本发明涉及一种肝素c5异构酶高催化活性菌株的构建方法，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：肝素(heparin)和硫酸乙酰肝素(heparinsulfate)是由葡萄糖醛酸和n-乙酰葡糖胺通过交替连接而成的，是由肝素前体经过一系列变构化及硫酸化作用而形成的一种直链带负电荷的线性多糖。肝素存在于动物细胞的表面或胞外基质中，临床上主要用于治疗血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术和术后抗凝血等。目前肝素的生产方法有生物提取法、化学酶法合成、全酶法合成。生物提取法主要是从动物小肠粘膜中提取，但动物组织中同时含有硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素等一系列其他的糖胺聚糖，易造成提取的肝素被污染；化学法生产周期长，过程繁琐；酶法合成产物单一，过程简单。为了得到结构均一性较好、生物安全的肝素，利用微生物进行肝素的合成可以有效避免上述问题。肝素c5异构酶催化葡萄糖醛酸5-cooh发生翻转形成艾杜糖醛酸，但目前肝素c5异构酶表达量低，催化活性低，不利于工业化生产。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种肝素c5异构酶突变体，所述肝素c5异构酶突变体的构建方法是：首先肝素c5异构酶的n端融合促溶标签set2，然后通过分子改造获得肝素c5异构酶突变体；所述分子改造包括(1)-(6)中的任意一种：(1)将肝素c5异构酶的106位氨基酸(按照建模时的序号计，应为153位氨基酸)由缬氨酸突变为精氨酸；(2)将肝素c5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；(3)将肝素c5异构酶的498位氨基酸(按照建模时的序号计，应为545位氨基酸)由天冬氨酸突变为精氨酸；(4)将肝素c5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸；(5)将肝素c5异构酶的352位氨基酸(按照建模时的序号计，应为399位氨基酸)由甘氨酸突变为谷氨酸；(6)将肝素c5异构酶的350位氨基酸(按照建模时的序号计，应为397位氨基酸)由赖氨酸突变为丙氨酸；所述肝素c5异构酶来源于斑马鱼(daniorerio)，氨基酸序列如seqidno.4所示；所述set2来源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，氨基酸序列如seqidno.5所示。编码所述肝素c5异构酶的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，编码set2的基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。本发明的第二个目的是提供编码上述肝素c5异构酶突变体的基因。本发明的第三个目的是提供含上述基因的质粒。在本发明的一种实施方式中，所述质粒包括pcold系列质粒。本发明的第四个目的是表达上述肝素c5异构酶突变体的基因工程菌。在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主包括大肠杆菌bl21(de3)。本发明的第五个目的是提供一种提高肝素c5异构酶催化活性的方法，首先肝素c5异构酶的n端融合酿酒酵母的促溶标签set2，然后通过分子改造获得肝素c5异构酶突变体；所述分子改造包括(1)-(6)中的任意一种：(1)将肝素c5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸；(2)将肝素c5异构酶的106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸；(3)将肝素c5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸；(4)将肝素c5异构酶的498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸；(5)将肝素c5异构酶的352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸；(6)将肝素c5异构酶的350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸；所述肝素c5异构酶的氨基酸序列如seqidno.4所示；所述set2的氨基酸序列如seqidno.5所示。本发明的第六个目的是提供一种生产肝素c5异构酶的方法，是以上述基因工程菌为生产菌株，诱导发酵生产肝素c5异构酶。在本发明的一种实施方式中，所述方法是向od600为0.6-0.8的生产菌株培养物中，加入iptg，12-25○с，200-220rpm诱导发酵。本发明还提供了上述肝素c5异构酶突变体在食品、化工或制药领域的应用。本发明的有益效果：本发明首次采用微生物细胞中以pcold系列载体表达斑马鱼来源的c5，得到的酶催化活性为1.87u/ml。