一种免提取新型冠状病毒核酸检测的方法与试剂盒与流程

技术领域：

本发明涉及生物技术与医学领域，具体涉及了一种用于检测新型冠状病毒的方法和试剂盒。适用于新型冠状病毒感染的检测和临床辅助诊断。

背景技术：
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新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2,sars-cov-2)引起的疾病。2019年12月，武汉市部分医疗机构陆续出现不明原因肺炎病人，武汉市持续开展流感及相关疾病监测，2020年1月7日，实验室检出一种新型冠状病毒，获得该病毒的全基因组序列。目前传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，隐性感染者也可能成为传染源，主要经呼吸道飞沫传播和接触传播，人群普遍易感。新型冠状病毒属于β冠状病毒属。进化分析显示，新型冠状病毒与来自中华菊头蝠(中国马蹄蝠的一种)的蝙蝠sars样冠状病毒(batsevereacuterespiratorysyndrome-relatedcoronaviruses)最为相似，核苷酸同源性达到84％，与人类sars病毒的核苷酸同源性达到78％，与mers病毒的同源性达到约50％。目前尚无明确有效的抗新型冠状病毒的药物和疫苗，因此控制疫情的进一步发展主要靠及时的发现和隔离。

实时荧光pcr技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使pcr产物的扩增及分析的全过程可以在单管内封闭完成，并且可以自动分析结果，具有实时、准确、快速、简便等特点，是一种先进的分子检测技术。目前已经在临床上应用的荧光pcr检测试剂和方法多达上千种；常规的通过荧光pcr检测病原体核酸的方法一般都需要两个独立的过程，一是病原体dna或rna核酸模板制备，二是将核酸模板加入到反应体系中进行pcr扩增检测。各种病原体结构的不同，在各个实验室使用和建立的核酸处理的试剂和方法也不完全一致。但处理过程基本一致，都需要经过消化裂解、吸附纯化、洗涤收集等多个步骤。对于单个样本的处理往往耗时数十分钟，需要对大量样本进行处理时，耗时甚至比pcr检测反应更长。由于繁多的操作步骤，在大样本处理过程中，样本之间的相互污染也不可避免；因防护不当，出现在处理过程中人感染病原体的情况也较为多见。

免提取荧光pcr技术采用优化的pcr缓冲液体系和特殊的dna聚合酶，减少样本中存在的多种抑制剂对pcr反应的干扰，具有强活力、高稳定性、强耐受性等特点。该技术无需进行昂贵又费时的核酸抽提过程，使用动物标本或病原体保存液即可直接用于荧光pcr扩增鉴定，极大地简化了操作步骤和缩短了检测时间。免提取荧光pcr技术正在逐渐被应用于各项动植物基因的研究中，未来将广泛应用于临床病原体检测，积极地推动分子诊断的发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种免提取新型冠状病毒核酸检测的方法和试剂盒，简化操作步骤，缩短pcr检测时间。

为实现上述目的，本发明的技术方案是针对于新型冠状病毒两个不同的基因编码区的特异保守区域为靶标区域，设计两对特异性引物及荧光探针，同时设置了内标质控系统，用于整个反应体系的质量控制。

一种免提取新型冠状病毒核酸检测的方法与试剂盒，其包含ncov反应液、pcr增强剂、ncov阳性质控品和ncov阴性质控品。

所述的新型冠状病毒检测试剂盒中的ncov反应液包括引物探针、dna聚合酶、逆转录酶、ung酶、三磷酸核苷、镁离子、tris-hcl、kcl，mgcl2和tritonx-100。

所述的ncov反应液中的特异性引物和探针是针对新型冠状病毒orf1ab基因和n基因保守序列设计的引物和探针，以及作为内标的β-globin基因的引物和探针。

orf1ab基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-ggcttcacatatgtattgttc-3’，和5’-gctcaaactcttcttcttcac-3’；orf1ab基因特异性的探针的序列是5’-tcaccttcttcttcatcctcatctgg-3’，并且，探针的两端分别标记有荧光发生基团fam和荧光淬灭基团bhq1；

n基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-aaggcttctacgcagaag-3’，和5’-gtgcctggagttgaatttc-3’；n基因特异性的探针的序列是5’-agcctcttctcgttcctcatcac-3’，并且，探针的两端分别标记有荧光发生基团rox和荧光淬灭基团bhq2；

β-globin基因的正向和反向引物的序列分别是5’-ctgagggtttgaagtcca-3’，和5’-tctgccctgacttttatg-3’；n基因特异性的探针的序列是5’-ctcctaagccagtgccagaaga-3’，并且，探针的两端分别标记有荧光发生基团vic和荧光淬灭基团bhq1。

所述的新型冠状病毒检测试剂盒中的ncov反应液中dna聚合酶最佳浓度为2u/反应，，逆转录酶用量为1.5u/反应，ung酶用量为0.2u/反应；dntps最佳浓度为2mmol/l，还包含5mmol/ltris-hcl、10mmol/lmgcl2、30mmol/lkcl。

所述的新型冠状病毒检测试剂盒中的pcr增强剂包括1-6％甲酰胺、0.01-0.2％甘油、1-5mg/mlbsa，其作用是提高dna聚合酶活性，增加逆转录酶耐热性。

