一种核黄素发酵生产方法与流程

本发明属于发酵工程技术领域，具体地，涉及一种核黄素发酵生产方法。

背景技术：

核黄素（riboflavin）是一种黄色、光敏感、微溶于水的固体，是核醇与6，7-二甲基异咯嗪的缩合物，基于此，将其命名为核黄素。在细胞内以黄素单核苷酸（fmn）和黄素腺嘌呤二核苷酸（fad）的形式存在，作为氧化还原酶的辅酶，在代谢反应中作为氢载体。大多数微生物和植物自身具有体内合成核黄素的功能，而人和动物都缺乏核黄素合成途径，属于核黄素异养型。核黄素是人和动物的必需生长因子，在某些情况下会出现核黄素缺乏症。因此机体内需要补充适量核黄素。人体大约每天需要0.3~1.8mg核黄素，而动物饲料中必须含有1~4mg/kg的核黄素才能满足其生长需要并提高营养的利用率。目前，全世界核黄素年产销量超过万吨，其中70%用于畜牧养殖业，30%用于食品和医药行业。

目前核黄素的生产过程中存在以下问题：

第一：目前工业生产发酵核黄素的工程菌株生长缓慢，生长周期长，造成资源浪费和成本提高；

第二：细胞从头合成核黄素时，相当一部分前体物——磷酸核糖焦磷酸（prpp）进入嘧啶代谢，从而降低了核黄素的收率，目前最高收率达到0.1g核黄素/g葡萄糖[1]，而理论值应接近0.4g核黄素/g葡萄糖，实际值远远低于理论值；

第三：由于核黄素在碱性条件下见光易分解为光黄素，并且温度越高，越易分解，使得在发酵后期处理过程得到的纯度较低。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种核黄素发酵生产方法。所述方法采用枯草芽孢杆菌为出发菌株，通过对合成途径以及提取过程中的参数和操作进行优化，得到了高效率和高纯度的核黄素产品。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种核黄素发酵生产方法，其特征在于：以枯草芽孢杆菌为出发菌株，在发酵培养基中添加尿嘧啶，同时在发酵过程中分批补加碳源和氮源，得到含有核黄素粗品的发酵液；调整发酵液ph至11-13，使其充分溶解核黄素，再酸化发酵液至ph为5.0-6.0，使核黄素充分析出，加入氧化剂，加热搅拌，离心，收集沉淀并烘干得到核黄素粗品；向核黄素粗品中加入酸溶液调节，再加氧化剂加热搅拌，得到核黄素产品；

所述枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis），已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2019年10月15日；保藏编号为cgmccno.18685。

作为对上述方案的进一步优化，所述核黄素发酵生产方法，包括以下步骤：

步骤一、种子培养：挑取枯草芽孢杆菌单菌落于5ml种子液培养基中，37℃转速为200r/min，培养12h，转接至300ml种子液培养基中，转速为200r/min，37℃培养14h，得种子液；所述种子液培养基中所包含的成分及其含量分别为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l和尿嘧啶0.1g/l，初始ph调整为6.8~7.2；

步骤二、发酵培养：将步骤一所得种子液以10%的接种量接种于3l发酵培养基中，发酵温度为39℃，转速为300r/min，通气量为1.0vvm，发酵时间为35~48h；在发酵过程中于培养12h、18h和24h时分批补加终浓度为20g/l碳源和终浓度为5g/l氮源进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液；

所述发酵培养基中所含的成分及其含量分别为：葡萄糖或者蔗糖60g/l、酵母粉或玉米浆粉15g/l、蛋白胨5g/l、mgso4∙7h2o0.5g/l、尿素10g/l和尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2；

步骤三、向步骤二所得发酵液中添加氢氧化钠溶液至ph为12，离心收集上清，得上清液；向所述上清液中添加盐酸溶液至ph为5.5，得酸化后的发酵液；向所述酸化后的发酵液中加入质量浓度为0.2-0.5%的过氧化氢，于80℃下加热搅拌1.5h，离心，收集沉淀并烘干，得核黄素粗品；