本发明首次采用微生物细胞表达n端融合促溶标签set2的c5，得到的酶催化活性为2.41u/ml，相比对照提高了29％。本发明首次采用微生物细胞表达106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸后的c5，得到的酶催化活性为5.81u/ml，相比未突变前提高了141％，比酶活为145.14u/mg，相比未突变前提高了128％。本发明首次采用微生物细胞表达106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸后的c5，得到的酶催化活性为2.80u/ml，相比未突变前提高了16％，比酶活为70u/mg，相比未突变前提高了10％。本发明首次采用微生物细胞表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸后的c5，得到的酶催化活性为2.82u/ml，相比未突变前提高了17％，比酶活为70.5u/mg，相比未突变前提高了11％。本发明首次采用微生物细胞表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸后的c5，得到的酶催化活性为4.29u/ml，相比未突变前提高了78％，比酶活为107.2u/mg，相比未突变前提高了69％。本发明首次采用微生物细胞表达352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸后的c5，得到的酶催化活性为3.83u/ml，相比未突变前提高了59％，比酶活为95.8u/mg，相比未突变前提高了51％。本发明首次采用微生物细胞表达350位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸后的c5，得到的酶催化活性为3.16u/ml，相比未突变前提高了31％，比酶活为78.9u/mg，相比未突变前提高了24％。附图说明图1是肝素c5异构酶催化过程图。图2是肝素c5异构酶n端融合促溶标签set2的质粒图谱。图3是肝素c5异构酶n端融合mbp、sumo、set2后的蛋白电泳图(a)和酶活(b)，其中，泳道1：maker；泳道2：e.colibl21(de3)-pcoldiii-mbp-c5胞内上清；泳道3：e.colibl21(de3)-pcoldiii-sumo-c5胞内上清；泳道4：e.colibl21(de3)-pcoldiii-set2-c5胞内上清；泳道5：对照胞内上清；泳道6：对照胞内沉淀；泳道7：e.colibl21(de3)-pcoldiii-mbp-c5胞外沉淀；泳道8：e.colibl21(de3)-pcoldiii-sumo-c5胞内沉淀；泳道9：e.colibl21(de3)-pcoldiii-set2-c5胞内沉淀。图4是各个肝素c5异构酶突变体的酶活图，图中v153r、v153k、d545r、d545y、g399e、k397a中的氨基酸序列是按照建模时的序号计算，分别对应实施例2中的c5-v106r、c5-v106k、c5-d498r、c5-d498y、c5-g352e、c5-k352a。具体实施方式1.astiv:酰基硫酸转移酶iv，编码该酶的基因序列参见ncbi中geneid:83783。2.c5:肝素c5异构酶，编码该酶的基因序列参见ncbi中geneid:100007670(seqidno.1)。3.2-ost:肝素硫酸转移酶2-ost，编码该酶的基因序列参见ncbi中geneid:395140(seqidno.2)。4.mbp:麦芽糖结合蛋白，编码该酶的基因序列参见ncbi中geneid:948538。5.set2:促溶标签2，编码该酶的基因序列如seqidno.3所示。6.sumo:小泛素蛋白，编码该酶的基因序列参见ncbi中geneid:852122。7.pnps:对硝基苯磺酸8.pnp:对硝基苯酚9.pap:3′5′-二磷酸腺苷10.c5的酶活测定方法:以n-硫酸化肝素前体为底物，构建催化反应体系(见图1)，包括20mmtris-hcl(ph7.4)，50mmpnps，0.5mmpap，0.5mgastiv，0.3mg2-ost，0.3mgc5，0.3mgn-硫酸化肝素前体，37℃，反应8h后100℃加热5min终止反应后在400nm波长下测定吸光值。c5的酶活的定义：在最适反应条件下(37℃，ph7.4)，每小时生成1μmol/l的pnp所需的酶量。实施例1：c5、2-ost和astiv的制备1.表达astiv、2-ost或c5的重组大肠杆菌的构建将编码astiv的基因与pcoldiii载体连接，获得重组质粒pcoldiii-astiv；将重组质粒pcoldiii-astiv转化到e.colibl21(de3)中，获得表达astiv的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)-pcoldiii-astiv。