基因工程改造的高活力人溶菌酶的制作方法

本发明涉及基因工程改造的高活力人溶菌酶，属于生物工程技术领域。

背景技术：

溶菌酶起源于1922年fleming在人的鼻粘液中发现一种能够溶解细菌细胞壁的物质，并将其命名为“lysozyme”，即溶解细菌的蛋白质。溶菌酶全称1,4-β-n乙酰胞壁酸聚糖水解酶，又称为细胞壁溶解酶，在高等动物的体液中分布广泛，它具有抗菌、抗病毒、消炎、增强免疫力等特性。人溶菌酶是由130个氨基酸组成的单肽链蛋白质，是一种阳离子碱性蛋白质，呈白色结晶状或无定形粉末固相，常温即可溶于水，化学性质稳定，最适宜温度是25℃，在高温和酸溶液环境中活性也保持稳定，碱溶液中不稳定。

天然人溶菌酶作为一种重要的非特异性体液免疫因子主要存在于人体体液、组织内外细胞液和人体器官中。人溶菌酶具有高生物活性和热稳定性，其杀菌活性是目前市场常用的鸡蛋清溶菌酶的3倍。同时人溶菌酶还具有抗病毒、增强免疫力和抗肿瘤的功效，该酶被广泛应用于食品、饲料工业和医学临床中。

目前使用的人溶菌酶主要来源于人乳汁、胎盘等的提取物，但因原料来源受限和分离纯化成本较高限制了其应用。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明拟通过基因工程手段，提高人源溶菌酶的杀菌活力，同时利用毕赤酵母系统表达具有生物活性且易于纯化的人溶菌酶，以期降低生产成本，解决溶菌酶应用受限的问题。

本发明的第一个目的是提供一种比酶活提高的人溶菌酶，所述人溶菌酶的氨基酸序列如seqidno:1所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述人溶菌酶的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体是ppic9k。

本发明的第四个目的是提供一种表达上述人溶菌酶的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以毕赤酵母细胞为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以毕赤酵母km71为宿主。

本发明的第五个目的是提供一种提高人溶菌酶比酶活的方法，是将氨基酸序列如seqidno:4所示的人溶菌酶的第102位的天冬氨酸替换为丝氨酸。

本发明还提供了上述人溶菌酶在制备饲料添加剂、食品防腐方面的应用。

本发明还提供了上述人溶菌酶在食品或饲料领域的应用。

与现有的技术相比，本发明的优点和积极效果是：

本发明通过基因工程改造人源溶菌酶活性中心氨基酸残基的方法，筛选得到了人溶菌酶的1个位点的突变：asp102ser，得到一种高比酶活的人源溶菌酶突变体m4hlm。突变体m4hlm的比酶活相对于野生型提高了60％以上，有效提升了人源溶菌酶的杀菌效果，有助于将其用于制造具有高活力抑菌功能的饲料添加剂。

本发明所述的基因工程改造的人溶菌酶不仅对致病菌具有较强的杀灭和抑制作用，同时还具有广谱抗菌的优点，由于抑菌的高效性和对人体的安全性高，也适合于各种食品的防腐。另外，本发明采用毕赤酵母表达系统可以获得高表达量、高活性的人溶菌酶，不受原材料来源的限制，利用基因工程生产出的重组人溶菌酶不仅具有人溶菌酶的优点，同时也克服了人溶菌酶活性低、产量低、不便于制备、无法稳定保存等缺点。高比酶活、低成本溶菌酶的生产与推广应用，不仅可对饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。

附图说明

图1：ppic9k-m4hlm质粒图谱。

具体实施方式

本方案中，所述的基因工程改造的溶菌酶m4hlm，与seqidno:4编码的野生型溶菌酶相比，包含一个氨基酸位点的突变asp102ser，获得的溶菌酶突变体的比酶活得到大幅提高。

