一种高效驱动目标基因在苹果原生质体细胞中稳定表达的启动子Pro-BIUTNT的制作方法

本发明涉及植物生物技术与生物化学领域，尤其涉及一种高效驱动目标基因在苹果原生质体细胞中稳定表达的启动子pro-biutnt。
背景技术：
：苹果(malusxdomesticaborkh.)为具有巨大经济价值的蔷薇科果树树种，与梨、柑橘、葡萄并称为世界四大水果。对苹果树体生长、发育及果实品质形成调控的分子机理研究，使得该树种有望成为研究高等多年生木本植物生长、发育、果实品质形成以及抗病与免疫的模式植物。对苹果中重要功能基因及特异信号转导途径的揭示，离不开苹果细胞中目标基因高效、稳定的表达技术。应用愈伤组织转化固然可以得到目标蛋白，但该技术方法周期长，研究结果易受细胞生理状态及细胞培养过程中体细胞变异的影响，且对于只发生在蛋白翻译后特定时间内的蛋白质翻译后修饰，则无法进行精确地研究，研究精度与效率不足以支撑苹果细胞精细信号转导的研究。开发能够在苹果细胞中稳定、高效、精准的蛋白表达系统，对揭示苹果中重要的功能基因，在蛋白质水平上揭示苹果细胞信号转导的分子机理尤为关键。原生质体细胞蛋白表达技术是在蛋白质层面上开展细胞信号转导研究的较为精准研究系统。目标蛋白在原生质体细胞中高效、稳定表达是将原生质体细胞表达技术应用于基因功能及细胞信号转导中的生化事件研究的前提。启动子是驱动目标基因在细胞中进行表达与翻译的关键因子，一个合适启动子的选择对目标基因表达与否具有关键和决定作用。而在苹果原生质体细胞中，应用常规使用的camv35s启动子，部分基因不能获得表达，部分基因表达较弱，camv35s启动子的这一特点，阻碍了将苹果原生质体细胞目标蛋白表达技术应用于苹果基因功能研究。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高效驱动目标基因在植物细胞中稳定表达的启动子及其应用。第一方面，本发明要求保护一种具有启动子功能的dna分子。所述dna分子为如下a)或b)或c)：a)seqidno.1所示的dna分子；b)与a)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有启动子功能的dna分子；c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的dna分子。上述严格条件可为在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。第二方面，本发明要求保护含有上述dna分子的重组载体、表达盒、重组菌或转基因植物细胞系。进一步的，所述重组载体可为重组表达载体或重组克隆载体。进一步的，所述表达盒由具有启动子功能的所述dna分子、由所述dna分子启动表达的目标基因，以及转录终止序列组成。扩增上述dna分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。第三方面，本发明要求保护上述dna分子在作为启动子中的应用。第四方面，本发明要求保护上述dna分子或含有上述dna分子的重组载体、表达盒、重组菌或转基因植物细胞系在启动目标基因表达中的应用。进一步的，所述启动目标基因表达为在植物细胞中启动目标基因表达。进一步的，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。更进一步的，所述双子叶植物可为苹果属植物或烟草属植物。所述细胞可为原生质体细胞或叶片表皮细胞。在本发明的一个具体实施例中，所述植物细胞为苹果原生质体细胞。在本发明的另一个具体实施例中，所述植物细胞为烟草叶片表皮细胞。上述dna分子或含有上述dna分子的重组载体、表达盒或重组菌在研究蛋白互作中的应用也属于本发明的保护范围。第五方面，本发明要求保护一种表达目标基因的方法。本发明要求保护的表达目标基因的方法包括如下步骤：以上述dna分子作为启动子来启动目标基因的表达。进一步的，所述表达目标基因为在苹果原生质体细胞中表达目标基因；所述研究蛋白互作为在苹果原生质体细胞中研究蛋白互作；所述苹果原生质体细胞是以在添加植物激素的ms培养基上生长10天的苹果愈伤组织细胞为试材分离制备得到的苹果原生质体细胞。更进一步的，所述苹果原生质体细胞可为orin苹果愈伤组织细胞或紫红2-4苹果愈伤组织细胞。当所述苹果原生质体细胞为orin苹果愈伤组织细胞时，所述植物激素为2,4-d(1.5mg/l)和6-ba(0.4mg/l)；当所述苹果原生质体细胞为紫红2-4苹果愈伤组织细胞时，所述植物激素为naa(0.6mg/l)和6-ba(0.5mg/l)。并以第10天的愈伤组织细胞制备苹果原生质体细胞最佳。第六方面，本发明要求保护一种研究蛋白互作的方法。本发明要求保护的研究蛋白互作的方法包括如下步骤：以上述dna分子作为启动子来启动目标蛋白编码基因的表达。进一步的，所述蛋白互作具体为atbak1与atfls2的蛋白互作。以上任一所述应用或方法中，所述目标基因可为如下基因中的任一种或几种或全部：mderf1、mderf2、mderf3、mderf6、mdeil2、mderf98、atbak1、atfls2、mdbak1、mdfls2、mdwrky29、mdwrky33-1。本发明从拟南芥中克隆得到一种具有启动子功能的核苷酸片段，其为多聚泛素编码基因自翻译起始位点atg中a开始(不包括a)向上的1307bp的核苷酸序列，命名为pro-biutnt。通过实验证明：pro-biutnt启动子可高效与稳定的驱动调控苹果果实成熟与免疫反应中具有代表性的12个参试目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达，突破了在苹果原生质体细胞中应用camv35s启动子部分基因不表达，部分基因表达较弱的技术局限，为将苹果原生质体细胞蛋白表达技术应用于苹果信号转导研究奠定了基础。附图说明图1为用于分离制备苹果原生质体细胞的苹果愈伤组织细胞。a：在ms培养基上生长的orin苹果愈伤组织细胞；b：在ms培养基上生长的紫红2-4苹果愈伤组织细胞；c：富士与新疆野苹果杂交后代叶片诱导出的4个初始细胞系。a、b所示苹果愈伤组织细胞用于苹果原生质体细胞分离。图2为苹果愈伤组织细胞中分离出的苹果原生质体细胞。a：从ms培养基上生长不同天数的orin苹果愈伤组织细胞中分离的苹果原生质体细胞；b：从ms培养基上生长不同天数的紫红2-4苹果愈伤组织细胞中分离的苹果原生质体细胞。图中天数为用于分离苹果原生质体细胞的苹果愈伤组织细胞在ms培养基上生长的天数。比例尺示50μm。图3为应用pro-biutnt启动子的母本表达载体构建。a：表达载体构建方案；b：pro-biutnt克隆进表达载体的图例展示。图4为应用camv35s、pro-biutnt两种类型启动子的参试目标基因的表达载体构建。a：表达载体构建过程；b：参试目标基因开放阅读框全长扩增结果；c：参试目标基因的表达载体酶切鉴定；d：虚线以上为分别应用camv35s、pro-biutnt两种启动子的目标基因的表达载体结构图，虚线以下为应用pro-biutnt启动子的目标基因的表达载体结构图，(左)为载体构建中使用的母本载体(“质粒1”、“质粒3”、“质粒4”、“质粒5”)，(中)为参试目标基因表达载体结构图，(右)为表达载体中的参试目标基因集合，ccccct(*所示)为表达载体构建中smai、stui酶切末端连接形成的序列，该序列存在于应用smai酶切克隆的mdbak1、mdfls2、mdwrky29、mdwrky33-1、atfls2的表达载体中。图5为应用苹果中核苷酸序列为启动子驱动目标基因mderf98的表达载体构建。a：表达载体构建方案；b：目标基因mderf98克隆进母本载体“质粒3”图例展示；c：6个苹果中核苷酸序列作为启动子克隆进目标基因为mderf98的表达载体图例展示；d：应用苹果中核苷酸序列为启动子的mderf98表达载体(“质粒7”-“质粒12”)及载体构建中的中间载体的结构图。图6为pro-biutnt与camv35s启动子驱动目标基因mderf1、mderf2、mderf3、mderf6、mderf98、mdeil2的表达效果对比。