步骤四、向步骤三所得核黄素粗品中加入盐酸调节ph为5.5，进一步加热除去粗品中的残余杂质，得核黄素产品。

作为对上述方案的进一步优化，所述步骤三和步骤四是在避光条件下进行。

作为对上述方案的进一步优化，步骤四中在加入盐酸调节后再加入质量浓度为0.2-0.5%的过氧化氢，于80℃下加热搅拌1.5h，得核黄素产品。

作为对上述方案的进一步优化，步骤二中所述碳源为葡萄糖或蔗糖，所述氮源为酵母粉或玉米浆粉。

有益效果：

1、本发明所述发酵生产方法首先采用的出发菌株为嘧啶操纵子缺陷菌株，所述缺陷菌株完全阻断嘧啶核苷酸从头合成途径；同时在发酵培养基中添加尿嘧啶，使细胞通过补救途径合成嘧啶核苷酸，以减少嘧啶核苷酸从头合成途径的代谢通量，从而提高核黄素的产量和收率，降低核黄素发酵成本。

2、本发明通过优化种子培养基和发酵培养基配方，控制种子液中菌株的生长状态，以进一步提高扩大发酵后菌株的生长速率，缩短生长周期，减少能源浪费，提高核黄素合成效率；同时在发酵过程中分批补料改变发酵液中碳源、氮源和碳氮比，提高核黄素产量和收率，使得产量达到18.5g/l，收率达到0.154g核黄素/g葡萄糖。优化后期提取工艺，加酸析出核黄素，并通过氧化加热的方式除去杂质，提高核黄素纯度，达到98.6%。

3、在发酵产物提取时，采用避光处理，缩短加入碱后反应的时间，避免核黄素碱化后不稳定，发生分解；由于核黄素在酸性条件下溶解度低，通过两次酸化以获得高纯度核黄素。此外，两次次加入氧化剂h2o2有利于保护核黄素的结构稳定，损失减少，纯度提高。

生物材料的保藏

枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis），已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（cgmcc），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2019年10月15日；保藏编号为cgmccno.18685。

附图说明

图1是核黄素发酵产量图；

图2是核黄素发酵收率图；

图3是未向核黄素粗品中添加过氧化氢得到的核黄素提取纯度图；

图4是向核黄素粗品中添加过氧化氢得到的核黄素提取纯度图；

图5是枯草芽孢杆菌发酵培养过程中细胞密度及核黄素产量曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

通过失活pyroperon，缺陷嘧啶核苷酸合成酶，阻断嘧啶核苷酸合成途径。采用如下操作：在pyroperon中插入“cr”片段，同时替换其从启动子-35区上游开始，包括全部pyrr基因编码序列，以及pyrp基因部分编码序列，总共962bp的序列。得到pyroperon缺陷菌株。具体操作如下：

以枯草芽孢杆菌的染色体为模板，用引物pu1和pu2cr，pcr扩增pyroperon的启动子-35区上游同源序列，用pd1cr和pd2扩增pyrp基因编码区下游同源序列，用引物cr1和cr2扩增“cr”片段，并通过一步重叠pcr方法，将上述三个片段拼接。

采用感受态转化方法，将上述拼接片段转化枯草芽孢杆菌，用含6μg/ml氯霉素的lb平板筛选重组菌，得到pyroperon缺陷菌株。对该菌株进行保藏，保藏信息如下：枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis），已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（cgmcc），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2019年10月15日；保藏编号为cgmccno.18685。

其中，采用的引物序列如下：

pu1：cctcggacttatgcttgg

pu2cr：tgggtgctttagttgaagaccgttttttctgaggttttcg

cr1：tcttcaactaaagcacccat

cr2：tattcattcagttttcgtg

pd1cr：cacgaaaactgaatgaataatcattcagccttcagcatt

pd2：tctccgtaagtcgttgtc

pyrr基因编码pyroperon表达调节蛋白，同时还有带有次要的磷酸核糖转移酶活性。pyrp基因编码尿嘧啶运输蛋白之一，负责尿嘧啶的吸收和分泌。这两个基因的功能都与补救途径合成嘧啶核苷酸有关，它们在pyroperon缺陷菌株中都随着pyroperon表达的被阻断而缺陷。

一、制备种子液

制备种子培养基，其中胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调整为6.8~7.2。

实施例1：

挑取枯草芽孢杆菌出发菌株单菌落于5ml种子液培养基中，37℃转速为200r/min，培养12h，转接至300ml种子液培养基中，转速为200r/min，37℃培养10h，得种子液z1。

实施例2：

挑取枯草芽孢杆菌出发菌株单菌落于5ml种子液培养基中，37℃转速为200r/min，培养12h，转接至300ml种子液培养基中，转速为200r/min，37℃培养12h，得种子液z2。