下面通过具体实施例对本发明所述的耐热溶菌酶m4hlm的基因工程改造过程进行具体说明。

实施例1构建溶菌酶突变体表达质粒ppic9k-mhlm

通过对溶菌酶的氨基酸残基进行人为突变和定向筛选，可以有效改变溶菌酶的水解酶活、热稳定性、最适ph、底物特异性等性质，开发出更加适应现代生产需求的新型溶菌酶。对鸡蛋清溶菌酶的研究显示，活性中心asp101和asn37残基与“酶-底物”的结合方式密切相关，通过点突变使溶菌酶活力提升了3倍。人源溶菌酶和鸡蛋溶菌酶同属于c型溶菌酶，因此对人源溶菌酶类似保守区域asp102进行定点饱和突变可能会获得酶活更高的溶菌酶突变体。

原始人溶菌酶基因hlm根据毕赤酵母密码子偏好性优化后再通过人工合成获得，具体核苷酸序列见seqidno:3，氨基酸序列见seqidno:4，并整合在puc57simple质粒上，得到puc57simple-hlm。根据seqidno:3设计引物f1：ggcgaattcaaggttttcgaaagatgtgaact和引物r1：ggcgcggccgccacaccacatccttgaacata，以质粒puc57simple-hlm为模板进行pcr扩增获得400bp左右条带(条带1)。用ecori和noti双酶切ppic9k原始质粒，胶回收9000bp左右条带(条带2)；用bamhi和noti双酶切条带1，胶回收该条带后，将条带1和条带2用t4连接酶连接起来构成含原始溶菌酶基因的重组质粒ppic9k-hzm。

连接产物转化大肠杆菌jm109感受态，涂lb抗性平板(lb固体培养基：蛋白胨10g·l^-1，酵母膏5g·l^-1，氯化钠10g·l^-1，氨苄50μg·ml^-1，琼脂20g·l^-1)于37℃培养12h左右。挑取平板上2个单菌落接种至100ml液体lb培养基中(蛋白胨10g·l^-1，酵母膏5g·l^-1，氯化钠10g·l^-1，氨苄50μg·ml^-1)，于37℃摇床220转/分钟培养15h后提取质粒。提取的质粒用bamhi和noti酶切，分别得到400bp和9000bp的基因片段的，即为正确重组质粒，并用引物acagaaggaagctgccctg测序验证。

针对asp102ser位点设计饱和突变引物f2：tgccaaacgtgttgttagannncctcaaggtatc和引物r2：gataccttgaggnnntctaacaacacgtttggca。将引物f2和r2以ppic9k-hzm为模板进行质粒扩增，扩增产物加dpni酶解后转化大肠杆菌jm109感受态，涂lb氨苄抗性平板37℃培养12h左右。挑取5-10个单菌落用引物f1和r1进行菌落pcr验证，保证阳性菌落在90％以上。将平板上菌落全部刮取，接种至100ml液体氨苄lb培养基中，于37℃摇床220转/分钟培养15h后提取混合质粒。取质粒测序，所构建的含不同突变体的混合质粒为ppic9k-mhlm。

实施例2筛选抑菌活力提高的溶菌酶突变体

将实施例1所述混合质粒用saci酶切线性化后电转化毕赤酵母km71，涂布ypd抗性平板(蛋白胨20g·l^-1，酵母膏10g·l^-1，葡萄糖20g·l^-1，20g·l^-1琼脂粉，g4181000μg·ml^-1)于30℃培养48h。将平板上所有单菌落分别挑到48孔培养板，每孔加入无抗生素的ypd培养基500μl、2％接种量，于30℃、200转/分钟培养48小时，离心收集菌体后加入500μlyp培养基(蛋白胨20g·l^-1，酵母膏10g·l^-1)，28℃、200转/分钟培养72小时，每12h补加甲醇终浓度为1％(v/v)，诱导结束后离心获取上清即为溶菌酶突变体酶液。按照比浊法定量测定各孔中的溶菌酶活力，挑取获得活力最高的突变体表达菌株，用ypd培养基扩增菌体后离心获得菌体，基因组提取试剂盒提取基因组后用引物f1和r1进行扩增，扩增的产物通过酶切连接方式连接到ppic9k上送出去测序，测得的突变体核苷酸序列如seqno.id:2，其102位氨基酸由asp突变成ser，该突变体记为m4hlm，表达质粒为ppic9k-m4hlm(质粒图谱如图1所示)，表达该突变体的菌株名称记为km71-ppic9k-m4hlm。

