一种与肝癌索拉非尼耐药相关的miRNA标志物及其应用的制作方法

本发明涉及生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种与肝癌索拉非尼耐药相关的mirna标志物及其应用；具体涉及肝癌来源的mirna-486-3p及其在肝癌索拉非尼耐药中的应用。
背景技术：
：肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤，每年导致大于70万的死亡病例。在中国，肝癌是第四常见的恶性肿瘤，并在肿瘤相关致死性疾病中排名第3位。由于在中国乙肝病毒流行，肝癌患者数量众多，在2012年全世界新发肝癌患者约有50％来源于中国。早期肝癌病人在接受合适的治疗后预后较好，5年生存率为60％-80％。但是，许多患者由于缺乏有效的早期诊断，发现肝癌时已经到了晚期。手术或者局部治疗如插管化疗对这些晚期肝癌病人效果较差。因此借助于靶向治疗，从而改善预后。索拉非尼作为肝癌的一线靶向治疗药物，已经在临床实践应用中超过10年，同时也是研究肝癌耐药中的一个热点。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，包括vegfr1、2和3，pdgfrβ，c-kit和ret等，抑制血管生成和肿瘤发生。在两项大型临床试验中，索拉非尼在西方和东方的患者中均被证明可以将生存时间延长2-3个月。尽管具有疗效，但索拉非尼耐药性在初始治疗后很快就会出现，但是机制尚不清楚。研究发现microrna(mirna)可能在这种抗药性中起重要作用。mirna在转录后调控多种生物学过程。当mirna与其3’utr结合时，其靶表达通常会下调。mirna与癌症的细胞增殖，侵袭和许多其他生物学行为有关，使其成为癌症的理想生物标志物。据报道它们也是很好的预测指标可以用于癌症的预后。如mirna-21在包括肝癌在内的许多癌症中均过表达，并且与患者预后不良相关。越来越多的报道研究表明，mirna可调节乳腺癌中他莫昔芬的耐药性，卵巢癌中的顺铂耐药性和胰腺癌中的吉西他滨耐药性。因此mirna在肝癌索拉非尼耐药中有巨大潜在应用价值。技术实现要素：为解决现有肝癌索拉非尼耐药诊断技术的不足，本发明提供了一种mirna标志物，所述标志物是mirna-486-3p，其序列信息如seqidno.1所示。使用本发明的mirna标志物可以进行肝癌索拉非尼耐药的早期诊断。本发明还提供了与肝癌索拉非尼耐药相关的mirna标志物在制备诊断肝癌索拉非尼耐药的试剂盒中的应用，所述标志物是肝癌样本来源的mirna-486-3p，mirna-486-3p的序列信息如seqidno.1所示。本发明还提供了上述与肝癌索拉非尼相关的mirna标志物的检测试剂。所述试剂包括qpcr实验中使用的反转录引物和/或扩增mirna-486-3p的引物；所述反转录引物为oligo(dt)特异性的rt引物；所述扩增引物的上游引物序列如seqidno.2所示，扩增引物的下游引物为通用反向引物；在本发明的一个具体的实施方案中，所述通用反向引物genecopoeia。本发明还提供了与肝癌索拉非尼耐药相关的mirna标志物的检测试剂在制备诊断肝癌索拉非尼耐药的试剂盒中的应用，所述试剂包括qpcr实验中使用的反转录引物和/或扩增mirna-486-3p的引物；所述反转录引物为oligo(dt)特异性的rt引物；扩增引物的上游引物序列如seqidno.2所示，扩增引物的下游引物为通用反向引物在本发明的一个具体的实施方案中，所述通用反向引物购自genecopoeia。所述诊断试剂盒包含上述引物序列。本发明还提供了一种诊断肝癌索拉非尼耐药的试剂盒，所述试剂盒包含与肝癌索拉非尼耐药相关的mirna标志物的检测试剂，所述试剂包括qpcr实验中使用的反转录引物和/或扩增mirna-486-3p的引物；所述反转录引物为oligo(dt)特异性的rt引物；扩增引物的上游引物序列如seqidno.2所示，扩增引物的下游引物为通用反向引物在本发明的一个具体的实施方案中，所述通用反向引物购自genecopoeia。优选地，本发明的诊断试剂盒还包含qpcr常用的试剂和酶，所述常用试剂包含pcr反应缓冲液、核糖核酸酶抑制剂、dntp等；所述酶包含m-mlv逆转录酶、polya多聚酶。还可以包括标准品和/或对照品。具体而言，本发明解决技术问题的技术方案包括：1.建立索拉非尼耐药的肝癌细胞株。2.肝癌索拉非尼耐药的mirna差异表达谱分析：将索拉非尼耐药和索拉非尼敏感的肝癌细胞株的mirna差异表达谱分析，在索拉非尼耐药和索拉非尼敏感的肝癌细胞株上进行验证，筛选差异表达的mirna。3.对已筛选的差异表达mirna在大样本人群中进行定量分析。上述步骤3中的大样本定量分析采用qpcr进行验证。采用qpcr进行差异表达mirna的验证，具体操作步骤：(1)提取样本总rna；(2)将步骤1获得的rna逆转录成cdna；(3)在荧光实时定量pcr仪上将mirna和参照基因进行扩增检测；(4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。步骤(1)具体操作为：(1.1)肝癌组织标本在组织破碎仪进行破碎，细胞标本及破碎后的组织加入trizol，室温保存5min(1.2)加氯仿0.2ml，震荡后充分混匀，室温下放置5-10min(1.3)12000rpm高速离心15min，吸取上层水相到另一新离心管，注意不要吸到两层水相之间的蛋白。