实施例3：

挑取枯草芽孢杆菌出发菌株单菌落于5ml种子液培养基中，37℃转速为200r/min，培养12h，转接至300ml种子液培养基中，转速为200r/min，37℃培养14h，得种子液z3。

实施例4：

挑取枯草芽孢杆菌出发菌株单菌落于5ml种子液培养基中，37℃转速为200r/min，培养12h，转接至300ml种子液培养基中，转速为200r/min，37℃培养16h，得种子液z4。

实施例5：

挑取枯草芽孢杆菌出发菌株单菌落于5ml种子液培养基中，37℃转速为200r/min，培养12h，转接至300ml种子液培养基中，转速为200r/min，37℃培养18h，得种子液z5。

二、分批补料发酵工艺的优化

实施例6：

制备发酵培养基，其中葡萄糖60g/l，酵母粉15g/l，蛋白胨5g/l，mgso4∙7h2o0.5g/l，尿素10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2。

将实施例1-5中的种子液z1-z5分别以10%的接种量接种于3l发酵培养基中，发酵温度为39℃，转速为300r/min，通气量为1.0vvm，发酵时间为35~48h，在发酵液中于培养12h、18h和24h时分批补加20g/l葡萄糖和5g/l酵母粉进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液f1-f5。

实施例7：

制备发酵培养基，其中蔗糖60g/l，酵母粉15g/l，蛋白胨5g/l，mgso4∙7h2o0.5g/l，尿素10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2。

将实施例1-5中的种子液z1-z5分别以10%的接种量接种于3l发酵培养基中，发酵温度为39℃，转速为300r/min，通气量为1.0vvm，发酵时间为35~48h，在发酵液中于培养12h、18h和24h时分批补加20g/l蔗糖和5g/l酵母粉进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液f6-f10。

实施例8：

制备发酵培养基，其中葡萄糖60g/l，玉米浆粉15g/l，蛋白胨5g/l，mgso4∙7h2o0.5g/l，尿素10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2。

将实施例1-5中的种子液z1-z5分别以10%的接种量接种于3l发酵培养基中，发酵温度为39℃，转速为300r/min，通气量为1.0vvm，发酵时间为35~48h，在发酵液中于培养12h、18h和24h时分批补加20g/l葡萄糖和5g/l玉米浆粉进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液f11-f15。

实施例9：

制备发酵培养基，其中蔗糖60g/l，玉米浆粉15g/l，蛋白胨5g/l，mgso4∙7h2o0.5g/l，尿素10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2。

将实施例1-5中的种子液z1-z5分别以10%的接种量接种于3l发酵培养基中，发酵温度为39℃，转速为300r/min，通气量为1.0vvm，发酵时间为35~48h，在发酵液中于培养12h、18h和24h时分批补加20g/l蔗糖和5g/l玉米浆粉进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液f16-f20。

实施例10：

制备发酵培养基，其中葡萄糖60g/l，酵母粉20g/l，蛋白胨5g/l，mgso4∙7h2o0.5g/l，尿素10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2。

将实施例1-5中的种子液z1-z5分别以10%的接种量接种于3l发酵培养基中，发酵温度为39℃，转速为300r/min，通气量为1.0vvm，发酵时间为35~48h，在发酵液中于培养12h、18h和24h时分批补加20g/l葡萄糖和7g/l酵母粉进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液f21-f25。

实施例11：

制备发酵培养基，其中蔗糖60g/l，酵母粉20g/l，蛋白胨5g/l，mgso4∙7h2o0.5g/l，尿素10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2。

将实施例1-5中的种子液z1-z5分别以10%的接种量接种于3l发酵培养基中，发酵温度为39℃，转速为300r/min，通气量为1.0vvm，发酵时间为35~48h，在发酵液中于培养12h、18h和24h时分批补加20g/l蔗糖和7g/l酵母粉进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液f26-f30。

实施例12：

制备发酵培养基，其中葡萄糖60g/l，玉米浆粉20g/l，蛋白胨5g/l，mgso4∙7h2o0.5g/l，尿素10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2。

将实施例1-5中的种子液z1-z5分别以10%的接种量接种于3l发酵培养基中，发酵温度为39℃，转速为300r/min，通气量为1.0vvm，发酵时间为35~48h，在发酵液中于培养12h、18h和24h时分批补加20g/l葡萄糖和7g/l玉米浆粉进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液f31-f35。

实施例13：

制备发酵培养基，其中蔗糖60g/l，玉米浆粉15g/l，蛋白胨5g/l，mgso4∙7h2o0.5g/l，尿素10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2。

