基于纳米管阵列传感器的可调电压模式细胞穿孔透膜系统的制作方法

本发明涉及一种细胞穿孔透膜的技术领域，具体涉及一种基于纳米管阵列传感器的可调电压模式细胞穿孔透膜的系统。

背景技术：

目前，通过电穿孔技术将核苷酸、dna与rna、蛋白、糖类、染料及病毒颗粒等导入细胞内。然后，现有的细胞电穿孔方法，通常基于平面电极的穿孔技术，由于平面电极与细胞的耦合效果较差，致使细胞电穿孔效率较低，同时由于耦合效果的限制需要采用较大的电压开展电穿孔，容易在电穿孔时杀伤细胞，并且由于通常采用信号发生器作为电穿孔设备，其通道数，可设置电信号参数范围有限，无法应用于各类器件的细胞电穿孔，这些都成为了开展向细胞内递送分子研究的限制。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有平面电穿孔技术穿孔效率较低，所采用穿孔系统通道及电信号参数受限等问题。开发了基于氧化铝纳米管阵列传感器的可调电压模式细胞穿孔透膜系统，制备三维纳米结构的电极，有利于实现细胞电极之间的高效耦合，提高细胞电穿孔的效率，同时开发信号通道数高、电信号各参数大范围可调的系统，实现各类电穿孔条件可控的高效实现。

本发明采用如下技术方案：

一种基于纳米管阵列传感器的可调电压模式细胞穿孔透膜系统，包括纳米管阵列传感器、可调电压脉冲产生装置和上位机；所述可调电压脉冲产生装置由为该装置提供电源的电源电路、产生控制脉冲信号的控制器、接受控制器指令可调整输出电压值的数控电压源、脉冲驱动电路、脉冲输出电路组成。电源电路提供该装置所需的12v、5v、3.3v以及33v共4路电压，12v电压由变压器的次级线圈经过桥式整流电路后产生，该12v电压经过线性稳压芯片(lm7805，lm1117-3.3)后产生5v电压、3.3v电压，33v电压由12v电压经过mc33063芯片及其外围电路升压后得到。

所述的数控电压源包括依次连接的dac电路、电压放大电路、功率输出电路组成。dac电电压放大电路由tlc5615芯片与2.5v参考电压电路组成，dac电路的输入端与控制器连接，用于接收控制器发送的0-5v电压指令并产生相应的电压值，该电压经过电压放大电路、功率输出电路被放大6倍后输出，用于给脉冲输出电路提供电压。功率输出电路的输出端与脉冲输出电路的输入端相连。

所述脉冲驱动电路的输入端与控制器连接，脉冲驱动电路的输出端与脉冲输出电路的输入端连接，脉冲输出电路输出端与纳米管阵列传感器相连。

上位机与控制器相连，用于控制控制器产生控制脉冲信号。

所述纳米管阵列传感器包括纳米管阵列、由pdms制成的顶部模块及底部模块、导电玻璃，顶部模块中间设有一中间通孔，中间通孔两侧分别设置一侧通孔，侧通孔作为运输柱；底部模块设置有与顶部模块对应的通孔，通孔之间连通形成微流控管道。底部模块固定在导电玻璃上，纳米管阵列朝上固定在中间通孔底端，与中间通孔构成细胞培养容腔，顶部模块与底部模块固定连接。底部模块的厚度为1-3mm。

进一步地，所述的纳米管阵列为氧化铝纳米管阵列，氧化铝纳米管的外径为450nm，内径为350nm，长度为1-1.5μm。

进一步地，所述可调电压脉冲产生装置还包括人机交互组件，所述人机交互组件由分别与控制器相连的按键、蜂鸣器、显示屏组成，按键用于接受人为控制信号，蜂鸣器用于发出声音以表示系统的工作状态，显示屏用于显示输出脉冲的参数。

本发明的有益效果是，采用三维氧化铝纳米管阵列，提高细胞电极耦合效果，并配合可调电压模式细胞穿孔透膜系统，实现高效的细胞电穿孔。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明：

图1是本发明所述的纳米管阵列传感器的结构示意图；

图2是本发明中纳米管阵列结构示意图；

图3是纳米管的sem表征图；

图4是纳米管阵列传感器的可调电压脉冲产生装置结构示意图；

图5是纳米管阵列传感器的可调电压脉冲产生装置电路连接示意图；

图6是可调电压脉冲产生装置控制工作界面

图7上位机工作流程。

图8可调电压脉冲产生装置电路图，其中a为电源电路图，b为数控电压源电路图，c为33v电压产生电路图，e为脉冲驱动电路图，f为控制器电路图；

图中，氧化铝纳米管10、纳米管阵列11、聚对苯二甲酸乙二酯膜111、pdms顶部模块20、旁边的通孔21、细胞培养容器22、中间通孔23、运输柱24，微流控管道25，pdms底部模块26，导电玻璃27、金属屏蔽外壳28、ac220v接口29、usb接口30、输出接口31、电源电路32、usb通信电路33、控制器34、数控电压源35、脉冲驱动电路36、脉冲输出电路37、人机交互的按键38、蜂鸣器39、显示屏40。