a：pro-biutnt启动子有效驱动mderf1、mderf3、mderf6、mderf98、mdeil2(所示)表达，高效驱动mderf2(*所示)表达；b：camv35s启动子与pro-biutnt启动子在苹果原生质体细胞中驱动目标基因mderf1、mderf2、mderf3、mderf6的表达效果对比。camv35s启动子驱动的表达载体每个选取3个克隆，1#、2#、3#为克隆编号。末端带箭头直线所指为目标蛋白信号。图7为pro-biutnt启动子有效驱动mdwrky33-1、mdwrky29表达，高效驱动mdbak1表达。图8为pro-biutnt启动子有效驱动mdfls2表达。a：camv35s与pro-biutnt启动子在原生质体细胞中驱动目标基因表达不同时间的对比；b：camv35s与pro-biutnt启动子在ms培养基中培养6天的愈伤组织细胞制备的苹果原生质细胞中驱动目标基因表达的对比。图9为pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2启动子具有驱动目标基因mderf98在苹果原生质体细胞中表达的能力，△示目标蛋白信号。图10为camv35s、pro-biutnt启动子驱动的gfp或gfp标记的目标蛋白mderf98的表达载体结构图。a：质粒13-质粒18的载体构建过程；b：camv35s、pro-biutnt启动子驱动的gfp(质粒13、质粒14)或gfp标记的目标蛋白mderf98(质粒15、质粒16)的表达载体结构图；c：camv35s、pro-biutnt启动子驱动的gfp标记的目标蛋白mderf98(质粒17、质粒18)的二元表达载体结构图。图11为pro-biutnt与camv35s启动子驱动目标基因gfp或gfp标记的蛋白mderf98在苹果原生质体细胞与烟草叶片表皮细胞中的表达对比。a：pro-biutnt与camv35s启动子驱动gfp与mderf98-gfp在苹果原生质体细胞中的表达对比，(i)为pro-biutnt与camv35s启动子驱动gfp的表达效果对比，(ii)为pro-biutnt与camv35s启动子驱动mderf98-gfp的表达效果对比，(ⅲ)为pro-biutnt与camv35s启动子驱动gfp、mderf98-gfp表达的荧光信号强度对比；b：pro-biutnt与camv35s启动子驱动mderf98-gfp在烟草叶片表皮细胞中的表达对比，(i)为pro-biutnt启动子驱动mderf98-gfp在烟草叶片表皮细胞中的表达效果，(ii)为camv35s启动子驱动mderf98-gfp在烟草叶片表皮细胞中的表达效果，(ⅲ)为pro-biutnt与camv35s启动子驱动mderf98-gfp在烟草叶片表皮细胞中表达具有与不具有荧光信号的细胞个数(左)及不同荧光信号范围内的细胞个数(右)。图12为应用pro-biutnt启动子在苹果原生质体细胞中研究两个蛋白之间的相互作用。具体实施方式下述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中所有母本表达载体名字均为唯一，各个部分名字相同即指代完全相同。下述实施例中启动子的命名以该核苷酸片段所属基因名字前加pro，中间以间隔符“-”隔开，基因名字后加后缀“-2”或“-1”、“-2”表示来自同一基因启动子区域的不同核苷酸片段。pro为启动子的英文promoter简写。下述实施例中的载体结构图仅包括本专利申请所涉及的表达载体上的结构元件，包括启动子、所驱动的目标基因及目的基因c-端标签。下述实施例中的“质粒1”和“avrpto-gfp”均记载于文献“hep,shanl,linnc,martingb,kemmerlingb,nürnbergert,sheenj.2006.specificbacterialsuppressorsofmampsignalingupstreamofmapkkkinarabidopsisinnateimmunity,cell,125:563–575.”中，“质粒1”为文献的figure2中的“avrrpm1”表达载体，avrpto-gfp为文献的figure.6a中的“avrpto-gfp”表达载体，公众均可从本专利申请人(山东农业大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的二元表达载体pcb302记载于文献“cuif,wus,sunw,coakerg,kunkelb,hep,shanl.2013.thepseudomonassyringaetypeiiieffectoravrrpt2promotespathogenvirulenceviastimulatingarabidopsisauxin/indoleaceticacidproteinturnover,plantphysiology,162:1018–1029.”中，“二元表达载体pcb302”为文献第11页materialandmethods第二部分所述的“pcb302”表达载体，公众均可从本专利申请人(山东农业大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、苹果原生质体细胞的分离方法以苹果愈伤组织细胞为试材，应用纤维素酶、果胶酶、离析酶三种酶混合水解法分离与制备苹果原生质体细胞。具体步骤如下：一、苹果愈伤组织细胞的培养和保存苹果愈伤组织细胞为2种：1为orin苹果愈伤组织细胞(图1a)；2为紫红2-4苹果愈伤组织细胞(图1b)。1、orin苹果愈伤组织细胞的来源、培养和保存1)orin苹果愈伤组织细胞的来源orin苹果愈伤组织细胞的来源见参考文献“anjp,yaojf,xurr,youcx,wangxf,haoyj.applebziptranscriptionfactormdbzip44regulatesabscisicacid-promotedanthocyaninaccumulation.plant,cell&environment,2018,doi:10.1111/pce.13393.”。2)orin苹果愈伤组织细胞的培养和保存应用添加1.5mg/l2,4-d和0.4mg/l6-ba的ms(murashige-skooge)培养基(m5519，sigma)进行orin苹果愈伤组织细胞的培养和保存，每2周继代一次，培养条件为：黑暗中避光进行培养，培养温度为24℃。2、紫红2-4苹果愈伤组织细胞的来源、培养和保存1)紫红2-4苹果愈伤组织细胞的来源紫红2-4愈伤组织细胞为从富士与新疆野苹果杂交后代f1分离群体的优株叶片中诱导而得来的苹果愈伤组织，从诱导所得的4个初始细胞系2-3、2-4、2-2与黄细胞(图1c)中选择2-4，于光下在ms培养基上经多代继代培养，得到疏松均一且组成型合成花青素的红色愈伤组织细胞(图1b)。紫红愈伤组织细胞的诱导及生物学特性见参考文献“jixh,wangyt,zhangr,wusj,anmm,lim,wangcz,chenxl,zhangym,chenxs.effectsofauxin,cytokininandnitrogenonanthocyaninbiosynthesisincallusculturesofred-fleshedapple(malussieversiif.niedzwetzkyana).plantcelltissueorgan,culture,2015,120:325–337.”。2)紫红2-4苹果愈伤组织细胞的培养和保存应用添加0.6mg/lnaa与0.5mg/l6-ba的ms培养基对紫红2-4苹果愈伤组织细胞进行继代、培养与保持，每2周继代一次。培养条件为：每天光照8小时，黑暗16小时，培养温度为24℃。二、苹果原生质体细胞的分离以在添加植物激素的ms培养基上生长不同天数的以上两种苹果愈伤组织细胞为试材分离制备苹果原生质体细胞。苹果原生质体细胞的分离方法见参考文献“gaox,wheelert,liz,kenerleycm,hep,shanl.2011.silencingghndr1andghmkk2compromisescottonresistancetoverticilliumwilt.plantj,66:293-305.”(参考文献中的物种为棉花，所用的试材为棉花的叶片和下胚轴，而本专利申请中的物种为苹果，所用的试材为苹果愈伤组织细胞)。