一株降解聚乙烯地膜的蜡样芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，涉及一株耐高低温、耐盐、耐酸碱、耐干旱，并能够高效降解聚乙烯地膜的蜡样芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

在我国农业生产中以聚乙烯(polyethylene,pe)为主要成分的塑料地膜已经广泛应用四十多年，其产量和用量均居世界首位。地膜覆盖技术带来了农业生产方式的改变和农业生产力的飞跃，在西部干旱、半干旱地区和山区冷凉的气候条件下，地膜的节水保墒增温作用尤为显著，显著促进了农业的增产增效。但地膜大量应用的同时也带来了严重的环境污染问题。聚乙烯是线性的饱和碳氢化合物，具有相对分子质量大、表面活化能低、强疏水性以及缺乏被微生物酶系统所利用的功能团，导致聚乙烯在自然环境中降解的速度非常缓慢，在土壤中可稳定存在200～400年，从而造成在环境中的积累。新疆作为我国最大的地膜应用区域和地膜残留污染区，随着覆膜年限的增加，残留在农田土壤中的聚乙烯地膜逐年增加，每年残存在田间的地膜占使用总量的20～40％以上，严重污染地区土壤中地膜累积存留量己达32～38kg/亩。在连续多年覆膜种植区域，地膜残留物密布土壤整个耕作层，破坏了农田生态环境和土壤结构，造成农作物烂种、烂芽，缺苗断垅及根系坏死，对作物生长发育造成了不良的“负面效应”，棉花、小麦、玉米等十多种作物减产达10％～22％。随覆膜时间的推移,地膜残留对农作物产量的影响愈加明显。

为了减缓残留地膜对农作物的不良影响，目前农业生产中主要采用人工捡拾或机械回收。但当前使用地膜厚度普遍低于0.008mm，机械强度差；同时受农时、气候和人工费用的影响，回收面临很多困难，实际回收率仅能达到60％～80％。回收后的废旧地膜主要通过填埋、焚烧法处理或生产再生塑料再利用，但都不能从更本上解决地膜造成的环境污染问题，还会造成二次污染。研制将聚乙烯与促氧化剂或者淀粉、脂肪酸、纤维素等掺混后加工成膜的新型可降解地膜是未来的发展趋势。可降解地膜一方面在很长时间内面临成本和使用效果的双重问题，难以在生产中推广应用；另一方面，虽然添加剂能够有效的降解，但其中含有的大量聚乙烯仍未被降解而释放到环境中，更加难以控制。因此，迫切需要发掘可以高效降解聚乙烯的微生物资源，加速聚乙烯地膜残留物的无害化降解，保护农业生态环境。

已有的研究中筛选出的聚乙烯降解菌种资源十分有限，不同菌株对聚乙烯的降解效率差异大，缺乏高效菌株；在实验室表现出具有一定降解性能的菌株，对环境的适应性是其发挥降解功效的制约因素，限制了实际应用。尤其是对于地处内陆干旱荒漠区的新疆，立足于当地，筛选出抗逆性强、适应当地气候环境条件的聚乙烯地膜高效降解菌株，对于减少“白色污染”具有积极的意义。

技术实现要素：

本发明针对聚乙烯在环境中难以降解的问题，已有的研究中筛选出的聚乙烯降解菌种资源十分有限，不同菌株对聚乙烯的降解效率差异大，缺乏高效菌株；本发明旨在于提供一种经过鉴定为新菌种的耐高低温、耐盐、耐酸碱、耐干旱蜡样芽孢杆菌，并能够高效降解聚乙烯地膜获得良好的应用，为聚乙烯地膜降解提供新的菌源。

本发明所提供的一株可降解聚乙烯地膜的细菌菌株，为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期为2019年11月13日，保藏编号为cgmccno.18946。

本发明所述的可降解聚乙烯地膜的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1分离自新疆本地人工养殖蜜蜂蜂巢中的鳞翅目螟蛾科昆虫大蜡螟(galleriamellonella)幼虫肠道。

本发明所述的可降解聚乙烯地膜的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1应用于降解聚乙烯地膜菌剂的制备。