实施例3将km71-ppic9k-m4hlm进行发酵罐扩大培养

将甘油管中的菌液吸取100μl接种100ml的ypd培养基中培养18h左右，然后将100ml培养液接种于3l发酵罐中的1l基础盐发酵液培养基(k2so418.2g·l^-1，mgso4·7h2o14.9g·l^-1，caso4·2h2o0.93g·l^-1，koh4.13g·l^-1，85％h3po426.7ml·l^-1，甘油30g·l^-1，ptm14.35ml·l^-1)中进行发酵培养。

3l罐培养分为2个阶段，第一阶段是甘油相培养，此时流加50％甘油为碳源，温度30℃，ph5.5，溶氧20％以上，培养到od600大约等于100时开始进入第二阶段甲醇诱导相。第二阶段的甲醇浓度用甲醇流加仪控制在1％左右，温度28℃，ph5.0，溶氧20％以上培养120h后放罐，发酵液离心去菌体后的上清液即为酶液。

实施例4上罐发酵得到的野生溶菌酶hlm和突变体m4hlm的比酶活测定

人溶菌酶酶活测定方法为：利用管蝶法鉴定人源溶菌酶的生物活性，并通过比浊法定量测定人源溶菌酶酶活力大小。

管碟法是效仿抗物素的生物学鉴定方法，指示菌为1.5％溶壁微球菌(od600＝1)，双蝶制备好后静置10min，在牛津杯中加入样品及阴性对照，24h后观察透明圈的大小。

比浊法以溶壁微球菌作为底物，通过菌悬液od450处吸光度值的变化进行酶活力测定。溶壁微球菌活化及培养步骤参照国标gb/t30990-2014。称取一定量的溶菌酶标品(100000u/mg)，用缓冲液稀释成一定的浓度梯度(50-250u/ml)，取0.5ml的酶液加入2.5ml的菌悬液混匀，记录在450nm处反应1min时的读数a1，反应2min时的读数a2，计算△e＝|a1－a2|的值，以酶活力为纵坐标，△e为横坐标作酶活力标准曲线。同样测定发酵上清液的△e(1min内的变化范围在0.025-0.125)，根据酶活力标准曲线计算出发酵上清液的酶活力。

发酵上清液中的蛋白质含量使用bradford方法进行测定，用牛血清蛋白作为标样制作标准曲线。将发酵上清液稀释到一定倍数，在已加入5ml考马斯亮蓝g-250溶液的试管中加入100μl稀释的发酵上清液，振荡混匀，室温静置5-10min，于波长在595nm的分光光度计测定吸光值，依据制作的标准曲线算出蛋白浓度，单位mg·ml^-1。

比酶活计算为上清液酶活力除以蛋白质含量。

经过测定上清液酶活和蛋白质含量，突变体m4hlm的比酶活为14880u/g。

按照构建和筛选溶菌酶突变体的步骤，将实施例1中所构建的含原始溶菌酶基因的重组表达质粒ppic9k-hzm转化毕赤酵母km71，通过g418抗性平板筛选重组菌株km71-ppic9k-hlm后挑取20个较大单菌落进一步通过ypd摇瓶筛选表达活力高的重组菌株。将重组菌株用3l发酵罐进行放大发酵，诱导120h后离心获得上清即为含原始溶菌酶的发酵上清液。用比浊法测得酶活和bradford法测蛋白质含量，最后算得原始溶菌酶的比酶活为9305u/g，突变体m4hlm较原始溶菌酶比酶活提高了约60％。

对比例

发明人还筛选得到一种人溶菌酶突变体，该突变体以氨基酸如seqidno:1所示的人溶菌酶为亲本酶，将第102位天冬氨酸突变成赖氨酸，经同实施例流程后获得了突变体酶(asp102lys)，测得其比酶活为9910u/g，较原始溶菌酶比酶活仅提高了6.5％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>基因工程改造的高活力人溶菌酶

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