将实施例1-5中的种子液z1-z5分别以10%的接种量接种于3l发酵培养基中，发酵温度为39℃，转速为300r/min，通气量为1.0vvm，发酵时间为35~48h，在发酵液中于培养12h、18h和24h时分批补加20g/l蔗糖和7g/l玉米浆粉进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液f36-f40。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

三、核黄素的分离提取工艺

1.将实施例6-13中的发酵液f1-f40置于包有锡箔纸的烧杯中，用naoh溶液调整发酵液至ph=12左右，以溶解核黄素；

2.将上述发酵液转移至包有锡箔纸的50ml离心管中，13000r/min离心1min，收集上清液置于包有锡箔纸的烧杯中；

3.向收集的上清液中加入盐酸溶液，调整ph值至5.5左右，使得核黄素充分析出；

4.向酸化后的发酵液加入氧化剂0.2~0.5%（w/v）h2o2，边加热边搅拌，于80℃下加热1.5h，

5.将加热氧化后的发酵液转移至包有锡箔纸的50ml离心管中，13000r/min离心5min，收集沉淀并烘干，即为核黄素粗品c1-c40。

四、高纯度核黄素提取工艺优化

实施例14：

向得到的核黄素粗品中加入盐酸调节，进一步加热，除去粗品中的残余杂质，得到纯度提高的核黄素h1-h40；

实施例15：

向得到的核黄素粗品中加入盐酸调节，加入氧化剂h2o2，进一步加热，除去粗品中的残余杂质，得到纯度提高的核黄素h41-h80。

五、核黄素产量测定和收率计算

1.取0.05mol/l的naoh溶液，将发酵液f1-f40稀释适当倍数并充分溶解核黄素；

2.13000r/min离心1min，沉淀细胞，收集上清；

3.取上清液加入盐酸溶液，将发酵液的上清液稀释适当倍数并将其ph值调整至中性，制备成待测样品；

4.用分光光度计测定样品的od444值，按照下列公式：核黄素(g/l)=(od444-0.0057)/32.1×稀释倍数，计算核黄素浓度；用400μl0.05mol/l的naoh溶液和3.60ml的hac-naac缓冲液的混合溶液，作为空白对照。所测定的od444值应控制在0.2~1.0范围内，可通过变化样品稀释倍数调节。

5.核黄素收率(g)：消耗一克葡萄糖能够得到的核黄素克数。

六、核黄素纯度测定

按中国药典2005颁布的方法测定核黄素结晶的纯度。具体方法如下：

准确称量75mg核黄素测定样品，用75ml超纯水溶解，并在溶液中加入1ml冰乙酸。放在带有加热装置的磁力搅拌器上加热搅拌，使核黄素充分溶解。然后将该溶液定溶至500ml容量瓶中。准确量取10ml稀释后的核黄素溶液定溶到含有7ml1.4%醋酸溶液的100ml容量瓶中，用紫外分光光度计在444nm的波长下测定最后稀释的核黄素的od值，计算精制核黄素的纯度。

核黄素纯度(%)=10×(吸光度-0.0057)×500/(0.0321×75)

七、最终优化结果

1.核黄素产量。结果见图1。

2.核黄素收率。结果见图2。

3.核黄素纯度。结果见图3。

4.枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）rx21发酵培养过程中生长及核黄素产量曲线。结果见图4。

5.结论

（1）种子液培养

种子液最佳转接培养时间：14h。此时获得的种子液转接入发酵罐后效果最好。

（2）分批补料发酵培养

发酵培养基成分：葡萄糖60g/l，玉米浆粉20g/l，蛋白胨5g/l，mgso4∙7h2o0.5g/l，尿素10g/l，尿嘧啶0.1g/l，初始ph调至7.2。

在发酵液中于培养12h、18h和24h时分批补加20g/l葡萄糖和7g/l玉米浆粉进行反应，得到含有核黄素粗产物的发酵液。

此培养基及补料方式所获得的核黄素产量最高。

（3）高纯度核黄素提取工艺

两次次加入氧化剂h2o2有利于保护核黄素的结构稳定，损失减少，纯度提高。

（4）由上述优化的发酵提取工艺获得的核黄素产量、收率和纯度均比原方案高：

核黄素产量：18.5g/l

核黄素收率：0.154g核黄素/g葡萄糖

核黄素纯度：98.6%。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。