抗TPD52单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用的制作方法

本发明属于细胞工程领域，尤其涉及抗tpd52单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用。

背景技术：

肿瘤蛋白d52(tumorproteind52,tpd52)起初是在乳腺癌的cdna文库中克隆得到，含有tpd52扩增的乳腺癌作为临床上一种分子亚型，对乳腺癌的诊断和治疗具有重要意义。tpd52结构较为保守，有1个卷曲螺旋结构域及2个pest结构域，其多个转录本来自于不同的剪接体，并表达于不同的组织。

过去的研究认为，tpd52对于肿瘤的发生发展发挥着重要作用，但在不同肿瘤中，其发挥的作用是不同的。多项研究发现，tpd52高表达于包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、子宫内膜癌在内的多种癌组织中，促进细胞增殖及癌症进程。也有研究表明，tpd52在脂肪肉瘤、透明细胞肾细胞癌以及肺癌中都是低表达的。在肾细胞癌中，tpd52可以通过pi3k/akt信号通路抑制癌细胞的增殖、迁移、侵袭及emt(epithelial–mesenchymaltransition，emt)转换。除了在各种癌症中发挥不同作用，还有证据表明tpd52在dna损伤修复过程中扮演着双重角色。有证据显示，抑制tpd52的表达可以弱化前列腺癌细胞的dna损伤修复能力并诱导细胞自噬的产生，从而增强前列腺癌细胞对电离辐射的敏感性，而在此过程中，抑制tpd52的表达会增强atm的磷酸化，但不会影响atm的蛋白水平。另一项研究却发现，在乳腺癌细胞及balb/c3t3细胞中，tpd52与atm具有相互作用，tpd52的过表达会降低atm的蛋白稳定性及磷酸化水平。mayer等人在人结直肠癌和恶性胶质瘤标本，发现了包含tpd52蛋白在内的抗原肽谱，预示tpd52蛋白可能成为肿瘤分子伴侣多肽疫苗疗法的攻击靶标。

tpd52与肿瘤生物学行为密切相关，可能参与肿瘤形成、增殖、侵袭和转移。tpd52单克隆抗体具有广泛的应用前景，可以用于多种类型肿瘤的检测。tpd52已被多种肿瘤纳入肿瘤蛋白标志物候选名单，并作为一个独立有效的预后因子。此外，tpd52诱导机体产生对肿瘤的保护性免疫，可能成为一个潜在的肿瘤免疫治疗靶标。目前，商品化的tpd52抗体亲和力低(或者说抗体特异性差)，几乎不能检测到内源的人或小鼠来源的tpd52蛋白。

因此，制备出tpd52的单克隆抗体，并将之用于相关样本的检测，对于tpd52功能的研究及生物学认识具有重要意义。

技术实现要素：

本发明一个目的是提供一株杂交瘤细胞株tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5。

本发明提供了保藏号为cgmccno.19287的抗鼠tpd52单克隆抗体杂交瘤细胞株tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5。

本发明另一个目的是提供一种单克隆抗体。

本发明提供的由第一个目的的保藏号为cgmccno.19287的抗鼠tpd52单克隆抗体杂交瘤细胞株tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5产生的单克隆抗体。

本发明还有一个目的是提供单克隆抗体的应用。

本发明提供的另一个目的是单克隆抗体在如下1)-8)中至少一种中的应用：

1)检测tpd52蛋白；

2)检测细胞中tpd52蛋白；

3)检测待测样本中tpd52蛋白；

4)特异结合tpd52蛋白；

5)制备检测tpd52蛋白的产品；

6)制备检测细胞中tpd52蛋白(是否表达或是否含有)的产品；

7)制备检测待测样本中tpd52蛋白(是否表达或是否含有)的产品；

8)制备特异结合tpd52蛋白(细胞中的tpd52蛋白或待测样本中的tpd52蛋白)的产品。

上述应用中，所述产品可以为试剂盒或胶体金快速检测试纸条，但不限于此，也可以为蛋白质印迹检测产品或酶联免疫吸附检测产品。

上述检测可以采用蛋白质印迹检测或酶联免疫吸附检测，也可以按照试剂盒或胶体金快速检测试纸条的说明书记载的方法检测。

上述tpd52蛋白为内源tpd52蛋白或天然tpd52蛋白或重组tpd52蛋白。

上述tpd52蛋白来源于天然细胞，或来源于鼠源细胞或人源细胞；

上述应用中，所述细胞为天然细胞。

上述应用中，所述细胞为鼠源细胞或人源细胞。

上述应用中，所述细胞为肿瘤细胞。

上述应用中，所述肿瘤细胞为含有tpd52蛋白的肿瘤细胞。

上述应用中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、脂肪肉瘤细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞和/或子宫内膜癌细胞。