移入新管，加入等体积的-20℃摄氏度预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；(1.4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/mltrizol的比例加入75％depc乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；(1.5)弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入depc处理过的水溶解沉淀。(1.6)用nanodrop2000紫外分光光度计测量rna纯度及浓度，冻存于-70℃。步骤(2)具体操作为：采用加尾法将总rna中的mirna反转录成cdna。加尾法的实验原理是：在小rna3’末端由polya聚合酶加上一段polya尾巴，然后用一个3’末端含有一段polyt的长引物将mirna逆转录成cdna，所得到的cdna的长度比较适合进行荧光定量pcr。在本发明的一个具体的实施方案中，使用加尾法将mirna反转录成cdna。具体操作步骤为：将10pg-1μg的总rna模板与2μl10*缓冲液、2μldatp(10mm)、0.5μlpolya多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂和无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl的0.5μg/μloligo(dt)特异性rt引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断rna和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl5*缓冲液、1μldntp(10mm)，0.5μlm-mlv逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂，10μlpolya反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，42℃孵育1h。未稀释的cdna模板保存在-20℃以备用。步骤(3)的具体实施方法为：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl：正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应。扩增mirna-486-3p的正向引物序列如seqidno.2所示,反向引物为通用反向引物(购自杭州擎科生物技术有限公司)本发明的有益效果是：1.目前缺乏肝癌索拉非尼耐药的标志物，本发明提供的mirna是一种新的生物标志物。结果易于检测，稳定可靠，有助于肝癌索拉非尼耐药的辅助诊断，并且为癌症耐药标志物的研究提供借鉴意义。2.通过检测肝癌中的mirna表达诊断肝癌索拉非尼耐药的试剂盒，有助于提前判断索拉非尼对肝癌患者的疗效。可以在肝癌病人进行手术或者病理穿刺取得肝癌组织后，即刻测定，在使用索拉非尼前即可评估药物疗效，为患者提供个性化的治疗方案，快速掌握病情预后。3.mirna检测试剂盒来源于mirna芯片分析，并进行qpcr方法在大样本中进行验证，最终服务于一线临床问题，保证了试剂盒来源可靠，可应用性强，为相关的生物标志物研发提供经验。附图说明下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；图1为索拉非尼耐药huh7肝癌细胞株(huh7-sr)与正常huh7肝癌细胞株(huh7-wt)的候选mirna的表达量分析图。图2为索拉非尼耐药hepg2肝癌细胞株(hepg2-sr)与正常hepg2肝癌细胞株(hepg2-wt)的候选mirna的表达量分析图。图3为40例索拉非尼治疗肝癌患者肝癌组织与癌旁组织的mirna-486-3p表达量比较结果。图4为肝癌患者mirna-486-3p表达量与患者预后(a为总体生存率和b为无疾病生存率)的关系图。具体实施方式下面结合具体的实施例子进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。将肝癌细胞株huh7以及hepg2(购自atcc)长期进行索拉非尼诱导，使其成为对索拉非尼耐药的肝癌细胞株。与正常肝癌细胞株一起成为2对肝癌细胞株进行实验。实施例1肝癌索拉非尼耐药的mirna筛选总rna提取(1)将索拉非尼耐药huh7细胞株和正常huh7细胞株，加入trizol，室温保存5min(2)加氯仿0.2ml，震荡后充分混匀，室温下放置5-10min(3)12000rpm高速离心15min，吸取上层水相到另一新离心管，注意不要吸到两层水相之间的蛋白。移入新管，加入等体积的-20摄氏度预冷℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；(4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/mltrizol的比例加入75％depc乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；(5)弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入depc处理过的水溶解沉淀(6)用nanodrop2000紫外紫外分光光度计测量rna纯度及纯度，冻存于-70摄氏度。