不同发育时期(2mm、3mm、4mm、6mm)的拟南芥第6片莲座叶在2mm的gus染色工作液中于37℃温育12小时，再用75％乙醇连续洗涤进行脱色得到终产品，将所述终产品进行分析。

使用蔡司(zeiss)研究级体式显微镜stereodiscover.v8观察拟南芥莲座叶的gus染色情况，拍照并获取图片。使用软件对图片进行进一步处理。

其中，gus染色阳性材料为蓝色。所述gus染色阳性材料的蓝色斑点很稳定，在酒精中不褪色。

分析所述阳性转基因植物叶片形状，鉴定控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因为功能性分子标记物knat3。

结果分析：

使用蔡司(zeiss)研究级体式显微镜stereodiscover.v8观察实施例5制备得到的拟南芥莲座叶的gus染色情况，图1是knat3p:gus在拟南芥第6片莲座叶2mm发育时期的，可以看出叶片有锯齿形边缘发生；图2是knat3p:gus在拟南芥第6片莲座叶3mm发育时期的，可以看出叶片有锯齿形边缘发生；图3是knat3p:gus在拟南芥第6片莲座叶4mm发育时期的，可以看出叶片有锯齿形边缘发生；图4是knat3p:gus在拟南芥第6片莲座叶6mm发育时期的，可以看出叶片有锯齿形边缘发生。分析得到所述阳性转基因植物的叶片形状为锯齿状，进而鉴定得到所述功能性分子标记物knat3为控制拟南芥叶片锯齿状边缘的相关基因。

通过应用所述拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因的功能性分子标记物knat3，进而对拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因进行控制，能够快速，准确，高效地鉴定拟南芥叶片边缘地形状，为拟南芥品种的筛选提供了依据，同时也为种质资源鉴定中分子标记提供了重要的途径。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>深圳大学

<120>一种拟南芥叶片锯齿状边缘相关基因功能性分子标记及其应用

<130>2019.12.12.

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>14132

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

tatatgtcttattcctcttgacttttatatactactttaactcattctttttacattcat60

caacattacatgtttctgtgagttctactagttagaaaattttatgatcaaaatacagtt120

tttgttcctctttctgtctttgttatttttactgattacttactatgaaaggtaattaat180

tttaattgaatttaatgttggattattacatgatttatgtgctatatgtctcattaaaag240

tctattgtagattcggtttaatttgctcggactggaaatcttttaccatagccggccaag300

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aagtagggtatgtgtatccaatatactttgagttgttggatattaagatttttttgtgga780

aatgtgatgactttaagtacacaattcgcacatagatgtatcatacattaactacaccta840

gaacataaattaaaattgatattaaaataattatgcgtatcaatatttaattttcaaaat900

gtaaaaggtaaattaatactatttaacatcttgatcatgtagttaactttgacatcatct960

ttttcatttcagaccaaattttctcatcctcttattctaaaacaacaccacgaataataa1020

aaattacatgaatctgttaatcatcgtatatataatcctaactaacttttggtttttgtt1080

tcttaccgctatgactttgatattttctatatggcaagatagaaaaaatcccttctgatt1140

ataagaatagcttaagaaacactaactgtgctagcaatggccaatgcttgttaatcaaat1200

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