本发明所述的可降解聚乙烯地膜的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1应用于农田土壤中聚乙烯地膜的降解。

具体的本发明将从新疆本地人工养殖蜜蜂蜂巢中获得的大蜡螟幼虫通过饲喂聚乙烯地膜膜片进行驯化，解剖虫体获得肠道内容物，将肠道内容物富集培养，转接至以聚乙烯膜片或粉末为唯一碳源的培养基中共培养，从中分离、筛选获得一株能够利用聚乙烯为唯一碳源的降解菌dlm-d4-1。该菌株生物学特性如下：生长最适温度为30℃，好氧性培养物。在lb平板培养基上，形成圆形或近似圆形、表面干燥有褶皱、扁平、边缘整齐、淡黄色菌落。光学显微镜下为短杆状，芽孢中央位，孢囊无明显膨大，革兰氏染色阳性，具有鲜明的新菌种特性。经对所分离菌株的16srdna基因序列进行测序，利用genbank数据库中的blast程序对测序结果进行相似性检索，并通过dnastar、mega5.0软件进行多重序列比对及系统发育树的构建，结果发现本发明提供的菌株的16srdna基因序列(登录号：mt039536)与蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)的模式菌株具有较高的相似性，其中与bacilluscereusatcc14579(登录号：nr074540)菌株的同源性最高，相似性达98.9％，并且在系统进化树上处于同一分枝，从而确定分离出的细菌菌株dlm-d4-1为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)中的新菌种，具有新菌种显著特征。

进一步，通过对蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1进行人工模拟各种胁迫环境，即耐盐、耐酸碱、耐干旱及耐高低温处理，通过测定对聚乙烯地膜的降解性能，即通过聚乙烯膜失重率、表面形态变化、表面化学官能团变化，聚乙烯膜片的力学性能的检测，发现分离菌株蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1是一株能高效降解聚乙烯地膜，同时具有优良抗逆能力的功能菌株。

采用本发明上述发明内容获得以下有益效果：

(1)本发明提供的一株从新疆本地人工养殖的蜜蜂蜂巢害虫大蜡螟肠道中分离筛选出可降解聚乙烯地膜的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1经过菌落形态、生理生化试验和分子水平鉴定分析可知属于一种蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)中的新菌种。

(2)本发明获得的聚乙烯地膜降解细菌蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1菌株，能够利用聚乙烯为唯一碳源生长并且能聚集附着于膜片上形成密集的生物膜，侵蚀、高效降解聚乙烯地膜。该菌株30d对聚乙烯地膜膜片的降解率可达8.07％，现国内报道中从昆虫肠道分离的塑料降解菌60d降解率一般为5％左右。

(3)本发明的聚乙烯地膜降解菌株蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1具有较强的抗逆能力，对盐、高低温、酸碱、干旱等不利环境因子表现出很强的耐受性。能够耐受5.0％nacl盐离子浓度，在ph5.0～9.0，-0.6～-1.6mpa渗透势，10～40℃生长温度范围内均可生长，为聚乙烯地膜的生物降解提供了具有较强的环境适应性的高效菌种资源。

(4)本发明的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1能在lb培养基中生长良好，易于培养，便于开发研制成降解菌剂，在加速聚乙烯地膜残留物降解中具有良好的应用潜力。

附图说明

图1所示为蜡样芽孢杆菌dlm-d4-1在lb培养基上的菌落形态。

图2所示为基于16srdna基因构建的蜡样芽孢杆菌dlm-d4-1的系统发育树。

图3所示为聚乙烯降解菌降解30天后聚乙烯膜片在场发射电子扫描电镜下观察到的形貌特征图，a为对照；b为接菌xjdlm-d4-1。

图4所示为蜡样芽孢杆菌dlm-d4-1降解聚乙烯地膜前后聚乙烯膜片表面官能团变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：大蜡螟及黄粉虫肠道菌群的富集及聚乙烯降解菌的分离与筛选(1)大蜡螟及黄粉虫肠道菌群的富集