具体步骤如下：1、所需溶液的配制酶解液：1.5％纤维素酶(yakultpharmaceutical，r-10)、0.4％离析酶(yakultpharmaceutical，r-10)、0.05％果胶酶(kyowachemical，y-23)、20mmkcl(sigma，p9333)、10mmcacl2(sigma，c1016)、2％蔗糖(天津凯通)、20mmmes(sigma，m3671，ph5.7)、0.4m甘露醇(sigma，m4125)。w5溶液：0.154mnacl(国药，10019318)、0.125mcacl2、0.005mkcl、0.002mmes(ph5.7)(sigma，m3671)。mmg溶液：0.4m甘露醇、0.015m氯化镁(国药，10012817)、0.004mmes(ph5.7)(sigma，m3671)。2、苹果原生质体细胞的分离1)在无菌超净工作台中，称取2g苹果愈伤组织细胞加入10ml酶解液中，使用无菌药匙轻轻将愈伤组织细胞均匀散开，然后放入真空干燥器中抽真空30分钟，真空度为0.06mpa，取出，置于室温避光酶解12小时。2)酶解结束，轻轻晃动处在酶解液中的苹果愈伤组织细胞以释放苹果原生质体细胞，加入等体积w5溶液，混匀，得到混合液；将混合液经100μm孔径的尼龙布过滤至50ml圆底离心管中，用w5溶液顺次冲洗尼龙布3次，每次5-10ml，均收集于上述的50ml圆底离心管中。将悬浮在酶解液与w5溶液中的苹果原生质体细胞在beckman离心机(j2-mc)上900rpm离心2分钟，弃上清；收集苹果原生质体细胞并重悬于15mlw5溶液中，然后置于冰上30分钟，弃上清，向管底缓缓注入2mlmmg溶液，将在管底层积的苹果原生质体细胞重新悬浮，吸取10μl苹果原生质体细胞悬浮液滴入血球计数板凹槽中，上置盖玻片，在olympus，bx53光学显微镜下观察、计数、拍照。图2a所示为分别以在添加植物激素的ms培养基上生长6天、8天、10天、12天、14天的orin苹果愈伤组织细胞为试材分离的苹果原生质体细胞。图2b所示为分别以在添加植物激素的ms培养基上生长5天、10天、15天、20天、25天的紫红2-4苹果愈伤组织细胞为试材分离的苹果原生质体细胞，其中，以在添加植物激素的ms培养基上生长20天、25天的紫红苹果愈伤组织细胞为试材分离得到的苹果原生质体细胞，在显微镜下镜检观察，未见均匀散布的原生质体细胞，所分离的原生质体细胞成团聚集，并有碎片状物质(图2b，20天、25天)，故原生质体细胞个数未做统计。通过对所分离的苹果原生质体细胞的个数进行统计与计算，发现苹果原生质体细胞的最优分离条件为：以在添加植物激素的ms培养基上生长10天的苹果愈伤组织细胞为试材分离制备苹果原生质体细胞，能够得到最大的苹果原生质体细胞量(表1)。表1、从在添加植物激素的ms培养基上生长不同天数的orin、紫红2-4两种苹果愈伤组织细胞中分离出的苹果原生质体细胞数目统计实施例2、pro-biutnt启动子的扩增及以其作为启动子的目标基因表达载体的构建一、pro-biutnt启动子的克隆提取拟南芥的基因组dna，以拟南芥基因组dna为模板，应用表2所示pro-biutnt启动子的扩增引物从拟南芥基因组dna中pcr扩增多聚泛素编码基因(at4g05320.2)自翻译起始位点atg中a开始(不包括a)向上的1307bp的核苷酸序列，该核苷酸片段在本专利申请中命名为pro-biutnt。表2、7个启动子的名称、所属基因、来源物种、扩增引物及启动子片段长度扩增体系为：总体积100μl，包括dna模板4μl，dntp8μl，正向(f)、反向(r)引物各5μl，5×hfbuffer20μl，ddh2o57μl，phusion高保真酶(thermoscientific，#f-530l)1μl。扩增程序为：①98℃3min；②98℃30s；③58℃30s；④72℃1min30s；⑤goto②③④for35个循环；⑥72℃10min；⑦4℃保存。拟南芥基因组dna提取结果如图3b(i)中的泳道1箭头所示，启动子扩增结果如图3b(i)中的泳道2箭头所示。二、应用camv35s、pro-biutnt两种类型启动子的母本表达载体构建应用camv35s、pro-biutnt两种类型启动子的母本表达载体的构建方案如图3a所示。1、质粒1“质粒1”为本专利申请中所有表达载体的初始表达载体，为应用camv35s启动子驱动目标基因avrrpm1的表达载体，c末端标签为ha(ha：hemagglutinin)。“质粒1”字体左侧为表达载体结构图(图3a)。2、质粒2以“质粒1”为模板，应用thermoscientific(geneart，a13282)试剂盒及表3所列引物，将“质粒1”结构图1、2、3所示三处酶切位点分别由xhoi突变为psti，且bamhi突变为smai，且psti突变为bamhi(图3a，步骤1)，得到酶切位点发生突变后的表达载体，命名为“质粒2”(图3a，步骤1)。表3、表达载体中酶切位点的突变引物3、质粒3以“质粒2”为模板，应用psti/smai酶切克隆，将“质粒2”中的camv35s启动子替换为步骤一中扩增得到的pro-biutnt启动子片段，得到应用pro-biutnt启动子驱动目标基因avrrpm1的表达载体，命名为“质粒3”(图3a，步骤2)。具体制备方法如下：1)应用限制性内切酶psti/smai酶切“质粒2”，酶切体系为15μl，先加入1.5μl10×nebcutsmart缓冲液、7μl100ng/μl“质粒2”、0.5μlpsti(neb，#r3104)和5.5μl无菌水，然后在37℃金属浴中酶切2小时，再加入0.5μlsmai(neb，#r0141s)，最后在25℃金属浴中酶切2小时。2)酶切结束，将酶切产物在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳结果如图3b(ii)所示。下箭头所示为从“质粒2”中释放出的大小为564bp的camv35s启动子；上箭头所示为释放出camv35s启动子后表达载体的其余部分。将上箭头所示的表达载体片段进行切胶，应用康为世纪快速琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(cw2302m)从胶块中回收除去启动子后表达载体其余部分，与同样经psti/smai双酶切、凝胶电泳、切胶回收的pro-biutnt扩增片段在t4dna连接酶(neb，m0202)作用下于16℃连接过夜，转化大肠杆菌。3)挑取大肠杆菌单克隆培养，提取质粒鉴定pro-biutnt启动子克隆进表达载体的目标克隆。鉴定方法如下：应用限制性内切酶psti/smai酶切目标克隆，酶切结束，将酶切产物在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳结果如图3b(iii)所示。图中上箭头所示为去除启动子后的表达载体其余部分，下箭头所示为应用psti/smai酶切，从鉴定到的表达载体中释放出一条介于1000bp-2000bp之间的片段。对克隆进该表达载体中的片段进行测序，显示pro-biutnt片段已克隆进表达载体，所获的表达载体命名为“质粒3”。pro-biutnt启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。4、质粒4以“质粒3”为模板，应用thermoscientific(geneart，a13282)试剂盒及表3所列引物，将“质粒3”中2、3两处酶切位点分别由smai突变为bamhi，且bamhi突变为smai，得到能够使用另外酶切克隆位点将目标基因克隆进表达载体的应用pro-biutnt启动子的表达载体，命名为“质粒4”(图3a，步骤3)。5、质粒5以“质粒3”为模板，将“质粒3”中目标基因avrrpm1的c末端标签由ha突变为flag，且将目标基因avrrpm1替换为atfls2，得到标签为flag的应用pro-biutnt启动子的表达载体，命名为“质粒5”。具体制备方法如下：1)以“质粒3”为模板，应用thermoscientific(geneart，a13282)试剂盒及表3所列引物，将“质粒3”中目标基因avrrpm1的c末端标签由ha突变为flag，得到c末端标签为flag的表达载体，其中在正向引物序列中，flag标签序列用斜体表示(表3)。