抗HPV16E7蛋白单抗79A11、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用与流程

本发明涉及免疫学领域，具体涉及抗hpv16e7蛋白单抗79a11，还涉及杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。

背景技术：

宫颈癌是全球妇女癌症中居第四位的癌症，每年新增530，000病例和死亡275，000例，这些病例中大约85％来源于发展中国家。在中国，宫颈癌发病率居女性生殖道恶性肿瘤的首位。宫颈的高危型人乳头瘤病毒(highriskhumanpapillomavirus，hr-hpv)的持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变(cin)和宫颈癌的直接病因，其中hpv16型最高，占53％。hpve7蛋白是hpv致癌的关键分子，e7致癌蛋白选择性表达在肿瘤细胞中，不在正常细胞中表达，随着宫颈上皮内瘤cin变从低级别向高级别(从cin1经历cin2、cin3到侵蚀性宫颈癌)进展，e7致癌蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高，最终致癌蛋白e7蛋白出现在宫颈脱落细胞中。hr-hpv检测联合细胞学检查(如tct)，可以增加宫颈上皮内瘤变(cin)iii的检出率并减少宫颈癌的发生，共同检测方法也可增加宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌的检出率。对30～65岁女性进行细胞学和hpvdna共同检测，不可避免会出现少部分细胞学检查结果阴性但hr—hpvdna检测阳性者。美国最新的宫颈癌筛查指南提供了2种方案：(1)在12个月时重复细胞学和hr—hpv共同检测。如果重复共同检测时hpv阳性或细胞学检查结果为lsil或更严重者，则应行阴道镜检查；(2)立即行hpv基因分型检测(hpvl6或hpvl8)。新的筛查指南对hr—hpv检测结果阳性者缺乏肯定、一致的处理方案，而且阴道镜检查是有创伤的检查，也增加患者心理负担和经济负担。因此，针对那些细胞学检查结果阴性但hr-hpv的dna检测阳性的妇女，因为hr-hpv的dna检测阳性不能预测哪些患者最终发展为宫颈内瘤变cin1、cin2、cin3和宫颈浸润癌，但如果补充检测hr-hpv的e7致癌蛋白比如hpv16e7、hpv18e7致癌蛋白等，就可以间接提示宫颈有癌细胞的存在，很可能在宫颈上皮内瘤cin2、cin3时期甚至cin1时期就发现有癌细胞的存在，最终达到早期预警、早期诊断和早期治疗宫颈癌的目的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗hpv16e7蛋白单抗79a11；本发明的目的之二在于提供分泌抗hpv16e7蛋白单抗79a11的杂交瘤细胞hpv16e7-79a11；本发明的目的之三在于提供所述抗hpv16e7蛋白单抗79a11的制备方法；本发明的目的之四在于提供所述抗hpv16e7蛋白单抗79a11制备检测hpv16e7的试剂盒中的应用；本发明的目的之五在于提供所述抗hpv16e7蛋白单抗79a11作为捕获抗体中的应用；本发明的目的之六在于提供含有所述抗hpv16e7蛋白单抗79a11的试剂盒。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、抗hpv16e7蛋白单抗79a11，所述单抗79a11包括重链和轻链，所述重链的可变区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.6的第50-54位、第69～87位、第120-126位所示；所述轻链的可变区cdr1、cdr2、cdr3氨基酸序列如seqidno.8的第44～59位、第75～81位和第114-122位所示。

优选的，单抗重链的氨基酸序列如seqidno.6所示；单抗轻链氨基酸序列如seqidno.8所示。

优选的，单抗重链的核苷酸序列如seqidno.5所示；单抗轻链核苷酸序列如seqidno.7所示。

优选的，所述单抗79a11由杂交瘤细胞hpv16e7-79a11分泌，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：c201718。

2、分泌抗hpv16e7蛋白单抗79a11的杂交瘤细胞hpv16e7-79a11，所述杂交瘤细胞保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：c201718。

3、所述抗hpv16e7蛋白单抗79a11的制备方法，包括如下步骤：以hpv16e7蛋白为抗原免疫小鼠，用杂交瘤技术将sp2/0与免疫balb/c小鼠的脾细胞或淋巴结细胞融合，筛选稳定性好、高效价的抗hpv16e7蛋白的杂交瘤细胞株，制备单抗腹水，经纯化获得抗hpv16e7蛋白单抗79a11。