本发明提供的一种分泌抗tpd52单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为小鼠杂交瘤细胞株tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5，该细胞株已于2020年1月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno.19287，分类命名：杂交瘤细胞株。该单克隆抗体，其为小鼠igg2a亚型单克隆抗体；其可识别重组和天然的人源和鼠源tpd52分子。

本发明的优点及有益效果：

(1)本发明提供了一种抗鼠肿瘤蛋白d52(tpd52)单克隆抗体，该单克隆抗体由杂交瘤细胞株tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5分泌获得。通过elisa、westernblot、等实验证明其能识别重组和天然的肿瘤蛋白d52。

(2)本发明获得的杂交瘤细胞株(tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5)产生的单克隆抗体为一种igg2a类抗体，与tpd52的结合有极强特异性和敏感性。

(3)本发明获得的杂交瘤细胞株(tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5)产生的单克隆抗体可应用于蛋白质印迹、酶联免疫吸附等，特异性和灵敏度高，为肿瘤蛋白td52的功能研究提供支持。

(4)本发明获得的杂交瘤细胞株(tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5)产生的单克隆抗体可用于检测癌细胞的试剂盒的开发(可为试剂盒开发提供原材料)，检测的癌细胞可以为乳腺癌、肺癌、前列腺癌、脂肪肉瘤、肾细胞癌、卵巢癌、肝癌、子宫内膜癌。

附图说明

图1为重组鼠源tpd52蛋白在大肠杆菌中的诱导表达情况。

图2为重组鼠源tpd52蛋白150mm咪唑洗脱纯化及浓缩后的结果。

图3为tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5抗体的识别特性和实际应用效果。

图4为tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5抗体可识别包括鼠源及人源的多种细胞中的tpd52。

图5为tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5抗体与市场上已有的商业化抗体的效果对比结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、重组鼠源tpd52蛋白的制备

一、重组鼠源tpd52抗原的制备

查找ncbi数据库，鼠源蛋白tpd52的基因id为21985，编码该蛋白的基因的核苷酸序列(nm_001025262.2)为序列表中序列1(去掉终止密码子),其编码的氨基酸序列(np_001020433.1)为序列表中序列2。

以序列1所示的dna分子为模板，用如下上游引物和下游引物进行pcr扩增，pcr的过程中在基因5'和3'端分别加入bamhⅰ和xhoⅰ酶切位点，得到pcr产物。

其中，扩增鼠源tpd52基因的引物序列为：

上游引物：5'-ataggatccatggagtgcagagatatgg-3'(序列3)；

下游引物：5'-ataatcgagggggctctctgtcatctgt-3’(序列4)；

上游引入bamhi内切酶位点，下游引入xhoi内切酶位点。

将上述pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别将pcr产物和用于表达的质粒载体pet28(a)(tian,c.etal.krab-typezinc-fingerproteinapakspecificallyregulatesp53-dependentapoptosis.natcellbiol11,580-591(2009))进行bamhⅰ和xhoⅰ酶切，再次电泳回收，以t4dna连接酶连接，得到重组质粒pet28(a)-tpd52。

重组质粒pet28(a)-tpd52为将序列表中序列1所示的tpd52基因替换pet28(a)载体的bamhⅰ和xhoⅰ酶切位点间的片段得到的质粒，序列1所示的tpd52基因与载体上的his标签共同表达，得到融合蛋白tpd52，该融合蛋白由n端his标签、thrombin、t7标签、序列2所示的tpd52蛋白、c端his标签及无义氨基酸残基构成(其氨基酸序列如序列5所示)。

将上述重组质粒pet28(a)-tpd52转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑取平板上的克隆接种，摇菌并提取质粒，然后进行酶切鉴定。挑选酶切鉴定阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的转化大肠杆菌感受态细胞bl21，得到重组菌bl21/pet28(a)-tpd52。

二、蛋白表达和纯化

挑取重组菌bl21/pet28(a)-tpd52到含卡那霉素10μg/ml的20mllb培养基中，37℃摇菌过夜，得到菌液。按1:50的体积比将培养过夜的菌液转接至1000ml含卡那霉素10μg/ml的lb培养基，37℃振荡培养至od600为0.6-1.0。加入1mmol/l的iptg，30℃震荡培养6h，收菌后超声破碎，得到细菌裂解液，再将细菌裂解液10,000g，4℃离心10min取上清液，上清液使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化(该融合蛋白带有组氨酸标签)。用150mm咪唑进行洗脱后，收集洗脱液并浓缩，然后用0.9％的nacl溶液清洗并再次浓缩，得到纯化的融合蛋白tpd52溶液。