以新疆本地人工养殖的蜜蜂蜂巢中的害虫大蜡螟，国内人工饲养作为饲料的大蜡螟，波兰引进大蜡螟，本地饲养用作饲料的黄粉虫作为分离材料。将不同来源昆虫体放入透气密封的饲养盒中，放入剪碎的聚乙烯膜片与待分离昆虫驯化10d之后。将饲喂聚乙烯膜片驯化后的虫体分别放入乙醚溶液中浸泡10s，取出放入0.1％升汞溶液浸泡2min，再放入100％无水乙醇浸泡10s，最后移入无菌水中洗涤2-3次进行表面消毒处理。将消毒处理的昆虫放置在解剖镜下，用解剖刀划破虫体肠道，从中挑出肠道放入研钵中，加入1-3ml无菌水充分研磨。吸取0.5ml的肠道液分别加到装有50ml富集培养基a和富集培养基b的250ml锥形瓶中，置于恒温振荡器中30℃、160r/min富集培养3d。

将聚乙烯地膜统一剪成4.0cm×4.0cm大小，约0.005g的膜片，用0.5％kcl溶液浸泡1h，再用100％无水乙醇清洗3-4次，无菌蒸馏水润洗，放入干燥无菌的培养皿中烘干，在紫外灯下照射灭菌4h(0.25h翻动一次)后，加入到经高压蒸汽灭菌处理的50ml基础无机盐培养液中。同时移入5ml昆虫肠道富集液，30℃，160r/min下振荡共培养10d后，再按5％的接种量将培养液接入新鲜的含聚乙烯地膜的基础无机盐培养液中培养10d。

富集培养基a：酵母膏10g、k2hpo40.7g、kh2po40.7g、mgso4.7h2o0.7g、nh4no31.0g、nacl0.005g、feso4.7h2o0.002g、znso4.7h2o0.002g、mnso4.h2o0.001g、蒸馏水1000ml、ph7.2。

富集培养基b：牛肉膏3g、蛋白胨3g、酵母膏5g、k2hpo40.7g、kh2po40.7g、mgso4.7h2o0.7g、nh4no31.0g、nacl0.005g、feso4.7h2o0.002g、znso4.7h2o0.002g、mnso4.h2o0.001g、蒸馏水1000ml、ph7.2。

基础无机盐培养基：k2hpo40.7g，cacl2.2h2o0.7g，kcl0.5g，mgso4.7h2o0.7g，nh4no31.0g，nacl0.005g，znso4.7h2o0.002g，mnso4.h2o0.001g，蒸馏水1000ml，ph7.0-7.2。

(2)聚乙烯降解菌的分离

将聚乙烯粉末放置于无菌干燥的培养皿上，平铺成薄层，在紫外灯下照射灭菌3h(0.25h翻动一次)后，加入到灭菌并熔化的基础无机盐固体培养基中，制成以聚乙烯(10g/l)为唯一碳源的培养基。倒平板、待平板培养基冷却凝固后，在每个平板分别涂布0.5ml的大蜡螟肠道菌和黄粉虫肠道菌的富集液，30℃恒温培养箱培养30d。挑取能在以此培养基上生长的细菌菌株，并在在该培养基上反复多次划线分离、纯化，获得单菌落，4℃保存备用。

(3)聚乙烯降解菌的筛选

将筛选获得的以聚乙烯为唯一碳源的菌株接种于含定量聚乙烯膜片的基础无机盐培养基中共培养5d，测定聚乙烯膜片的失重率，比较各菌株的降解能力。将初筛出的降解性能较高的菌株进一步测定10d，20d，30d聚乙烯膜片的失重率，从中复筛出一株降解性能最高的菌株。

聚乙烯膜片的失重率测定：将聚乙烯膜片用2％sds溶液浸泡4h，再用无菌水振荡清洗3次以去除膜表面附着的细菌，40℃干燥后，用万分之一天平精确称重膜片质量。

地膜失重率(％)＝(处理前膜片初始质量-接种处理后膜片质量)/处理前膜片质量×100％

通过初筛，从黄粉虫及不同来源的大蜡螟肠道中共获得21株聚乙烯降解菌株如表1所示，进一步复筛出一株降解性能最高的菌株dlm-d4-1，30d的地膜失重率为8.07％，如表2所示。