4、所述抗hpv16e7蛋白单抗79a11制备检测hpv16e7蛋白的试剂盒中的应用。

5、所述抗hpv16e7蛋白单抗79a11作为捕获抗体中的应用。

6、含有所述抗hpv16e7蛋白单抗79a11的试剂。

优选的，所述试剂为所述试剂为elisa试剂、免疫化学试剂、免疫荧光试剂、化学发光免疫分析试剂、westernblot检测试剂、免疫层析试纸的试剂、电化学试剂或磁珠试剂。

本发明的有益效果在于：本发明公开了分泌抗hpv16e7蛋白单抗79a11的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞能够分泌抗hpv16e7蛋白单抗79a11，可以用于hpv16e7蛋白的定量检测，并且具有特异性好、灵敏度高的优点，可以用于制备检测宫颈癌的试剂盒，如elisa试剂盒、免疫组化试剂盒、免疫荧光试剂盒或westernblot检测试剂盒，对宫颈癌早期诊断具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为westernblot检测纯化hpv16e7蛋白与组氨酸标签抗体反应结果。

图2为纯化后的单抗79a11的10％sds-page电泳图(m：marker；1和2道发现在分子量68kda和25kda处分别出现两条带)。

图3为间接elisa测定单抗79a11的最高效价图。

图4为4对可以配对单抗的单抗。

图5为单抗79a11与caski细胞和hela细胞的免疫细胞化学结果图(10×20)。

图6为单抗79a11与hpv16阳性的宫颈癌鳞癌、hpv18阳性的宫颈癌腺癌的免疫组织化学结果图。

图7单抗79a11的亲和力测定图。

图8为单抗配对及定量检测hpv16e7蛋白的双抗夹心elisa法的建立(a：为捕获抗体浓度优化图；b：抗原hpv16e7蛋白与捕获抗体反应时间优化图；c：双抗夹心elisa检测的抗原hpv16e7蛋白含量与od450nm之间的线性关系图；d：为计算抗原的检测限的回归方程图；e：抗原与信噪比值的关系图)。

图9为基于bas-鲁米诺-双抗夹心elisa法的捕获抗体浓度、抗原在ng级和μg级的线性关系图(a：捕获抗体79a11最佳浓度优化图；b：生物素化检测抗体biotin-69e2浓度优化图；c：抗原hpv16e7蛋白与捕获抗体作用时间优化图；d：3个封闭剂的3个时间点的本底图，e：3个封闭剂的3个时间点的信号图；f、g、h依次为抗原hpv16e7蛋白在ng级等比等差稀释法的直线拟合、双对数拟合和信噪比图；.i、j、k依次为抗原hpv16e7蛋白在μg级等比等差稀释法的直线拟合、双对数拟合和信噪比图)。

图10为检测宫颈癌标本的参考曲线和标本中hpv16e7蛋白含量图(a、b、c依次为检测宫颈癌标本的参考曲线的直线拟合、双对数拟合和信噪比；d为计算检测限的参考曲线和方程；e为4例宫颈正常组织、12例hpv16阳性的宫颈癌组织及其4例hpv52阳性的宫颈癌组织共3组组织的hpv16e7含量图)。

图11为单抗79a11与caski和hela细胞的间接免疫荧光反应结果图(10×40)。

图12为单抗79a11与caski和hela细胞中的总蛋白的westernblot反应图。

图13为单抗79a11的表位鉴定结果图(a：重叠肽的间接竞争elisa法初步筛选单抗79a11的优势线性b细胞表位；重叠肽在10μmol/l时的间接竞争elisa法初步筛选单抗79a11的优势线性b细胞表位；c：单抗79a11的特异性表位在hpv16e7蛋白的三维晶体结构建模图上的定位)。