具体实施方式

如图1至图4所示，本发明公开了针对纳米管阵列传感器的可调电压模式细胞穿孔透膜系统。包括纳米管阵列传感器11、可调电压脉冲产生装置和上位机；如图1所示，纳米管阵列传感器包括纳米管阵列11、由pdms制成的顶部模块20及底部模块26和导电玻璃27，顶部模块20中间设有一中间通孔23，中间通孔23两侧分别设置一侧通孔，侧通孔作为运输柱24；底部模块26设置有与顶部模块对应的通孔，通孔之间连通形成微流控管道25。底部模块26固定在导电玻璃27上，纳米管阵列11朝上固定在中间通孔23底端，与中间通孔23构成细胞培养容腔22，顶部模块20与底部模块26固定连接。底部模块26的厚度为1-3mm。

作为优选，所述的纳米管阵列为氧化铝纳米管阵列，氧化铝纳米管的外径为450nm，内径为350nm，长度为1-1.5μm；该氧化铝纳米管阵列传感器可以通过如下步骤制得：

(1)制备氧化铝纳米管阵列11：

(1.1)选用具有纳米孔的聚对苯二甲酸乙二酯膜111；

(1.2)使用原子层沉积技术，以三甲基铝和水为前驱物涂覆氧化铝：将前驱物暴露时间设为0.015s/脉冲周期，前驱物可在原子层沉积设备箱中保存60s。采用300个脉冲周期，从而在聚对苯二甲酸乙二酯膜上涂覆一层约50nm的氧化铝薄膜，沉积生成氧化铝纳米管阵列11；

(1.3)接着利用o2等离子体刻蚀掉表面部分聚对苯二甲酸乙二酯膜111，露出氧化铝纳米管阵列，其结构如图2、3所示，氧化铝纳米管外径为450nm，内径为350nm，长度为1-1.5μm。

(2)制备氧化铝纳米管阵列传感器：使用聚二甲基硅氧烷制成顶部pdms模块20及底部pdms模块26，底部模块26的厚度为1-3mm。将顶部pdms模块20制作成中间有通孔23，两边对称有通孔作为运输柱21；将氧化铝纳米管阵列置于中间通孔23的底部，纳米管一侧朝上；氧化铝纳米管阵列与中间通孔23构成细胞培养容腔22。底部模块26设置有与顶部模块对应的通孔，通孔之间连通作为微流控管道25。底部模块26固定在导电玻璃27上，顶部模块20、纳米管阵列11、pdms底部模块26及导电玻璃27依次用pdms溶液进行粘合，制得氧化铝纳米管阵列传感器。在细胞培养容腔22中加入细胞培养液，细胞置于氧化铝纳米管阵列11上培养，方便实现细胞穿孔。

图4是氧化铝纳米管阵列传感器的可调电压脉冲产生装置结构示意图，包括由为该装置提供电源的电源电路32、与上位机labview通信的usb通信电路33、产生控制脉冲信号的控制器34、接受控制器指令可调整输出电压值的数控电压源35、驱动场效应管的脉冲驱动电路36、脉冲输出电路37。如图5所示，数控电压源35包括依次连接的dac电路、电压放大电路、功率输出电路组成。dac电电压放大电路由路由tlc5615芯片与2.5v参考电压电路组成，dac电路的输入端与控制器连接，功率输出电路的输出端与脉冲输出电路的输入端相连。

所述脉冲驱动电路36的输入端与控制器34连接，脉冲驱动电路36的输出端与脉冲输出电路37的输入端连接，脉冲输出电路37输出端与纳米管阵列传感器11相连。

图8是本实施方式采用的可调电压脉冲产生装置的电路图，其中，控制器34采用芯片stm32f103c8t6(图8f)，图8a是电源电路32的电路图，该电源电路32包括变压器、桥式整流电路、5v线性稳压芯片、3.3v线性稳压芯片和33v电压电路组成，可产生12v、5v、3.3v和33v电压。具体地，变压器的2个副绕组串联后与整流接桥b1的交流输入端连接，滤波电容c3、共轭线圈l1的2个输入端分别与整流接桥b1的正负输出端连接，滤波电容c42、旁路电容c41的两端与扼流线圈l1的2个输出端连接形成12v电压的二次lc滤波电路，5v线性稳压芯片采用lm7805，该芯片1脚与滤波电容c42的正电压端连接，2脚与地相连，3脚与滤波电容c42、旁路电容c41的正电压端相连，首尾相接的扼流线圈l2、滤波电容c47、旁路电容c48一起构成5v电压的二次lc滤波电路，3.3v线性稳压芯片采用lm1117-3.3v芯片，该芯片的3脚接5v电源，1脚接地，2脚输出3.3v电压，并与多个滤波电容、去耦电容的正端相连。