(7)总rna送mirna芯片测定(上海康成生物工程有限公司)，进行mirna表达谱检测：mirna芯片检测结果表明，在26条mirna中，mirna378a-3p、mirna-486-3p、mirna-328-3p、mirna-378a-5p、mirna-671-3p、的表达在索拉非尼耐药的细胞株中表达下降，可作为候选标志物，其中，mirna-378a-3p和mirna-486-3p下降明显。实施例2qpcr验证差异表达的mirna(1)根据mirna芯片的检测结果，选择mirna378a-3p、mirna-486-3p、mirna-328-3p、mirna-378a-5p、mirna-671-3p进行细胞株上qpcr验证。按照实例1中的总rna提取方法，将索拉非尼耐药的huh7和正常huh7，索拉非尼耐药的hepg2和正常hepg2,2对肝癌细胞株进行总rna提取。(2)逆转录rna将10pg-1μg的总rna模板与2μl10*缓冲液、2μldatp(10mm)、0.5μlpolya多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂和无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl0.5μg/μloligo(dt)特异性rt引物(购自genecopoeia,cat.no.qp017/qp018)，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断rna和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl5*缓冲液、1μldntp(10mm)，0.5μlm-mlv逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂，10μlpolya反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，42℃孵育1h。未稀释的cdna模板保存在-20℃以备用。(3)qpcr反应采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应。扩增mirna-486-3p的正向引物序列如seqidno.2所示,反向引物为通用反向引物(购自genecopoeia,cat.no.qp015/qp016)；mirna378a-3p、mirna-486-3p、mirna-328-3p、mirna-378a-5p、mirna-671-3p的正向引物序列分别如seqidno.3-6所示。(4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。分析发现(图1-2)，在2对肝癌细胞株中，其中mirna-486-3p在耐药细胞株中下降更明显，且mirna芯片分析位列第2位，因此选择mirna-486-3p作为最终的肝癌索拉非尼耐药标志物进行进一步检测。实施例3发明人在浙江大学医学院附属邵逸夫医院收集了40例肝癌患者的肝癌组织标本及癌旁正常肝组织。40例患者均为索拉非尼治疗。进行肝癌组织和癌旁组织的mirna-486-3p的表达量检测。肝癌组织和癌旁组织进行匀浆破碎后，按照实例2中的总rna提取步骤，提取总rna。按照上述中的步骤依次进行逆转录rna成cdna，qpcr反应，结果分析。结果如图3所示，在用过索拉非尼的肝癌组织中mirna-486-3p的表达量明显低于癌旁正常组织。在肝癌数据库中分析mirna-486-3p与肝癌生存预后的关系。如图4和表1所示，发现低表达mirna-486-3p的肝癌病人无论是总生存率还是无病生存率，均差于高表达mirna-486-3p的病人。表1mirna-486-3p表达与肝癌病人总生存率还是无病生存率的关系表时间(月)0020406080mirna-486-3p低表达的总生存人数66321792mirna-486-3p高表达的总生存人数100675430mirna-486-3p低表达无病生存人数4812752mirna-486-3p高表达无病生存人数118644450序列表<110>浙江大学<120>一种与肝癌索拉非尼耐药相关的mirna标志物及其应用<141>2020-02-25<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cggggcagcucaguacaggau21<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cggggcagctcagtacag18<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3actggacttggagtcagaaggc22<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctggccctctctgccctt18<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ctcctgactccaggtcctgt20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6atattccggttctcagggctc21当前第1页12