图14为单抗79a11、69e2和69a6的特异性表位的保守性分析比对图。

保藏说明

将稳定分泌抗体79a11、69a6、69e2的杂交瘤细胞株送中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为hpv16e7-79a11、hpv16e7-69a6和hpv16e7-69e2；hpv16e7-79a11保藏日为2017年4月10日，保藏号为cctccno：c201718，分类命名为单克隆杂交瘤细胞株hpv16e7-79a11；hpv16e7-69a6保藏日为2017年4月10日，保藏号为cctccno：c201720，分类命名为单克隆杂交瘤细胞株hpv16e7-69a6；hpv16e7-69e2保藏日为2019年8月21日，保藏号为cctccno：c2019181，分类命名为小鼠杂交瘤细胞株hpv16e7-69e2。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明用基因工程技术克隆和表达hpv16e7基因，以纯化的hpv16e7蛋白为抗原免疫balb/c小鼠，用杂交瘤技术融合sp2/0与免疫balb/c小鼠的脾细胞和淋巴结细胞，筛选获得8个以上的稳定性好、高效价的抗hpv16e7蛋白单克隆杂交瘤细胞株，制备了单抗腹水，用盐析、亲和层析结合凝胶层析等综合方法纯化得到了8株纯度较高、效价较高的单抗，命名为79a11、69a6、69e2、74f3、72e6、54g5、54d5、54f4。

实施例1、制备hpv16e7蛋白

根据hpv16e7全长基因设计带有6个组氨酸标签的特异性引物，引物f和r的序列(下划线为核酸内切酶)如下：

f：5'-gcccatggaccatcaccatcaccatatgcatggagatacacctac-3’(seqidno.1)；

r：5'-gcaagcttttatggtttctgygaacagatggggcacac-3’(seqidno.2)。

以caski细胞基因组总dna为模板，pcr扩增hpv16e7全长基因，pcr反应条件如下：94℃预变性5min，94℃30s，55℃～70℃30s和72℃60s35个循环，72℃延伸7min。ncoⅰ和hindⅲ限制性酶酶切pcr产物hv16e7基因片段和质粒pet-28a(+)，将鉴定正确的重组质粒pet-28a(+)-hpv16e7转化感受态细胞rosetta(de3)plyss，将工程菌pet-28a(+)-hpv16e7-rosetta(de3)plyss在lb培养基中1mmiptg在37℃诱导4h，破菌液离心，12％sds-page电泳确定蛋白的表达量和表达形式，用镍柱亲和层析结合阴离子交换层析纯化hpv16e7蛋白，获得纯度大于95％的hpv16e7蛋白，westernblot分析如图结果1。结果显示表达的hpv16e7蛋白的表达量较高，且呈可溶性表达，分子量大约在18kda，hpv16e7蛋白的预测的理论分子量大约为11988.32da，接近12kda，pi＝4.59。但表达的hpv16e7蛋白的分子量在18kda，大于hpv16e7蛋白的理论分子量12kda，hpv16e7蛋白出现电泳异常行为现象，原因如文献(armstrongdjandromana.biochembiophysrescommun,1993)报道的野生型的hpv16e7蛋白因为带有大量的负电荷，所以hpv16e7蛋白在电泳时会在14～21kda迁移，本研究表达的hpv16e7蛋白表达的分子量大约在18kda，正好与文献报道的hpv16e7蛋白在14～21kda迁移相符合。

其中pcr扩增产物序列如(seqidno.3)所示：

编码的氨基酸序列如seqidno.4所示：

mdhhhhhmhgdtptlheymldlqpettdlycyeqfndsse

eedeidgpagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtledllmgtlgivcpicsqkp

实施例2、抗hpv16e7蛋白单克隆抗体的制备

用杂交瘤技术以hpv16e7蛋白为抗原免疫balb/c小鼠，将免疫小鼠的后腿腹股沟淋巴结b淋巴细胞和脾脏细胞分别与骨髓瘤细胞sp2/0-ag14融合，培养筛选、多次克隆化获得抗hpv16e7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，结果如表1和表2所示。

表1展示了脾脏来源的效价高的阳性多克隆杂交瘤细胞株，经过多次克隆化后筛选的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的名称、细胞上清液的抗体的od450nm值和抗体亚型，其中效价高和亚型非常明确的单抗有79a11(igm)、38e11(igm)、74f3(亚型不明确，但以igg2a为主)和72e6(亚型不明确)。从中可以看出脾脏来源的单克隆抗体的亚型主要是igm。