将上述超声破碎后的细菌裂解液和纯化融合蛋白tpd52溶液进行sds-page分离检测。

图1为超声破碎后的细菌裂解液中融合组氨酸标签的融合蛋白tpd52的表达情况，可以看出，表达产物融合蛋白tpd52的大小约为38kd(箭头所指)，使用10％sds-page凝胶，蛋白为可溶状态；

图2为纯化融合蛋白tpd52溶液的sds-page检测结果，可以看出，concentrate为融合tpd52蛋白150mm咪唑洗脱、纯化、清洗及浓缩后的结果，大小为38kd，得到目的蛋白。

经检测，纯化后的融合蛋白tpd52溶液的浓度为550μg/ml(溶剂为0.9％的nacl溶液)，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2、杂交瘤细胞系的建立及分泌的单克隆抗体与应用

一、小鼠免疫

首次免疫，取实施例1制备的纯化融合蛋白tpd52溶液(550μg/ml)与弗氏完全佐剂等体积混合，冰上乳化，得到乳化液；再取乳化液免疫4-6周龄雌性balb/c小鼠(购自维通利华实验动物中心)，其中每只小鼠注射400μl乳化液(含80μg纯化融合蛋白tpd52)，免疫方法为腹部皮下和背部皮下多点注射。

间隔三周后进行第二次免疫，将弗氏完全佐剂替换成弗氏不完全佐剂，免疫剂量和方法一致。

再间隔三周后进行第三次免疫，使用弗氏不完全佐剂，免疫剂量和方法一致。

第三次免疫后7天尾静脉采集小鼠血，间接elisa方法检测血清效价。当血清效价达到1:10,000以上后准备细胞融合。

挑选血清效价最高的小鼠(效价1:400,000)，在融合前3天进行第四次免疫，去除弗氏佐剂，免疫剂量一致，免疫方法为腹腔注射。

弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均使用商品化产品。

上述免疫血清效价检测采用间接elisa法测定免疫血清效价，具体如下：取实施例1制备的纯化融合蛋白tpd52溶液(550μg/ml)用碳酸盐缓冲液(0.05m，ph9.6)稀释，稀释后包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔(包被浓度为1μg/ml)，4℃过夜。次日，使用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次，用5％脱脂牛奶封闭液300μl/孔，37℃封闭2h，使用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次，小鼠于第三次免疫后7天尾静脉采血，鼠免疫血清用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)稀释，加入96孔板，100μl/孔，37℃，1h，pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次后，加入1:5000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠igg(sigma公司)，100μl/孔，37℃孵育40min，同上洗板后，tmb显色，100μl/孔，37℃避光15min，加50μl/孔2mh2so4终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。

二、杂交瘤细胞的制备

无菌取四次免疫小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株sp20按5:1的比例混合，500g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，将在37℃水浴保温的50％聚乙二醇(peg，mw4000，sigma公司)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1分钟加入37℃预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物500g室温离心5min，弃上清，加入hat培养液(次黄嘌呤(h)、氨基喋呤(a)和胸腺嘧啶核苷(t)(hat，sigma))轻轻重悬细胞，将细胞分至含饲养细胞层的96孔板中，每孔100μl。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半hat培养液，连续数日，直至有克隆形成，更换ht培养液(次黄嘌呤(h)和胸腺嘧啶核苷(t)(ht，sigma))培养三天，通过间接elisa方法筛选出能分泌抗tpd52重组蛋白抗体的杂交瘤细胞(以与阴性培养基a450的比值大于2.1判为阳性)，更换1640完全培养基。

三、筛选分泌抗鼠tpd52单克隆抗体的杂交瘤细胞株

挑选elisa效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞，进行内源westernblot验证，选择内源westernblot阳性结果的克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2～3次，直至100％细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗tpd52单克隆抗体杂交瘤细胞株1株，命名为tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5。通过细胞扩增培养后液氮冻存。

将该杂交瘤细胞株于2020年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno.19287，分类命名：杂交瘤细胞株。

四、抗tpd52单克隆抗体的制备

将上述三制备的阳性率达100％的tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5杂交瘤细胞株以2×10⁵个细胞/只的量注入液体石蜡预处理过的10-12周龄的balb/c雌性小鼠腹腔，饲养观察7天后小鼠腹部开始膨大，10天后采集小鼠腹水，3000g，4℃离心20min收集腹水层液体，为腹水抗体，即为抗鼠tpd52单克隆抗体。

五、抗tpd52单克隆抗体的性质分析

1、抗体亚型鉴定

采用博奥龙公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定上述四制备的抗鼠tpd52单克隆抗体的亚型，tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5分泌的抗鼠tpd52单克隆抗体的亚型重链为igg2a，轻链为κ链。