2)以拟南芥cdna为模板，采用表5中所列atfls2扩增引物，应用pcr扩增的方法从拟南芥cdna中扩增得到atfls2开放阅读框全长序列，pcr扩增反应体系及扩增程序同实施例2(一)，其中扩增程序中的72℃延伸时间④根据1-2kb/min计算，atfls2扩增产物见图4b(ii)所示，长度为3519bp。3)应用smai单酶切克隆，将2)中获得的atfls2开放阅读框全长序列(geneid：nm_001344672.1)克隆进c末端标签为flag的表达载体中，命名为“质粒5”(图4a，ii)。具体步骤如下：atfls2的扩增产物经酒精沉淀，无菌水溶解后，应用smai单酶切2小时，同时应用smai/stui酶切c末端标签为flag的表达载体，释放出目标基因avrrpm1，将载体其余部分应用康为世纪快速琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(cw2302m)从胶块中进行回收，与经smai酶切的atfls2片段在t4连接酶的作用下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌。4)应用bamhi/stui酶切鉴定出atfls2开放阅读框全长序列克隆进表达载体的目标克隆。图4c(i)中*标示出了atfls2的酶切鉴定结果，证明atfls2已克隆进表达载体。“质粒3”、“质粒4”和“质粒5”即为本专利申请中应用pro-biutnt启动子的母本表达载体；“质粒1”为应用camv35s启动子的母本表达载体。三、应用camv35s、pro-biutnt两种类型启动子的参试目标基因的表达载体构建应用camv35s、pro-biutnt两种类型启动子的参试目标基因的表达载体构建方案如图4a所示；所构建的13个参试目标基因的表达载体结构图如图4d所示。图4a(i)所示目标载体及目标基因对应于图4d虚线以上的目标载体及目标基因，图4a(ii)所示目标载体及目标基因对应于图4d虚线以下的目标载体及目标基因。表达载体间的粗线箭头示表达载体构建过程。目标载体结构图下方为目标基因。方框内所示为分别构建到应用camv35s启动子与pro-biutnt启动子的表达载体中的基因；粗线方框示构建到应用pro-biutnt启动子的表达载体；细线方框示构建到应用camv35s启动子的表达载体；字体颜色相同的基因为表达载体构建中使用的酶切位点相同的基因。1、13个参试目标基因开放阅读框全长序列的扩增以cdna为模板，采用表4所示的引物分别扩增13个参试目标基因开放阅读框全长序列。atfls2与atbak1应用拟南芥cdna为模板，其余基因应用苹果cdna为模板进行扩增。表4、13个参试目标基因名称、基因代码及扩增引物序列13个参试目标基因开放阅读框全长序列的扩增结果如图4b所示。(i)所示为6个转录因子基因，包括5个erf家族转录因子(mderf1、mderf2、mderf3、mderf6、mderf98)及乙烯信号转导途径中重要的调控基因转录因子mdeil2的扩增结果。(ii)所示为4个免疫受体基因(atbak1、atfls2、mdbak1、mdfls2)及3个免疫信号途径中的mdmapk6、mdwrky29、mdwrky33-1基因的扩增结果；右一为5’、3’两端均为smai酶切克隆位点的mdwrky33-1扩增片段，用以克隆进表达载体“质粒3”，获应用pro-biutnt启动子驱动的表达载体；右二为5’、3’两端分别为bamhi、smai酶切位点的mdwrky33-1扩增片段，用以克隆进表达载体“质粒1”，获应用camv35s启动子驱动的表达载体。2、参试目标基因的表达载体的构建将步骤1中扩增得到的13个参试目标基因开放阅读框全长序列分别克隆进表达载体中。每个参试基因克隆进的表达载体的启动子类型(camv35s启动子、pro-biutnt启动子)、母本载体(质粒1、质粒3、质粒4或质粒5)及使用的酶切克隆位点如表5所示。表5、每个参试基因克隆进的表达载体的启动子类型、母本载体及所用酶切克隆位点注：基因1为mderf1基因；基因2为mderf2基因；基因3为mderf3基因；基因4为mdeil2基因；基因5为mderf6；基因6为mderf98基因；基因7为mdbak1基因；基因8为mdfls2基因；基因9为mdwrky29基因；基因10为mdwrky33-1基因；基因11为atfls2；基因12为atbak1基因；基因13为mdmapk6基因。填充方格示参试基因(正对其上方第一排)克隆进表达载体的启动子类型、母本载体(正对其左第一列)及使用的酶切克隆位点(正对其左第二列)；黑色填充示分别构建到应用camv35s启动子与pro-biutnt启动子的表达载体中的基因(基因1-基因10)；紫色填充示构建到应用pro-biutnt启动子的表达载体中的基因(基因11和基因12)；橙色填充示构建到应用camv35s启动子的表达载体中的基因(基因13)；填充方格中数字示表达载体选取的克隆数。因mderf98的开放阅读框序列中含有bamhi酶切位点ggatcc，为了方便后续构建表达载体，应用thermoscientific(geneart，a13282)试剂盒及突变引物f：5’-tatttccgggcgtagatcctggaaggag-3’；r：5’aagatgaggaagaagcagaagatgaagac-3’在表达载体中将该基因bamhi酶切位点同义突变为agatcc。本专利申请中mderf98的表达载体中mderf98的核苷酸序列均为同义突变后的核苷酸序列。3、参试目标基因的表达载体的酶切鉴定参试目标基因的表达载体酶切鉴定所使用酶均为bamhi/stui，鉴定结果如图4c所示。(i)所示为6个目标基因的分别应用camv35s启动子、pro-biutnt启动子为驱动的表达载体的酶切鉴定(“▽”示)及camv35s启动子驱动的mdmapk6的表达载体与pro-biutnt启动子驱动的atbak1、atfls2表达载体酶切鉴定(“*”示)；基因名字如图所示。数字“1”示应用camv35s启动子的表达载体；数字“2”示应用pro-biutnt启动子的表达载体；数字“3”示应用pro-biutnt启动子c末端为flag标签的atfls2的表达载体。(ii)所示为mderf1、mderf2、mderf3、mderf6的应用camv35s启动子与应用pro-biutnt启动子的表达载体酶切鉴定。mderf1、mderf2、mderf3、mderf6的应用camv35s启动子为驱动的表达载体每个选取3个克隆；应用pro-biutnt启动子的表达载体每个选取1个克隆。1#、2#、3#为表达载体不同克隆编号。参试基因名字及启动子名字见图中所示。图4c(i)、(ii)酶切鉴定结果显示，所有参试基因均克隆进表达载体。其中，pro-biutnt启动子驱动的目标基因mderf1表达载体的核苷酸序列如序列表中的序列8所示。实施例3、苹果中pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2启动子的扩增及以其作为启动子的表达载体的构建一、苹果中6个核苷酸片段的扩增以苹果基因组dna为模板，分别采用表2中的pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2、pro-mdrp-1、pro-mdrp-2、pro-mdrc-1、pro-mdrc-2片段对应的引物进行扩增，分别得到pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2、pro-mdrp-1、pro-mdrp-2、pro-mdrc-1、pro-mdrc-2核苷酸片段。6个核苷酸片段分别来自于如下3个基因：mdbiutnt(pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2)、mdrp(pro-mdrp-1、pro-mdrp-2)、mdrc(pro-mdrc-1、pro-mdrc-2)。mdbiutnt为拟南芥多聚泛素基因在苹果中的同源基因；mdrp为1，5-核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因；mdrc为苹果1，5-核酮糖二磷酸羧化酶活化酶基因；上述基因在苹果基因组中的编号见表2。