表1来源于脾细胞的阳性多克隆和单克隆杂交瘤细胞株

表2展示了腹股沟淋巴结来源的效价高的阳性多克隆杂交瘤细胞株，经过多次克隆化后筛选的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的名称、细胞上清液的抗体的od450nm值和抗体亚型，其中效价高和亚型非常明确的单抗有69e2、69a6、69d10、69b11、54d5、54f4和54g5等，除单抗69a6的亚型为igm外，其余6个单抗69e2、69d10、69b11、54d5、54f4和54g5的抗体亚型都为igg2a，说明淋巴结来源的单克隆抗体的亚型主要是igg2a。

表2、来源于淋巴结细胞的阳性多克隆和单克隆杂交瘤细胞株

单抗亚型鉴定及制备单抗腹水，分别按igm和igg的纯化方案纯化单抗。

单克隆抗体的亚型鉴定：用单抗亚型鉴定试剂盒鉴定阳性单克隆抗体细胞上清液的亚型有两种：igg2a和igm。igg2a亚型的阳性单克隆杂交瘤细胞株主要来源于淋巴结，主要有69d10、69b11、69e2、54d5、54f4、54g5等，而淋巴结来源的单抗69a6的亚型却是igm；igm亚型的阳性单克隆杂交瘤细胞株主要来源于脾脏，主要有79a11、56e4、38e11等，而脾脏来源的单抗74f3和72e6的亚型不明确，单抗74f3以igg2a为主(表3)。

表3、单抗亚型鉴定的od450nm值及其亚型结果

单抗腹水制备、收集和保存：

动物体内诱生法制备单抗腹水，结果显示实际注射balb/c小鼠的杂交瘤细胞数量是：1.5*10⁶-2.7*10⁶/只，大部分的小鼠产生腹水的体积在3-5ml/只之间，小部分可以达到8-10ml/只，注射到2.0*10⁶/只产生的腹水多于1.5*10⁶/只。用9号针头在消毒腹部后进入腹腔抽取腹水，腹水收集后4℃离心，细胞可以加细胞冻存液冻存，这种细胞以后复苏后会生长得更好，上清液为腹水单抗，在56℃水浴锅里灭活45min后加入同体积的甘油放在-80℃保存。

以2μg/ml包被抗原hpv16e7蛋白，间接elisa法一共检测了25株单抗腹水，抗体稀释度从1:5000开始倍比稀释到1:5120000，信噪比s/n值≥2.1为阳性判断阳性来最高效价，信噪比s/n＝待测样品的od值/阴性对照的od值，25株中的单抗腹水最高效价在1:128000以上的单抗腹水有11株：79a11、69e2、69a6、69a11、69b11、38e11、54d5、54f4、54g5、56e4和56e5(见表4)。

表4、效价≥1:128000的11株单抗腹水的最高效价

间接elisa测定纯化后的单抗的效价：

间接elisa法测定纯化后的8株纯度较高的单抗，以信噪比s/n≥2.1判断为阳性，单抗79a11、69a6、69e2、54g5、54d5、54f4、74f3和72e6的最高效价依次为6.25ng、0.78ng、0.19ng、1.56ng、0.39ng、1.56ng、6.25ng和6.25ng(表5)。

表5、纯化后的8株单抗的效价

单抗79a11和69a6亚型的亚型都为igm，单克隆抗体69e2为igg2a，用二步法-辛酸-硫酸铵沉淀和proteing纯化的igg2a亚型的单抗69e2的纯度高达95％以上，而且效价高大约0.19ng；用二步法-辛酸-硫酸铵+proteina法纯化igm亚型的单抗69a6的纯度高达95％以上，69a6的效价在0.78ng；用四步法-硫酸铵沉淀加凝胶过滤层析加igm柱加凝胶过滤层析纯化的igm亚型单抗79a11的纯度高达95％以上，单抗79a11效价大约6.25ng。单抗的高纯度和高活性对于后续的单抗的表征分析和检测方法的建立很重要。