2、抗体效价检测

采用间接elisa方法检测上述四制备的抗鼠tpd52单克隆抗体的效价(方法同上述一中免疫血清效价检测)

具体如下：取实施例1制备的纯化融合蛋白tpd52溶液(550μg/ml)用碳酸盐缓冲液(0.05m，ph9.6)稀释，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔(包被浓度为1μg/ml)，4℃过夜。次日，使用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次，用5％脱脂牛奶封闭液300μl/孔，37℃封闭2h，使用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次，上述四制备的抗鼠tpd52单克隆抗体用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)稀释，加入96孔板，100μl/孔，37℃，1h，pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次后，加入1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠igg(sigma公司)，100μl/孔，37℃孵育40min，同上洗板后，tmb显色，100μl/孔，37℃避光15min，加50μl/孔2mh2so4终止反应，测450nm吸收值，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断腹水单抗的效价。

上述四制备的抗鼠tpd52单克隆抗体(腹水单抗)的elisa效价为1:40万。

3、抗体的westernblot鉴定(即抗体的特异性检测)

永生化小鼠骨髓来源的巨噬细胞(immortalizedbone-marrow-derivedmacrophages，ibmdms)记载在如下文献中：shi,j.etal.cleavageofgsdmdbyinflammatorycaspasesdeterminespyroptoticcelldeath.nature526,660-665(2015)

tpd52^-/-的ibmdms，为将ibmdms中的tpd52基因敲除获得，采用cripsr-cas9技术构建，靶序列为cgtcacgtcttgccaccctt。

将野生型及tpd52^-/-的ibmdms，用ripa裂解缓冲液(50mmtris-hcl(ph7.4),150mmnacl,1％np-40,0.1％sds)裂解后上样，经15％sds-page凝胶电泳后，将蛋白转移至pvdf膜上，5％脱脂奶粉封闭过夜，ph7.6的tris-hcl缓冲液(含有0.5％(v/v)tween-20)洗膜3次，每次10min，1:500加入上述四制备的抗鼠tpd52单克隆抗体，4℃孵育过夜，ph7.6的tris-hcl缓冲液(含有0.5％(v/v)tween-20)洗膜3次，每次10min，把膜转移到1:4000稀释的羊抗鼠的二抗中，室温孵育50min，tbst洗膜3次之后，使用化学发光底物反应液显影。

结果如图3所示，可以看出，与tpd52敲除的ibmdms相比，抗tpd52单克隆抗体在野生型细胞中检测出单一的特异性条带，表明本发明制备的单抗可以在免疫印迹中特异地检出ibmdms中的鼠源tpd52天然蛋白，大小约为25kd。

六、单抗的应用

1、抗鼠tpd52单克隆抗体检测鼠源和人源的tpd52蛋白

分别收集鼠源ibmdm(shi,j.etal.cleavageofgsdmdbyinflammatorycaspasesdeterminespyroptoticcelldeath.nature526,660-665(2015))、鼠源raw264.7(huai,w.etal.arylhydrocarbonreceptornegativelyregulatesnlrp3inflammasomeactivitybyinhibitingnlrp3transcription.natcommun5,4738(2014))、人源thp1(shi,j.etal.inflammatorycaspasesareinnateimmunereceptorsforintracellularlps.nature514,187-192(2014))、人源mcf7(liu,d.etal.lsectinontumor-associatedmacrophagesenhancesbreastcancerstemnessviainteractionwithitsreceptorbtn3a3.cellres29,365-378(2019))、人源hela(shi,j.etal.inflammatorycaspasesareinnateimmunereceptorsforintracellularlps)、人源hek293t(wang,j.etal.towardanunderstandingoftheproteininteractionnetworkofthehumanliver.molsystbiol13,965(2017))细胞，用ripa裂解缓冲液裂解后，按照上述五的3中的方法采用四制备的抗鼠tpd52单克隆抗体检测这些细胞中的tpd52。

结果如图4所示，可以看出，抗鼠tpd52单克隆抗体可以在免疫印迹中特异地检出鼠源ibmdm、鼠源raw264.7、人源thp1、人源mcf7、人源hela、人源hek293t细胞中的tpd52蛋白。

2、抗鼠tpd52单克隆抗体检测

分别用不同来源的tpd52抗体(sigma：sab2102519、abcam：ab182578)检测wt及tpd52^-/-的ibmdms的tpd52。

检测方法与上述五的3相同，不同的是将上述抗鼠tpd52单克隆抗体(tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5)替换为sab2102519(sigma)和ab182578(abcam)。

结果如图5所示，可以看出，杂交瘤细胞株tpd52-2c4-2e12-2d3-4c5分泌的tpd52单抗可以更好地检测出细胞中内源tpd52蛋白。

sequencelisting

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>抗tpd52单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用

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