其中，pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2为自mdbiutnt基因翻译起始位点atg中的a开始(不包括a)向上分别为1539bp、2501bp的两个核苷酸片段。pro-mdbiutnt启动子核苷酸序列如序列表中序列2所示、pro-mdbiutnt-2启动子核苷酸序列如序列表中序列3所示。pro-mdrp-1、pro-mdrp-2为自mdrp基因翻译起始位点atg中的a开始(不包括a)向上分别为1972bp、3050bp的两个核苷酸片段。pro-mdrp-1启动子核苷酸序列如序列表中序列4所示、pro-mdrp-2启动子核苷酸序列如序列表中序列5所示。pro-mdrc-1、pro-mdrc-2为自mdrc基因翻译起始位点atg中的a开始(不包括a)向上分别为2025bp、2542bp的两个核苷酸片段。pro-mdrp-1启动子核苷酸序列如序列表中序列6所示、pro-mdrp-2启动子核苷酸序列如序列表中序列7所示。pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2、pro-mdrp-1、pro-mdrp-2扩增产物如图5c(i)所示；pro-mdrc-1、pro-mdrc-2扩增产物如图5c(i)中箭头所指。二、应用苹果中核苷酸序列为启动子驱动目标基因mderf98的表达载体构建以步骤一中扩增得到的苹果中核苷酸序列为启动子驱动目标基因mderf98的表达载体构建方案如图5a所示。具体步骤如下：1、质粒6将“质粒3”中的目标基因avrrpm1替换为目标基因mderf98，得到质粒6。具体制备方法如下：1)以实施例2(三)构建的pro-biutnt：：mderf98表达载体(表达载体结构图见图4d)为模板，采用表4中带*号的mderf98的扩增引物进行扩增，得到目标基因mderf98。图5b(i)为mderf98扩增结果。2)应用smai/stui酶切克隆，将目标基因mderf98克隆进母本载体“质粒3”，获得表达载体，命名为“质粒6”(图5a，步骤1)。图5b(ii)为使用限制性内切酶smai/stui对mderf98表达载体的酶切鉴定结果。酶切结果显示，mderf98已克隆进表达载体。2、质粒7”-“质粒12”以“质粒6”为模板，应用psti/smai酶切克隆，分别将步骤一获得的来自苹果中的核苷酸片段克隆进表达载体中作为启动子，分别获得mderf98表达载体pro-mdbiutnt：：mderf98(质粒7)、pro-mdbiutnt-2：：mderf98(质粒8)、pro-mdrp-1：：mderf98(质粒9)、pro-mdrp-2：：mderf98(质粒10)、pro-mdrc-1：：mderf98(质粒11)、pro-mdrc-2：：mderf98(质粒12)(图5a，步骤2)。图5c(ii)为使用限制性内切酶psti/smai对各个mderf98表达载体的酶切鉴定结果。每个泳道中的表达载体及所使用的限制性内切酶如图右侧标注所示。酶切结果显示，以上6个核苷酸片段均已克隆进表达载体，得到应用以上6个苹果中核苷酸序列为启动子驱动目标基因mderf98的表达载体。并对克隆进以上表达载体中的6个核苷酸序列分别进行测序验证。“质粒6”为载体构建中的中间载体，“质粒7”-“质粒12”为应用苹果中核苷酸序列为启动子的表达载体。各个表达载体结构图如图5d所示。实施例4、苹果原生质体细胞转染、目标蛋白表达及检测一、苹果原生质体细胞转染、目标蛋白表达及检测1、表达载体的纯化应用氯化铯梯度离心法制备与纯化本专利申请中实施例2和实施例3所构建的参试目标基因的表达载体，包括实施例2所构建的13个目标基因的31个表达载体(表5)及实施例3构建的7个表达载体“质粒6”-“质粒12”。氯化铯梯度离心法制备与纯化表达载体的方法详见《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，萨姆布鲁克等著，黄培堂译)第53-56页。2、苹果原生质体细胞转染为了对比不同类型启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中表达和翻译的效果，应用peg介导的瞬时转染法将步骤一纯化的目标载体转染实施例1中从ms培养基中培养6天的orin苹果愈伤组织细胞制备的苹果原生质体细胞，转染后的细胞在培养不同时间后进行目标蛋白表达与积累的检测。其中，转染目标基因atfls2的表达载体的苹果原生质体细胞在培养2h、4h、6h、8h和10h后进行目标蛋白表达与积累的检测(图8a)；转染其余目标基因的表达载体的苹果原生质体细胞在培养6h(图6、图7、图8b)或8h(图9)后进行目标蛋白表达与积累的检测。原生质体细胞转染的具体步骤参考文献“hep,shanl,sheenj.2006.theuseofprotoplaststostudyinnateimmuneresponses.plant-pathogeninteractionsvolume354:pps.1-10”中的方法。3、目标蛋白表达及检测表达结束后收集苹果原生质体细胞，应用sds上样缓冲液(100mmol/ltris-cl，4％sds，20％甘油，0.2％溴酚蓝，200mmol/l二硫苏糖醇)进行蛋白质变性，应用western杂交检测目标基因在苹果原生质体细胞中的翻译水平。二、pro-biutnt、pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2启动子与camv35s启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达的效果对比1、pro-biutnt与camv35s启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达的效果对比pro-biutnt启动子可稳定驱动12个参试目标基因(mderf1、mderf2、mderf3、mderf6、mdeil2、mderf98、atbak1、atfls2、mdbak1、mdfls2、mdwrky29、mdwrky33-1)在苹果原生质体细胞中高效表达。结果详述如下：(1)应用camv35s启动子不能驱动mderf1、mderf3、mderf6在苹果原生质体细胞中表达，而应用pro-biutnt启动子，获得了清晰特异的目标蛋白表达信号。其中mderf2应用camv35s启动子表达较弱，但应用pro-biutnt启动子获得了清晰特异的目标蛋白表达信号(图6a)。即便在应用camv35s启动子的表达载体每个所挑选的3个克隆中，也未发现能够驱动mderf1、mderf3、mderf6有效表达的载体克隆及具有与应用pro-biutnt启动子相同信号强度的mderf2的载体克隆(图6b)。(2)mderf98为另一erfs(ethyleneresponsefactors)家族的转录因子，应用camv35s启动子，该基因未获表达(图6a、图7)或表达较弱(图9)，而应用pro-biutnt启动子，获得了清晰、特异的目标蛋白表达信号(图6a、图7、图9)。mdeil2是比以上5个erf转录因子家族基因具有更长的氨基酸编码区的一段核苷酸序列，应用camv35s为启动子，未获表达，而应用pro-biutnt启动子，在目标蛋白所处位置获得清晰、特异的目标蛋白表达信号(图6a，示)。(3)mdwrky33-1与mdwrky29为wrky家族重要转录因子。mdwrky33-1的表达不能被camv35s启动子驱动，在mdwrky29条带所处位置有一极弱表达信号(图7中camv35s::mdwrky29中“△”所指)，而应用pro-biutnt启动子，mdwrky33-1、mdwrky29获得了清晰、特异的目标蛋白表达信号(图7)。(4)mdfls2、mdbak1为苹果中重要的免疫基因。应用camv35s启动子，mdfls2未获表达，而应用pro-biutnt启动子，在苹果原生质体细胞中表达2小时，就发现了目标蛋白mdfls2的信号积累(图8a)；并且，应用pro-biutnt启动子，在以ms培养基上生长6天的苹果愈伤组织细胞所制备的苹果原生质体细胞中获得了清晰、特异的mdfls2目标蛋白表达信号，应用camv35s启动子，未获蛋白表达信号(图8b)。