将稳定分泌抗体79a11、69a6、69e2的杂交瘤细胞株送中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，分别命名为hpv16e7-79a11、hpv16e7-69a6、hpv16e7-69e2；hpv16e7-79a11保藏日为2017年4月10日，保藏号为cctccno：c201718，分类命名为杂交瘤细胞株hpv16e7-79a11；hpv16e7-69a6保藏日为2017年4月10日，保藏号为cctccno：c201720，分类命名为杂交瘤细胞株hpv16e7-69a6；hpv16e7-69e2保藏日为2019年8月21日，保藏号为cctccno：c2019181，分类命名为杂交瘤细胞株hpv16e7-69e2。

实施例3、单抗的鉴定

将单抗79a11腹水用50％、33％硫酸铵沉淀，再用分子筛分离igm和igg，然后将分子筛的第一个峰的样品用igm柱亲和层析纯化单抗79a11，再用分子筛脱盐。10％sds-page电泳中1和2道是单抗79a11综合方法纯化后的样品，可以在1和2道发现在分子量68kda和25kda处分别出现两条带，正好与igm抗体的重链和轻链的分子量一致，没有发现其他杂带(见图2)。说明用综合纯化单抗79a11的纯度较高，可以用于单抗79a11的鉴定和检测。

南京金斯瑞生物技术有限公司用杂交瘤细胞株79a11来测定单抗79a11的核苷酸序列，用单抗79a11的核苷酸序列预测单抗79a11的氨基酸序列，结果如下：

重链核酸序列如seqidno.5(1779bp)所示，结构为leadersequence-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-constantregion-stopcodon，黑体表示cdr区；

编码的氨基酸序列如seqidno.6(592aa)所示，结构为leadersequence-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-constantregion-stopcodon，黑体表示cdr区；

轻链核苷酸序列如seqidno.7(720bp)所示，leadersequence-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-constantregion-stopcodon，黑体表示cdr区；

轻链氨基酸序列如seqidno.8(239aa)所示，结构为leadersequence-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-constantregion-stopcodon，黑体表示cdr区；

实施例4、单抗79a11检测

1、用间接elisa法检测单抗79a11的最高效价

包被抗原hpv16e7全蛋白2μg/ml，单抗79a11从4μg/ml倍比稀释至0.1953μg/ml，100μl/well，12个浓度的单抗79a11分别与抗原hpv16e7蛋白反应。

结果：单抗79a11在6.25ng时的s/n值在2.5427，大于2.1，单抗79a11在6.25ng以上时s/n值都大于3.9，所以单抗79a11的最高效价为6.25ng，见表6和图3。

表6、间接elisa法测定单抗79a11的最高效价结果

2、单抗79a11与其他单抗配对

单抗79a11不标记辣根过氧化物酶hrp作为捕获抗体，与其他7株标记了hrp的抗hpv16e7蛋白的单抗(69a6-hrp、69e2-hrp、54d5-hrp、54g5-hrp、54f4-hrp、74f3-hrp、65b4-hrp)作为检测抗体配对，进行双抗夹心elisa实验；单抗79a11标记标记辣根过氧化物酶hrp作为检测抗体，与其他7株没有标记了hrp的抗hpv16e7蛋白的单抗(69a6、69e2、54d5、54g5、54f4、74f3、72e6)作为捕获抗体配对，进行双抗夹心elisa实验。

结果：56对配对单抗中，有4对单抗可以配对：79a11与69e2-hrp、79a11与74f3-hrp、79a11与69a6-hrp、79a11与54d5-hrp(见图4)；只有当单抗79a11为捕获抗体时，与4个单抗配对有比较强的阳性信号；单抗79a11为检测抗体时与其他7株单抗配对没有阳性信号。说明单抗79a11在双抗夹心elisa中适合做捕获抗体，不适合作为检测抗体。

3、抗hpv16e7蛋白单抗79a11的有效性和特异性鉴定

用免疫细胞化学和免疫组织化学进行抗hpv16e7蛋白单抗79a11的有效性和特异性鉴定，将纯化后的抗hpv16e7蛋白单抗79a11分别与caski细胞和hela细胞进行免疫细胞化学反应；