表1：分离菌株降解聚乙烯膜片的初筛结果

hfc—人工饲养黄粉虫；dlm—人工饲养大蜡螟；xjdlm—新疆饲养蜜蜂蜂巢土著大蜡螟；bldlm—波兰引进的大蜡螟。

表2：降解菌10-30d复筛后失重率

实施例二：聚乙烯降解菌株dlm-d4-1的鉴定

(1)菌株的形态和培养特征观察

将菌株dlm-d4-1接种在lb固体培养基上进行培养，培养48h后形成圆形或近似圆形、表面干燥有褶皱、扁平、边缘整齐、淡黄色菌落，如附图1所示。光学显微镜下为短杆状，芽孢中央位，孢囊无明显膨大，革兰氏染色呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌，具有新菌种鲜明特征。

(2)菌株16srdna基因的序列测定及分析

提取dlm-d4-1菌株总dna为模板进行pcr扩增，引物为以细菌16srdna通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1429r(5'-ctacggctaccttgttacga-3')。pcr反应体系为25μl：dna模板1.0μl，10μmol/l27f/1429r各1.0μl，10mmol/ldntps1.5μl，10×pcrbuffer(2.5mmol/lmgcl2)2.5μl，2.5u/μltaqdna聚合酶0.5μl，补足灭菌超纯水至25μl。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。扩增产物经10g/l琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程股份有限公司对pcr产物进行克隆测序，测序结果见seqidno:1。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(ncbi)进行blast检索，选择相似性高的模式菌株作为参比菌株，利用mega5.0软件中的邻接法(neighbor-joining)构建16srdna基因系统发育树，自展值(bootstrap)1000。结果如附图2所示，菌株dlm-d4-1与bacilluscereus多个菌株形成一个分支，16srdna基因序列与蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)的模式菌株具有较高的相似性，其中与bacilluscereusatcc14579(登录号：nr074540)菌株的同源性最高，相似性达98.9％，并且在系统进化树中处于同一分枝，表明筛选获得这株菌dlm-d4-1为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)中的新菌种，具有新菌种的显著特征。

基于以上生物学特征，将菌株dlm-d4-1鉴定为蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期是2019年11月13日，保藏编号为cgmccno.18946。

实施例三：蜡样芽孢杆菌dlm-d4-1菌株降解聚乙烯膜片的应用验证试验

将聚乙烯地膜剪成4.0cm×4.0cm大小约0.005g的膜片，用3％kcl溶液浸泡1h，再用100％无水乙醇清洗3-4次，最后无菌蒸馏水清洗，放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌3h。在无菌条件下，将dlm-d4-1(接种量为5％)加入含聚乙烯膜片的基础无机盐液体培养基中(装液量100ml/500ml锥形瓶)，160r/min，30℃恒温摇床震荡培养30d，以不接菌为对照，设5个平行，重复3次。经过30d处理后聚乙烯膜用2％sds溶液浸泡4h，再用无菌水清洗几次去除膜表面附着的菌，40℃烘干后，分析聚乙烯膜失重率、表面形态变化、表面官能团变化，聚乙烯膜力学性能变化。所述基础无机盐培养基的成分同实施例一所述。

聚乙烯膜失重率测定：精确称重聚乙烯膜片质量，计算失重率。结果表明，聚乙烯膜片在与接种蜡样芽孢杆菌dlm-d4-1共培养30天后失重率达8.07％。

聚乙烯膜表面形态变化测定：经30d接菌处理后的聚乙烯膜片，固定喷金后，利用场发射扫描电镜观察聚乙烯膜表面形态的微观变化。结果如附图3所示，经30d接菌降解后的聚乙烯膜片表面变得粗糙，出现明显的侵蚀孔洞和清晰的裂痕，而对照组的膜片表明则光滑完整，无任何变化。