将编码2-ost的基因与pet28a载体连接，获得重组质粒pet28a-2ost；将重组质粒pet28a-2ost转化到e.colibl21(de3)中，获得表达2-ost的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)-pet28a-2ost。将编码c5的基因与pcoldiii载体连接，获得重组质粒pcoldiii-c5；将重组质粒pcoldiii-c5转化到e.colibl21(de3)中，获得表达c5的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)-pcoldiii-c5。2.表达astiv、2-ost或c5的重组大肠杆菌的诱导表达挑取以pet系列载体构建的重组菌株单菌落于3mllb培养基(加入终浓度为100μg/ml的卡那青霉素)中，37℃，220rpm过夜培养。按1％(v/v)的比例转接50mltb培养基(加入终浓度为100μg/ml的卡那青霉素)，37℃，220rpm培养2h至od600nm大约在0.6-0.8，加入终浓度为0.5mm的iptg，30℃诱导10h。挑取以pcold系列载体构建的重组菌株单菌落于3mllb培养基(加入终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素)中，37℃，220rpm过夜培养。按1％(v/v)的比例转接50mltb培养基(加入终浓度为50μg/ml的卡那青霉素)，37℃，220rpm培养2h至od600nm大约在0.6-0.8，加入终浓度为0.5mm的iptg，15℃诱导22h。将上述培养物于8500rpm，4℃离心5min收集菌体，用预冷的tris-hcl(ph7.4)清洗两遍，重悬菌体至50ml，冰浴超声，条件为：功率300w，工作4s，间歇6s，10min，4℃，12000r/min离心30min，分别收集上清和沉淀，上清即为所需粗酶液。3.astiv、2-ost和c5的纯化首先用25ml溶液a(20mmol/ltris-hcl，300mmol/lna2po4，ph7.4)平衡ni-histrapff柱，将粗酶液透过0.22μm滤膜后，上清液以1.5ml/min的速度通过ni-histrapff柱，分别用10％，30％，100％的溶液b(20mmol/ltris-hcl，300mmol/lna2po4，500mmol/l咪唑，ph7.4)进行洗脱并收集相对应的洗脱液。将纯化后的astiv、2-ost蛋白用于检测c5的酶活。测得c5的酶活为1.87u/ml，以此作为对照。实施例2：c5的n端融合酿酒酵母的促溶标签set2将c5的n端融合mbp、set2或sumo，将融合后的基因分别与pcoldiii载体连接，分别获得重组质粒pcoldiii-mbp-c5、pcoldiii-set2-c5、pcoldiii-sumo-c5(见图2)；将重组质粒pcoldiii-mbp-c5、pcoldiii-set2-c5、pcoldiii-sumo-c5分别转化到大肠杆菌中，获得融合表达c5与mbp、set2或sumo的重组大肠杆菌e.colibl21(de3)-pcoldiii-mbp-c5、e.colibl21(de3)-pcoldiii-set2-c5或e.colibl21(de3)-pcoldiii-sumo-c5。诱导表达及纯化过程同实施例1。结果如图3所示，测得c5的n端融合mbp、set2、sumo后的酶活分别为1.91u/ml、2.41u/ml、2.41u/ml。实施例3：c5的分子改造根据已报道的酶结构分析，经过discoverystudio分子对接，选择底物结合口袋5埃范围内的氨基酸位点val06asp498、gly352、lys350，以pcoldiii-set2-c5为基础，进行定点饱和突变(突变引物见表1)。表1突变引物引物名称引物val106-fttgagggttacaacgtggaannncgtgaccgtgtgaagtgcatval106-rttccacgttgtaaccctcaaagctlys350-fgatcatggtgacccgtnnnctgggtgaaggttttcgtgcglys350-racgggtcaccatgatcggcgly352-ftcatggtgacccgtaaactgnnngaaggttttcgtgcgctggaggly352-rcagtttacgggtcaccatgatcggasp498-faacctggcgcgttggnnntatcacaccacccacatcaaccasp498-rccaacgcgccaggttc结果如图4所示，采用大肠杆菌表达106位氨基酸由缬氨酸突变为精氨酸后的c5-v106r，得到的酶催化活性为5.81u/ml，相比未突变前提高了141％，比酶活为145.14u/mg，相比未突变前提高了128％；采用大肠杆菌表达106位氨基酸由缬氨酸突变为赖氨酸后的c5-v106k，得到的酶催化活性为2.80u/ml，相比未突变前提高了16％，比酶活为70u/mg，相比未突变前提高了10％；采用大肠杆菌表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为精氨酸后的c5-d498r，得到的酶催化活性为2.82u/ml，相比未突变前提高了17％，比酶活为70.5u/mg，相比未突变前提高了11％；采用大肠杆菌表达498位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸后的c5-d498y，得到的酶催化活性为4.29u/ml，相比未突变前提高了78％，比酶活为107.2u/mg，相比未突变前提高了69％；采用大肠杆菌表达352位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸后的c5-g352e，得到的酶催化活性为3.83u/ml，相比未突变前提高了59％，比酶活为95.8u/mg，相比未突变前提高了51％；采用大肠杆菌表达352位氨基酸由赖氨酸突变为丙氨酸后的c5-k352a，得到的酶催化活性为3.16u/ml，相比未突变前提高了31％，比酶活为78.9u/mg，相比未突变前提高了24％。转化、诱导表达及纯化过程同实施例1。实施例3：产物的分子量检测以测定c5-v106r酶活后的反应液为底物，加入肝素裂解酶i和iii，37℃，反应24h后100℃加热5min终止反应，8000rpm离心10min后过0.22μm的滤膜，然后进行lc-ms检测。lc洗脱条件为30min内甲醇浓度从0线性上升到40％。ms条件为在负离子模式下进行100-2000m/z扫描，其中氮气为载气，产物分子量为495.99。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种肝素c5异构酶高催化活性菌株的构建方法<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>1623<212>dna<213>人工序列<400>1gaattcccgaaaatcgacagccacccgcagcaaccgcagccgccggagccgccgccggtg60gttggtggcgttcgttatgaggaaatcgattgcctgattaacgacgatgcgaccattaag120ggtcgtcgtgagggcagcgaagtttacatgccgtttagctggatggagaaatatttcgaa180gtgtacggcaaggtggttcaatacgacggttatgatcgtttcgagtttagccacagctat240agcaaagtttacgcgcagcgtgaacaatatcacccgaacggcgtgttcatgagctttgag300ggttacaacgtggaagttcgtgaccgtgtgaagtgcatcagcggtgtggagggcgttccg360ctgagcacccagtggggtccgcaaggttacttttatgcgatccagattgcgcaatatggt420ctgagccactacagcaaaaacctgaccgagcgtccgccgcacgtggaagtttatgacacc480gcggaggaacgtgatagccgtagcagcgcgtggaccgtgccgaaaggttgcagcctgacc540cgtgtttacgataagacccgtgcgaccagcgtgcgtgaatttagcgcgccggagaacagc600gaaggcgttagcctgccgctgggtaacaccaaagacttcatcattagctttgatctgaag660ttcaccagcaacggcagcgtgagcgttatcctggagaccaccgaaaaaggtccgccgttc720gtgatccactatgttaccaccacccagctgattctgctgaaggaccgtgatatcacctac780ggtattggcccgcgtaccacctggaccaccgttacccgtgacctgctgaccgatctgcgt840aaaggtatcggcctgagcaacaccaaggcggtgaaagcgaccaagaccatgccgcgtcgt900gtggttaaactggtggtgcacggtaccggcaccattgacaacatcaccattagcaccacc960agccacatggcggcgttttacgcggcgagcgactggctggttcgtaaccaggatgagcgt1020ggtggctggccgatcatggtgacccgtaaactgggtgaaggttttcgtgcgctggagccg1080ggttggtacagcgcgatggcgcagggtcaagcgatgagcaccctggttcgtgcgtatctg1140atgaccaaagacgatcgttatctgaaggcggcgctgcgtgcgaccggtccgtttaagctg1200ccgagcgaacaacacggtgtgaaagcggttttcatgaacaagtacgactggtatgaggaa1260tacccgaccattccgagcagctttgttctgaacggcttcatctatagcctgattggtctg1320ttcgacctggcgcagaccgcgggcgagaagctgggtcgtgatgcgggtcaactgtacagc1380aagggtatggaaagcctgaaggtgatgctgccgctgtatgacaccggtagcggcaccatc1440tacgatctgcgtcactttattctgggtaccgcgccgaacctggcgcgttgggattatcac1500accacccacatcaaccagctgcaactgctgggtaccatcgacaacagcccgattttccgt1560gatagcgtgaaacgttggaagagctacctgaaaggtggccgtgcgaagcacaactaagaa1620ttc1623<210>2<211>891<212>dna<213>人工序列<400>2gatggtcctagacaagaagttgctttggatgaagaagatgatgttgttattatttacaac60agagttcctaagactgcttctacttctttcactaatattgcttatgatttgtgtgctaag120aacagataccatgttttgcatattaacactactaagaacaacccagttatgtctttgcaa180gatcaagttagatttgttaagaacgttacttcttggaaggaaatgaagccaggtttttac240catggtcatgtttcttacttggattttgctaagtttggtgttaagaagaagccaatttac300attaacgttattagagatcctattgaaagattggtttcttactattacttcttgagattt360ggtgatgattatagacctggtttgagaagaagaaagcaaggtgataagaagacttttgat420gaatgtgttgctgctggtggttctgattgtgctcctgaaaaattgtggttgcaaattcca480tttttttgtggtcattcttctgaatgttggaatgttggttctagatgggctttggaacaa540gctaaatataatttgattaatgaatactttttggttggtgttactgaagaattggaagat600tttattatgttgttggaagctgctttgccaagattcttcagaggtgctactgaattgtac660agaactggtaaaaaatctcatttgagaaaaactactgaaaaaaaattgccaactaaagaa720actattgctaaattgcaacaatctgaaatttggaaaatggaaaatgaattctacgaattc780gctttggaacaattccaattcgttagagctcatgctgttagagaaaaagatggtgaattg840tatattttggctcaaaatttcttctatgaaaaaatttatcctaaatctaat891<210>3<211>294<212>dna<213>人工序列<400>3gaccccgaagaggcgagtgttacttcaacagaagaaaccttaacgccagcacaggaggcc60gcagagaccgaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggaggctgagaccgct120gaacaaactagtgacgagaagaccaccggctggcggggcggccacgtggtggagggcctg180gccggcgagctggagcagctgcgggccaggctggagcaccaccctcagggccagcgggag240ccctccggcggctgcaagctgggcctgggtaccgagaacctgtacttccaatcc294<210>4<211>540<212>prt<213>人工序列<400>4glupheprolysileaspserhisproglnglnproglnproproglu151015proproprovalvalglyglyvalargtyrglugluileaspcysleu202530ileasnaspaspalathrilelysglyargarggluglysergluval354045tyrmetprophesertrpmetglulystyrphegluvaltyrglylys505560valvalglntyraspglytyraspargpheglupheserhissertyr65707580serlysvaltyralaglnarggluglntyrhisproasnglyvalphe859095metserphegluglytyrasnvalgluvalargaspargvallyscys100105110ileserglyvalgluglyvalproleuserthrglntrpglyprogln115120125glytyrphetyralaileglnilealaglntyrglyleuserhistyr130135140serlysasnleuthrgluargproprohisvalgluvaltyraspthr145150155160ala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