免疫细胞化学具体方法，先做宫颈癌细胞株caski和hela的细胞爬片，再把单抗79a11配置成不同的浓度分别与caski和hela的细胞反应(1μg/孔，0.5μg/孔，0.25μg/孔，0.125μg/孔，0.0625μg/孔，0.03125μg/孔，0.015625μg/孔，0.0078125μg/孔)，结果如图5所示。单抗79a11与hpv16阳性的caski细胞反应，当单抗79a11稀释程度达到7.8125ng/孔时，仍然有浅浅的棕黄色颗粒出现，说明灵敏度至少为7.8ng/孔，验证了单抗79a11在检测caski细胞中的天然的hpv16e7蛋白的有效性；当单抗79a11在同样的浓度与hela细胞反应物时，都没有出现棕黄色颗粒，验证了单抗79a11的特异性，表明单抗79a11在免疫细胞化学中检测天然的hpv16e7蛋白具有潜在的应用价值。

单抗79a11与hpv16阳性的宫颈癌鳞癌、hpv18阳性的宫颈癌腺癌的石蜡切片反应的组织免疫化学结果。如图6所示：单抗79a11与hpv16阳性的宫颈癌鳞癌反应可以出现棕黄色的颗粒反应，与hpv18阳性的宫颈癌腺癌反应不出现棕黄色的颗粒。说明单抗79a11可以检测到hpv16阳性的宫颈癌鳞癌中的天然的hpv16e7蛋白，而不能被检测到hpv18阳性的宫颈癌鳞癌中的hpv18e7蛋白，提示单抗79a11在hpv16阳性的宫颈癌的免疫组织化学的检测中具有潜在应用价值。

4、79a11的亲和力测定

将纯度大于95％的单抗79a11及其抗原hpv16e7全蛋白送南京金斯瑞生物科技有限公司测定单抗79a11与抗原hpv16e7全蛋白的亲和力。单抗79a11的亲和力测定结果如图7所示，结果显示，当79a11(igm)与抗原hpv16e7全蛋白结合后，用高盐洗脱时发现这种结合消失，因此判定79a11(igm)与hpv16e7蛋白被判定为没有特异性的结合。

5、hrp标记单抗与tmb检测系统定量检测hpv16e7蛋白的双抗夹心elisa法的建立

棋盘实验优化配对单抗中的捕获抗体和hrp标记检测抗体的最适工作浓度、优化抗原反应时间等，以优化条件建立参考曲线获得线性回归方程，确定该方法定量检测hpv16e7蛋白的信噪比为3的检测限，结果如图8所示。结果显示，双抗夹心elisa棋盘实验发现捕获抗体79a11的包被浓度依次从0.5μg/ml到1μg/ml，再到2μg/ml时，信号也逐渐升高，但在4μg/ml信号强度反而下降(图8，a)，说明捕获抗体79a11的最适包被浓度为2μg/ml，抗原hpv16e7蛋白与捕获抗体反应，反应信号与时间呈正相关(图8，b)。以抗原含量ng为横坐标，od450nm值为纵坐标，制备参考曲线。变异系数cv＝原始数据标准差/原始数据平均数。本实验的变异系数cv波动在0.899％～11.7264％。r²为判定系数，又称为决定系数，又称拟合优度，是建立在回归分析基础上的用于研究一个随机变量对另一个随机变量的解释程度，该值在0～1,越接近1说明自变量对因变量的解释程度越高。本实验的参考曲线中的判定系数r²＝0.9723(图8，c)，说明线性关系较好；以抗原为0和变异系数cv小于10％的低浓度两点获得为计算检测限的方程为y＝0.01122*x+0.6896和判定系数r²值＝0.9889(图8，d)。信噪比s/n＝待测样品od值/阴性对照od值,s为待测样品sample，n为阴性对照negative，以信噪比s/n＝3的高标准确定检测限的od450nm＝3*0.6896＝2.0688，检测限＝(2.0688-0.6896)/0.01122＝122.9234ng，因为变异系数cv小于20％，所以检测限也是定量下限，在122.9234ng。如果利用以抗原为横坐标，信噪比s/n为纵坐标的关系图，也发现信噪比s/n大于2.1时对应的抗原在100ng以上时，正好与用方程计算的检测限为122.9234ng相互印证，图8，e的)。