虽然camv35s启动子能够驱动mdbak1在苹果原生质体细胞中获得表达，但目标蛋白的信号强度显著低于应用pro-biutnt启动子时mdbak1的表达信号(图7中示mdbak1的表达)，并且应用pro-biutnt启动子，能够清晰地看到mdbak1蛋白翻译后被剪切的片段，而应用camv35s启动子，则不能看到3条被剪切所修饰的特异条带(图7，*示mdbak1在细胞内被剪切的片段)。本专利申请中所挑选的参试目标基因均为调控苹果果实成熟与免疫反应中具有代表性的基因，包括erf家族转录因子5个，乙烯信号转导中重要转录调控因子基因1个，免疫受体相关基因4个，mapk信号途径中的重要基因3个。除mdmapk6未参与启动子强度对比试验以外，pro-biutnt启动子驱动了全部12个参试目标基因的表达，而应用camv35s启动子，部分基因不表达(mderf1、mderf3、mderf6、mdeil2、mdwrky33-1、mdfls2)，部分基因弱表达(mderf2、mdwrky29、mderf98)(表6、表7)。表6、两种启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中的表达、翻译效果比较mderf1mderf3mderf6mdeil2mdwrky33-1mdfls2mderf2camv35s不表达不表达不表达不表达不表达不表达弱表达pro-biutnt表达、强表达强表达强表达表达强表达表达强表达、表达结果来源图6a、6b、7图6a、6b图6a、6b图6a图7图8图6a、6b、7注：“/”示未进行相应表达载体构建及开展对比试验。表7、两种启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中的表达、翻译效果比较注：“/”示未进行相应表达载体构建及开展对比试验。2、pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2启动子与camv35s启动子驱动目标基因在苹果原生质体细胞中进行表达的效果对比pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2启动子具有驱动目标基因mderf98在苹果原生质体细胞中表达的能力(图9，△示目标蛋白mderf98表达信号)。暗处培养8小时和光下培养8小时分别是指经peg4000介导的瞬时转化后，分别在25℃、光照环境下(图9、右)和25℃、黑暗环境下(图9、左)培养原生质体细胞进行目标蛋白表达8小时。综合上述结果表明：来自拟南芥多聚泛素编码基因的pro-biutnt启动子及来自苹果多聚泛素编码基因启动子区域的两个核苷酸序列pro-mdbiutnt、pro-mdbiutnt-2均是在苹果原生质体细胞中高效与稳定驱动目标基因进行表达的启动子，均具有驱动目标基因在苹果原生质体细胞中表达的能力。实施例5、pro-biutnt与camv35s启动子驱动的gfp或gfp标记的目标基因在苹果原生质体细胞与烟草叶片表皮细胞中的表达效果对比一、pro-biutnt与camv35s启动子驱动gfp或gfp标记的目标基因表达载体的构建为了进一步比较pro-biutnt与camv35s启动子的驱动能力，分别构建了用于苹果原生质体细胞和烟草叶片表皮细胞转染的camv35s与pro-biutnt启动子驱动gfp、gfp标记的mderf98的表达载体，载体结构图见图10。具体制备方法如下：1、质粒15应用stui/psti酶切，将gfp片段从avrpto-gfp表达载体中释放回收，应用stui/psti酶切克隆将该gfp片段克隆进实施例2(三)构建的camv35s：：mderf98表达载体(该表达载体结构图见图4d)，得到camv35s启动子驱动mderf98-gfp表达载体，命名为“质粒15”(图10a，i-步骤1)。2、质粒13应用thermoscientific(geneart，a13282)试剂盒及引物f：5’-gtgagcaagggcgaggagctg-3’与r：5’-catggatccacggagcaaggg-3’，将“质粒15”中的mderf98基因删除，得到应用camv35s启动子驱动gfp的表达载体，命名为“质粒13”(图10a，i-步骤2)。3、质粒161)应用引物f：5’-gaaggcctgtgagcaagggc-3’与r：5’-cgggatccccgggcggccgctttact-3’从avrpto-gfp表达载体中扩增得到5’、3’两端分别为stui、bamhi酶切位点的gfp片段。2)应用stui/bamhi酶切克隆，将gfp片段克隆进“质粒6”(该表达载体结构图见图5d)，得到应用pro-biutnt启动子驱动mderf98-gfp的表达载体，命名为“质粒16”(图10a，ii-步骤1)。4、质粒14应用thermoscientific(geneart，a13282)试剂盒及引物f：5’-gtgagcaagggcgaggagctg-3’与r：5’-catggatccctgttaatcagaaaaactcag-3’，将“质粒16”中mderf98基因删除，得到pro-biutnt启动子驱动gfp的表达载体，命名为“质粒14”(图10a，ii-步骤2)。r引物中下划线表示添加的bamhi酶切位点，斜体表示atg翻译起始位点。5、质粒171)应用引物f：5’-cgggatccatggaggggaagagaggac-3’与r：5’-gaaggcctctgtgttggttgcccctgcctat-3’从实施例2(三)构建的pro-biutnt：：mderf98表达载体(该表达载体结构图见图4d)中扩增得到5’、3’两端分别为bamhi、stui酶切位点的mderf98开放阅读框全长序列。2)应用bamhi、stui酶切克隆，将mderf98克隆进二元表达载体pcb302(pcb302：camv35s：：axr2-2flag，图10a，iii)，得到pcb302：camv35s：：mderf98-flag(图10a，iii-步骤1)。3)应用stui/psti酶切克隆，将gfp片段从avrpto-gfp表达载体中克隆进pcb302：camv35s：：mderf98-flag表达载体中，将其中flag标签替换为gfp，得到应用camv35s启动子驱动mderf98-gfp的表达载体，命名为“质粒17”(图10a，iii-步骤2)。6、质粒181)应用引物f：5’-ggatccaagcttactccaagaaatatcaaag-3’与r：5’-agcttgtcactggccgtcgtt-3’将二元表达载体pcb302中camv35s启动子前端的酶切位点由xhoi突变为bamhi，得到表达载体“质粒a”(图10a，iv-步骤1)。2)应用引物f：5’-cgggatccgatcaggatattcttgtttaagatg-3’与r：5’-aactgcagctgtgttggttgcccctgcctat-3’从“质粒16”中扩增得到5’、3’两端分别为bamhi、psti酶切位点的pro-biutnt与mderf98连接在一起的pro-biutnt-mderf98整体片段，应用bamhi/psti酶切克隆，将该片段克隆进“质粒a”，得到“质粒b”(图10a，iv-步骤2)。3)应用引物f：5’-aactgcaggtgagcaagggcgaggagc-3’与r：5’-aactgcagccgggcggccgctt-3’从avrpto-gfp表达载体中扩增得到5’、3’两端均为psti酶切位点的gfp片段；应用psti单酶切克隆，将gfp片段克隆进“质粒b”，得到应用pro-biutnt启动子驱动mderf98-gfp的表达载体，命名为“质粒18”(图10a，iv-步骤3)。二、目标蛋白表达及检测1、苹果原生质体细胞中目标蛋白的表达及检测按照实施例4中的方法，分别将步骤一中构建的质粒13-16转染苹果原生质体细胞，经过6小时蛋白表达后吸取原生质体细胞，置于olympus，bx53荧光显微镜下观察目标蛋白的荧光信号，所使用的激发波波长为488nm，滤光片吸收波波长为550-590nm。