表面官能团变化测定：采用傅里叶红外光谱仪(brukervertex70)测定聚乙烯膜片的表面化学官能团变化。扫描波长范围为1000-3500cm^-1，分辨率为4.0cm^-1，扫描次数100次。结果图附图4所示，经过30d接菌降解后的聚乙烯膜与对照相比，傅立叶变换红外(ftir)光谱出现一些波长峰的消减，消失的振动峰主要有1305cm^-1、1633cm^-1，在2900cm^-1等振动峰的明显削弱和位置偏移，其中聚乙烯c-h伸缩振动峰在2900cm^-1处削弱，表明蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1对聚乙烯膜有降解的能力。

聚乙烯膜力学性能测定：采用rgm-4002型微机控制电子万能试验机，按gb/t1040.3-2006标准执行，拉伸速度50mm/min，检测接菌降解处理30d后聚乙烯膜片的拉伸强度，断裂伸长率和弹性模量等力学性能。结果显示，经30d接菌降解后的聚乙烯膜拉伸强度较对照的228.5mpa减小到89.6mpa；断裂伸长率较对照的342.5mpa减小到100.5mpa；弹性模量为17.411mpa减小到11.347mpa。表明经30d接菌降解后，聚乙烯膜片的断裂伸长率和拉伸强度下降较大，抵抗弹性变形能力降低，说明蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1减小了聚乙烯膜片分子间作用力，使力学性能下降。

实施例四：聚乙烯降解菌dlm-d4-1的抗逆能力测定

对蜡样芽孢杆菌dlm-d4-1的抗逆能力主要进行了耐盐、耐酸碱、耐干旱及生长温度范围测定。以lb培养基为基础培养基，均以ph7.0，30℃培养的lb液体培养基作为阳性对照，每个处理设重复3次。耐盐、耐酸碱、耐干旱能力的测定均是将菌株在lb培养基平板上活化后，接种于lb液体培养基中，30℃，160rpm/min培养24h(od600值0.800)作为接种液，以2％的接种量接种于各处理的培养液中，30℃，160rpm/min震荡培养24h，uv-2000型分光光度计在600nm波长处测定各处理菌悬液的光密度值，作为菌株生长量指标。每个处理5个平行样，重复3次，每组试验重复3次。

耐盐性测定：配制含nacl的lb培养液，其中nacl的质量体积分数为0％、0.1％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％。

耐酸、碱能力测定：用naoh或hcl调节lb培养液初始ph值，ph值依次为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0。

耐干旱性测定：用聚乙二醇6000(polyethyleneglycol6000，peg6000)人工模拟干旱条件，在基础培养基中加入不同量的peg6000，使培养液的渗透势ψ分别为0、-0.6mpa、-0.8mpa、-1.0mpa、-1.2mpa、-1.4mpa、-1.6mpa共7个水平。

生长温度范围测定：共设7个温度处理，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃恒温摇床中培养24h后测定od600值。

试验结果表明蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1抗逆能力较强。具有较强的耐盐能力，在含0％～5％nacl培养液中均能生长，当nacl浓度达到5％时，蜡样芽孢杆菌dlm-d4-1也能良好的生长，菌液od600值为1.952，表现出一定的耐盐性；蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1在ph5.0-9.0之间能维持较高的生长量，表明菌株有较广的酸碱适应范围。蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1能在渗透势-0.6～-1.6mpa范围内生长，在渗透式-1.6mpa处理下生长od600值达到1.366，说明该菌株有较好的耐干旱能力；蜡样芽孢杆菌dlm-d4-1的生长温度范围较广，在10～40℃温度范围内均能生长，最适温度为30℃且菌液od600值为2.386，在40℃时良好生长，od600值为1.992，说明该菌株蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)dlm-d4-1具有一定的耐热性。

如上所述，即可较好地实现本试验，上述的实施例仅仅是对本试验的优选实施方式进行描述，并非对本试验的范围进行限定，在不脱离本试验设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本试验的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本试验确定的保护范围内。

序列表

<110>新疆农业大学

<120>一株降解聚乙烯地膜的蜡样芽孢杆菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1419

<212>dna

<213>蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)

<400>1

tgcaagtcgagcgattggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtctg60

taacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaatacc120

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