33v电压电路(图8c)包括mc33063芯片,mc33063芯片的6引脚与12v电源连接，4脚、2脚与地线相连接，3脚与地之间接一电容ct，用于控制该芯片的开关频率，5脚与2个分压电阻r52、r53中间相连用于稳定输出电压，电阻r52另一端接33v电压输出端，r53的另一端则与地相连，6脚与7脚之间跨接1ω电阻用作mc33063芯片的限流检测输入，7脚与8脚之间跨接180ω电阻r51用作mc33063内部达林顿管的集电极限流输入，7脚与1脚之间跨接220uh功率电感l1，1脚同时接ss34肖特基续流二极管d5一端，续流二极管d5另一端与滤波电容c54、c55、电感电容l6、c56、c57、c58二次滤波网络相连。

数控电压源35电路(图8b)由dac电路、电压放大电路、功率放大电路组成。dac电路由芯片ic4、u2、r13构成，芯片ic4采用tlc5615芯片实现数字信号到模拟电压的转换，芯片u2采用tl431芯片产生2.5v基准电压。电压放大电路采用芯片u1-lm358芯片实现电压放大，q11实现功率输出电路。u2的2脚接地，1、3脚与ic4的6脚、限流电阻r13一端连接，限流电阻r13的另一端连接到5v电源。ic4的1、2、3引脚与控制器的27、26、25脚相连，8脚与滤波电容c20、旁路电容c19一起连接到5v电源，5脚接地，7脚与电阻r11、电容c29构成的低通滤波器的输入端相连，低通滤波器的输出端与u1的3脚相连。u1的8脚、滤波电容c28、旁路电容c17一起与33v电源相连，4脚接地，2脚与电阻r15、电阻r14构成的电阻分压网络的中间相连，电阻r15的另一端与q11的发射极相连，电阻r14的另一端接地，1脚通过电阻r12与q11的基极相连，u1芯片其余引脚悬空，q11的集电极与33v电源相连，q11的发射极与并联的电容c4、电容c7相连。dac电路用于接收控制器发送的0-5v电压指令并产生相应的电压值，该电压经过电压放大电路、功率输出电路被放大6倍后输出，用于给脉冲输出电路提供电压。

脉冲驱动电路36(图8e)由脉冲驱动芯片u30组成，采用ucc27532芯片，u30的2脚、3脚接12v电源，4脚接地，1脚与控制器ic3的16脚相连，6脚经过电阻r01与5脚相连，脉冲输出电路37由mosfet芯片u40组成，采用fdms86500l芯片，u40的4脚与u30的5脚连接，5、6、7、8脚与q11的发射极相连，1、2、3脚与脉冲输出接口31相连作为可调电压脉冲产生装置输出端，与纳米管阵列传感器11的导电玻璃相连即可对纳米管阵列传感器11进行电穿孔。

图5本系统的电路连接示意图。氧化铝纳米管阵列传感器11的可调电压脉冲产生装置通过ac220v接口29与市电相连，与安装上位机labview的电脑使用usb线通过usb接口30相连接，与氧化铝纳米管阵列传感器使用鳄鱼夹电线通过脉冲输出接口31相连接。图6是可调电压脉冲产生装置控制上位机的工作界面，通过设置通信的端口，脉冲输出电压、脉冲宽度、工作频率以及工作次数等信息控制系统的电压和脉冲。

作为优选，可调电压脉冲产生装置还包括人机交互的按键38、蜂鸣器39、显示屏40、以及安装这些部件的金属屏蔽外壳28。按键38用于接受人为控制信号，一般可用于直接发送上次的参数数据，操作便捷；蜂鸣器39用于发出声音以表示系统的工作状态，如：嘀一声表示成功接收到数据，但并未开始输出脉冲信号；嘀三声表示上位机终止脉冲输出；嘀六声表示脉冲信号正常结束，便于识别系统当前的运行状态。显示屏40用于显示输出脉冲的参数，便于实时观察。

图7给出了氧化铝纳米管阵列传感器的可调电压模式细胞穿孔透膜系统的使用流程。在上位机中设置好电脉冲的输出电压，设置好需要刺激的脉冲宽度，根据需要设置好工作频率，脉冲输出次数、循环次数以及等待时间，点击开始将数据通过usb线传送至可调电压脉冲产生装置，控制器34在显示屏上显示设置参数，并根据设置数据开始输出脉冲，等待脉冲次数结束后鸣叫提醒，结束工作。

以下通过一个具体实施例以详细说明：

用宫颈癌细胞(hela)进行模拟。将hela细胞用胰蛋白酶从培养瓶中消化下来，离心，加入含胎牛血清(fbs)的dmem培养基，收集单细胞悬浮液。利用含纤连蛋白溶液修饰传感器表面，改善细胞的贴附。将细胞种植在pdms制成的顶部模块20中的细胞培养容器22培养24h后，进行药物递送测试，细胞培养条件为37℃，5％co2。

在氧化铝纳米管阵列11上养的hela细胞先用hoechst和calcein-am两种荧光染料进行染色，并在荧光显微镜下观察，显微镜成像表明细胞正常生长。接着通过运输柱往由pdms制成的底部模块26的微流控管道25中加入药物pi。通过可调电压脉冲产生装置调控细胞穿孔透膜系统的电压，在5-30v的范围内对细胞电穿孔。电穿孔完成后，在细胞培养箱中孵育10min，可在荧光显微镜下观察到药物pi成功递送到细胞中。