在观察mderf98-gfp荧光信号时，同时应用1μg/mldapi(c1002，碧云天)染色剂对原生质体细胞的细胞核进行染色，在uv紫外滤光片下观察并比较细胞核dapi染色的荧光信号强度。结果如图11a所示，图11a(i)为gfp的表达效果对比；图11a(ii)为gfp标记的mderf98表达效果对比。结果显示：在苹果原生质体细胞中，应用pro-biutnt启动子的gfp和gfp标记的mderf98的表达信号显著强于应用camv35s启动子时的表达信号，应用pro-biutnt启动子时，gfp的荧光信号强度是应用camv35s启动子时的18倍，细胞核中mderf98-gfp的荧光信号强度是应用camv35s启动子时的11.4倍(图11a，iii)。而两个细胞核dapi染色的荧光信号强度相似，表明pro-biutnt启动子是比camv35s具有更强驱动能力的启动子。2、烟草叶片表皮细胞中目标蛋白的表达及检测分别将步骤一中构建的质粒17和质粒18转染烟草叶片表皮细胞。具体步骤如下：将“质粒17”、“质粒18”分别转化农杆菌感受态lba4404，挑取单克隆，应用含有抗生素的lb液体培养基(卡那霉素50mg/l，利福平50mg/l)培养24小时，吸取200μl菌液加入到10ml含有200μm乙酰丁香酮(as)和10mmmes的lb液体培养基中继续培养12小时。培养结束，5000rpm离心10min，收集菌体，应用悬浮液(10mmmgcl2，10mmmes，200μmas)重悬菌体，并将od600值调整为0.6，室温静置3小时。应用无菌注射器将菌液注射生长25天的本生烟烟草叶片下表皮细胞，对注射的叶片用记号笔标记，然后将植株转移至28℃条件下进行培养。培养2-3天后用镊子轻轻撕取烟草叶片下表皮，平铺于载玻片上，轻轻盖上盖玻片，于olympus，bx53荧光显微镜下进行镜检观察目标蛋白的荧光信号。使用激发光波长为488nm，滤光片吸收波波长550-590nm。结果如图11b所示，图11b(i)为应用pro-biutnt启动子驱动mderf98-gfp在烟草叶片表皮细胞中的表达效果，图11b(ii)为应用camv35s启动子驱动mderf98-gfp在烟草叶片表皮细胞中的表达效果。结果显示：在烟草叶片表皮细胞中，应用pro-biutnt启动子时细胞核中具有荧光信号的细胞个数显著多于应用camv35s启动子时细胞核中具有荧光信号的细胞个数，且应用pro-biutnt启动子时细胞核中具有的荧光信号强度显著强于应用camv35s启动子时细胞核中具有的荧光信号强度。在应用pro-biutnt启动子所观察的视野中，总共有170个细胞，其中35个具有荧光信号；而在应用camv35s启动子所观察的视野中，总共有167个细胞，其中1个具有荧光信号(图11b，iii-左)，且具有的荧光信号强度弱于应用pro-biutnt启动子时大部分细胞的荧光信号强度(图11b，iii-右)。以上结果说明：pro-biutnt启动子是比camv35s启动子具有更强驱动能力的启动子。实施例6、应用pro-biutnt启动子在苹果原生质体细胞中研究两个蛋白之间的相互作用植物细胞膜上的两个蛋白atbak1(nm_119497.5)与atfls2(nm_001344672.1)在细菌鞭毛蛋白22个保守氨基酸构成的flg22短肽的刺激下能够发生相互作用(见参考文献：chinchillad,zipfelc,robatzeks,kemmerlingb,nürnbergert,jonesjdg,felixg,bollert.aflagellin-inducedcomplexofthereceptorfls2andbak1initiatesplantdefence.nature,2007,448:497-500.)，这一反应是植物免疫信号转导中的重要事件。将实施例2构建的pro-biutnt驱动的atbak1与atfls2表达载体(载体结构图见图4d虚线以下和图4a(ii))共同转染苹果原生质体细胞并在其中表达，然后应用flg22处理苹果原生质体细胞，应用免疫共沉淀的方法研究atbak1与atfls2之间的相互作用。免疫共沉淀的具体步骤见参考文献“lud,wus,gaox,zhangy,shanl,hep.areceptor-likecytoplasmickinase,bik1,associateswithaflagellinreceptorcomplextoinitiateplantinnateimmunity.procnatlacadsciusa,2010,107:496–501.”中的方法。结果如图12所示。结果显示：flg22刺激诱导了atbak1与atfls2之间的相互作用。说明应用pro-biutnt启动子能够在苹果原生质体细胞中进行蛋白质相互作用的研究。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>山东农业大学<120>一种高效驱动目标基因在苹果原生质体细胞中稳定表达的启动子pro-biutnt<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>1307<212>dna<213>artificialsequence<400>1gatcaggatattcttgtttaagatgttgaactctatggaggtttgtatgaactgatgatc60taggaccggataagttcccttcttcatagcgaacttattcaaagaatgttttgtgtatca120ttcttgttacattgttattaatgaaaaaatattattggtcattggactgaacacgagtgt180taaatatggaccaggccccaaataagatccattgatatatgaattaaataacaagaataa240atcgagtcaccaaaccacttgccttttttaacgagacttgttcaccaacttgatacaaaa300gtcattatcctatgcaaatcaataatcatacaaaaatatccaataacactaaaaaattaa360aagaaatggataatttcacaatatgttatacgataaagaagttacttttccaagaaattc420actgattttataagcccacttgcattagataaatggcaaaaaaaaacaaaaaggaaaaga480aataaagcacgaagaattctagaaaatacgaaatacgcttcaatgcagtgggacccacgg540ttcaattattgccaattttcagctccaccgtatatttaaaaaataaaacgataatgctaa600aaaaatataaatcgtaacgatcgttaaatctcaacggctggatcttatgacgaccgttag660aaattgtggttgtcgacgagtcagtaataaacggcgtcaaagtggttgcagccggcacac720acgagtcgtgtttatcaactcaaagcacaaatacttttcctcaacctaaaaataaggcaa780ttagccaaaaacaactttgcgtgtaaacaacgctcaatacacgtgtcattttattattag840ctattgcttcaccgccttagctttctcgtgacctagtcgtcctcgtcttttcttcttctt900cttctataaaacaatacccaaagagctcttcttcttcacaattcagatttcaatttctca960aaatcttaaaaactttctctcaattctctctaccgtgatcaaggtaaatttctgtgttcc1020ttattctctcaaaatcttcgattttgttttcgttcgatcccaatttcgtatatgttcttt1080ggtttagattctgttaatcttagatcgaagacgattttctgggtttgatcgttagatatc1140atcttaattctcgattagggtttcataaatatcatccgatttgttcaaataatttgagtt1200ttgtcgaataattactcttcgatttgtgatttctatctagatctggtgttagtttctagt1260ttgtgcgatcgaatttgtcgattaatctgagtttttctgattaacag1307<210>2<211>1539<212>dna<213>artificialsequence<400>2ccttgaaaacaaattattttttcggtttttaattttttggggaggggaggcagattctct60gcccttctacttttcgtgccctttcatgctcttttgtttgtgtgataatcgttaaatcac120gttaacattttatattactaatcttttttatcttattatctttataaaaaaattataaaa180tattaatgtgatttaaccgtaactacacaaaataagagggtacggaaggtaggagggcag240acaatctacctcctcacgcgcacccttttgaccattcaaaaggcccctgcacatttctgt300tcattgatttctcttttttgggttttttcaacgaatgatattatttccttaagaggataa360atagtgttagcctcacaattgactagtaataatgttgttcaaatttctccttggcgaaaa420tcgaacttaagatttctttcttgccaataaagagaaataccactaaatcatagtagtagc480tcacctccttctacttgtatacaactttttaaattacttttcaagttagtttcaagtact540tatttggtattactatttataaaaactaaagtcaaaattaacatatgaatttgggaatga600ggatggcacgcccgaacttgatactcttagttgccatccctactctctcctctttctccc660tcactctccttgatattcttctcccgtctcttctccgatattctttcgccattttctctc720tcttctctttgaatttccaagttcggataatgttacccattacactgtaggatgagatgt780ttttacttttctaattgttgtattttgaaaacaattttaaatcacatacataaacaagtt840ttttattcttttaagaagtattcctcaaaaatgttttgaggaaagatgtacctttttata900taagataccaaacagcttcttatttttgtcatataatttcacattaagatgtactattca960cacatctttttatttctcacatattccttgttaatttttatccgtcgatcttcttcaatt1020tatcaaacccgatacatgaaaattaaaaaggtgtgtgaaaggcaaaaaagtgtgtgaata1080tcagatctctttagtaatccattagcaggtcatatacgatattgacgcgtgtaatccaca1140taacctgtcaacgtagcattctgcaagtccaaacaaattaggaatccaattaccttcaca1200agcaaggaaaggggcaacaaaaatccaagatagagcaggtcaccttctccctcatcaaat1260aaagaaaactaaaaatcagaggtcaacaattgttggcacttgcccacctagaaacatctg1320ggccgttcgtttcactgacttttctggtccacgcgttcctcgtccactccggaatccaac1380ctaaaaatgggatttgagtcggctcatcctcccctatataaactcctcacccccctccac1440tcttcctcacaattctctcaacaattctcgcccatcgtccccaaatctctctcaaatccc1500taatttctttcgaattacaaatccccaatttctgaaacc1539<210>3<211>2501<212>dna<213>artificialsequence<400>3ggatttatggctgtggatcgcccagcttttcctgggtcgaggaatatgcttgatcatcat60agagacatgaggctggacatagacaacatgagttatgaggtaacgtcaatattcctgtct120attatatttcttgaactgtctgaacaaaaaggaactcctagcactaggcgaaagaatagg180aaatgcctttatttttctcttcctctgactttcatgtattctgaatttctcgaaatgtcc240gaacaaataggaactcctcgcactaagcgaaaggattgggaatgtcagcacaggcttgtc300tgaagatttgataccgaagtgtttaacagaaacaatatattgttcatcagatcaaatcca360ggatgaaggttcatgtgcaatttgcctggtaagagtcttccacttgaaaccggaaattat420aagattgccgtttccattagtgtggttttaattttatcttagcgctttttagaccaattg480gactgtaaattgcttaactgctggaaatctaacttgtatataacccgattgacaggaaga540gtacaatgacagggatgatgttggtgcattgaaaagttgcggtcacgattaccatgtgag600ctgcatcaagaagtggttgtcaatgaaaaattcttgtccaatctgcaaaggttgtgctct660tcctgataatatgaaggagaaataatttaatcacgtcgttagcgcttcattatattacca720ttcttgtatatatatttagagataatcccgaaaacggaagaaacaatacttgtttcgtat780tatgtaaagggagtgttagccaatttaaattaatttgtttcaggcttccatttaaatgtt840gtgaagcctttttgcaattgttgttgttccgtatatggctctagtatatagttttttttt900cttctaattttatgattccttttcaaaactgagaagctagtttatgatggaaaggggaaa960accttgaaaacaaattattttttcggtttttaattttttggggaggggaggcagattctc1020tgcccttctacttttcgtgccctttcatgctcttttgtttgtgtgataatcgttaaatca1080cgttaacattttatattactaatcttttttatcttattatctttataaaaaaattataaa1140atattaatgtgatttaaccgtaactacacaaaataagagggtacggaaggtaggagggca1200gacaatctacctcctcacgcgcacccttttgaccattcaaaaggcccctgcacatttctg1260ttcattgatttctcttttttgggttttttcaacgaatgatattatttacattaagaggat1320aaatagtgtttagcctcacaattgactagtaataatgttgttcaaatttctccttggcga1380aaatcgaacttaagatttctttcttgccaataaagagaaataccactaaatcatagtagt1440agctcacctccttctacttgtatacaactttttaaattacttttcaagttagtttcaagt1500acttatttggtattactatttataaaaactaaagtcaaaattaacatatgaatttgggaa1560tgaggatggcacgcccgaacttgatactcttagttgccatccctactc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