所述阳性质控品为含有插入新型冠状病毒冠状病毒特异型保守序列的puc57载体质粒。所述阴性质控品为含人管家基因β-globin基因序列的te缓冲液。

本发明实现过程如下：

一种免提取荧光聚合酶链反应(荧光pcr)定性检测病原体核酸的方法，检测步骤如下：

1.反应体系的配制

按照反应数加入pcr增强剂，每反应为4μl，ncov反应液为35μl。按照39μl/反应，分装pcr反应液到加有样本的pcr管中，盖上盖子，转移至pcr扩增区；

2.样本处理

(1)将含有患者标本的咽拭子或鼻拭子在200-300μl生理盐水(或病毒保存液)中洗涤；

(2)吸取11μl拭子洗液(若为痰液样本，需涡旋振荡20s以上，避开粘稠液体，吸取11μl)，或11μl病毒保存液加入pcr反应管中，阳性和阴性质控应平行操作；

3.荧光pcr扩增与检测

反应条件：

4.结果判读

反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节baseline的start值、end值和threshold值(可自行调节，start值可以在3-15之间，end值可以位于5-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，读取软件显示的ct值，并做如下分析：

分别选择各个荧光通道，读取ct值；对照下表进行判定：

当orf1ab基因阳性或(和)n基因阳性时，可判为新型冠状病毒(sars-cov-2)感染阳性，否则为新型冠状病毒(sars-cov-2)阴性。

附图说明：

图1为本发明试剂盒阳性质控品荧光pcr曲线。图中1代表sars-cov-2阳性质控品fam通道扩增曲线，2代表sars-cov-2阳性质控品rox通道扩增曲线，3代表内标基因vic通道扩增曲线。

具体实施案例

本发明具有用于检测新型冠状病毒的试剂盒及检测方法，采用taqman探针法荧光pcr检测技术，快速检测临床样品中新型冠状病毒特有序列，从而判断样品中是否存在新型冠状病毒。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特色将会随着描述而更加清楚。这些实施例仅是示范性，并不对本发明的范围构成任何限制。下述实例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、免提取荧光pcr检测新型冠状病毒试剂盒的研制

一、引物和探针的设计

通过对国家生物信息中心/国家基因组科学数据中心公布的新型冠状病毒基因组序列利用引物探针在线设计工具http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer对orf1ab基因和n基因设计特异性引物和探针。综合考虑特异性和扩增效率，最终选择两组引物探针序列如下：

orf1ab基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-ggcttcacatatgtattgttc-3’，和5’-gctcaaactcttcttcttcac-3’；orf1ab基因特异性的探针的序列是5’-tcaccttcttcttcatcctcatctgg-3’，并且，探针的两端分别标记有荧光发生基团fam和荧光淬灭基团bhq1；

n基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-aaggcttctacgcagaag-3’，和5’-gtgcctggagttgaatttc-3’；n基因特异性的探针的序列是5’-agcctcttctcgttcctcatcac-3’，并且，探针的两端分别标记有荧光发生基团rox和荧光淬灭基团bhq2；

二、目的基因重组质粒的制备

委托上海捷瑞生物公司合成并纯化含新型冠状病毒靶标基因的质粒。通过紫外分光光度仪测得浓度，然后计算拷贝数，并用1×te(ph8.0)分别稀释至1.0×10⁵copies/ml～1.0×10²copies/ml的标准品。

三、反应体系的建立和优化

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的条件下，分别使用0.2μmol/l至1μmol/l浓度梯度的引物和0.05μmol/l至0.1μmol/l浓度梯度的探针进行pcr反应，经过多次重复试验，最终确定最佳引物浓度为1μmol/l，探针浓度为0.1μmol/l。

dna聚合酶用量的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用1u至5u浓度梯度的酶用量/反应，经多次重复试验，最终确定最佳酶用量为2u/反应。

尿嘧啶糖基酶(ung)的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用0.1u至0.3u浓度梯度的ung酶用量/反应，经多次重复试验，最终确定最佳ung酶用量为0.2u/反应。

脱氧三磷酸核苷的优化：脱氧三磷酸核苷(dntp)混合物选用datp，dgtp，dctp，dutp组合，选择两个比例(1：1：1：1和1：1：1：2)来做对比，结果显示配比为1：1：1：2为最优选。按最佳比例配制后的dntps分别用1mmol/l至3mmol/l浓度梯度进行多次重复试验，最佳浓度为2mmol/l。

镁离子浓度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用50mmol/l至100mmol/l浓度梯度的镁离子，经多次重复试验，最终确定最佳镁离子浓度为100mmol/l。

反应温度和时间的优化：根据酶的活性和寡多核苷酸的长度，主要对反应温度和延伸时间进行了优化，最终确定最佳的反应温度和时间为50℃15min，96℃60s；pcr反应条件为96℃3s，58℃15s，共45个循环。

四、检测结果

该试剂盒的阳性质控品为含有新型冠状病毒特异型保守目标序列的puc57载体质粒和内标引物扩增的目标片段的载体质粒，通过实验数据表明该试剂盒阳性质控品和内标溶液扩增效果优异，实验结果参考图1。

实施例2、实际临床样品的检测

1.临床样本类型本实施例所采用临床样本来自浙江省疾病预防控制中心采集的咽拭子样本，所采拭子存放于生理盐水或病毒保存液中，共301例，其中105例阳性样本，106例阴性样本。

2.参考试剂盒采用浙江省疾病预防控制中心使用的试剂盒作为参考试剂。

3.检测结果

选取301例进行检测，其中有2例样本为浓痰与试剂盒要求的样本类型不一致因此剔除，4例因内标未出，检测结果无效剔除，总计有效病例295例。所有有效结果均纳入统计分析。

4.结果分析

本发明所述试剂盒结果与参考试剂盒结果统计显示，阳性符合率为94.29％(87.98％-97.87％)，阴性符合率为99.47％(97.10％-99.99％)，总符合率为97.63％(95.17％-99.04％)。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。