6、基于标记链霉亲和素-生物素(labelledstreptavidinbiotin，lsab)-elisa法与鲁米诺检测系统定量检测hpv16e7蛋白的化学发光免疫分析法的建立

利用间接elisa棋盘实验和直接elisa棋盘实验测定捕获抗体79a11、检测抗体69e2和生物素化检测抗体69e2的效价依次为25ng、0.1953ng和0.78ng。利用双抗夹心棋盘实验发现捕获抗体79a11(igm亚型)在2μg/ml时的信号强于1μg/ml(图9，a)、biotin-69e2浓度从0.2、0.5μg/ml到1μg/ml升高信号逐渐增强到1μg/ml时最强(图9，b)、抗原反应2h的线性关系最好，其判定系数r²＝0.9724、发现封闭剂0.25％bsa、1％bsa和5％脱脂乳的本底od425nm值随时间从0.5h、1h增加到2h都在降低(图9，c)，其对应的阳性信号od425nm值都在增加，其中以0.25％bsa封闭2h的信号最强，(图9，d；图9，e)、抗原在ng级以等比等差法9个点(0、25、50、100、200、400、600、800、1000ng/孔)稀释时，直线拟合和双对数拟合的判定系数r²依次为0.9852和0.9935(图9，f；图9，g；)，都在0.965以上，说明线性关系较理想，信噪比s/n在抗原低浓度25ng及以上均大约2.1，说明是可靠的阳性信号(图9，h)、抗原在μg级以等比等差法9个点(0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10μg/孔)稀释时，直线拟合和双对数拟合的相关性r²依次为0.9678和0.9842，都大于0.965以上，说明抗原在μg级时的线性关系也比较理想(图9，i；图9，j)，信噪比s/n在抗原低浓度0.25μg及以上都大约2.1(图9，k)，说明都是可靠的阳性信号，目前没有找到检测上限。

7、用化学发光免疫分析法制备参考曲线和检测临床标本

以79a11在2ug/ml、0.25％bsa％封闭2h、抗原ng级等比等差稀释法与捕获抗体在37℃反应2h、biotin-69e2和hrp-streptavidin都在1ug/ml等优化条件制备检测标本的参考曲线，直线拟合的回归方程为y＝53.35*x+10294，直线拟合和双对数拟合的判定系数r²依次为0.9666和0.9565(图10，a、图10，b)，说明线性关系较好，变异系数cv(％)在1.5184％～11.9649％，小于20％；以抗原hpv16e7蛋白含量(ng)为横坐标，信噪比s/n为纵坐标的关系图，发现抗原在25ng及以上时信噪比s/n都大于3，如果以信噪比s/n＝3为检测限，可见检测限低于25ng(图10，c)；以抗原hpv16e7蛋白在0和低浓度25ng为横坐标，od425nm为纵坐标获得计算检测限的回归方程y＝363.1*x+3441,判定系数r²＝0.9823(图10，d)，信噪比s/n＝3的od425nm＝3*3441＝10324，检测限＝(10324-3441)/363.1＝18.9562ng，因为变异系数cv(％)都小于20％，这个检测限也是定量下限，与常规的双抗夹心elisa法定量检测hpv16e7蛋白的检测限(也是定量下限)122.9234ng相比，相差6.48倍。

将标本od425nm值带入方程y＝53.35*x+10294得到4个正常宫颈组织hpv16e7蛋白含量和4例hpv52阳性的宫颈癌组织的hpv16e7蛋白含量的平均值，都低于化学发光免疫分析法的定量下限18.9562ng；12例hpv16阳性的宫颈癌hpv16e7蛋白含量波动在102.1743～438.2473ng，其信噪比s/n值都大于3.0，为阳性，与正常组织和hpv52阳性宫颈癌组织相比有显著差异(p＜0.01)(图10，e)。说明本课题建立的化学发光免疫分析法在检测hpv16阳性的宫颈癌组织中的hpv16e7蛋白初步有效。

8、79a11的间接免疫荧光反应

利用免疫荧光技术定位hpv16e7蛋白在hpv16阳性的caski细胞中的表达情况，将稀释程度为1μg/孔，0.5μg/孔，0.25μg/孔，0.125μg/孔，0.0625μg/孔，0.03125μg/孔，0.015625μg/孔，0.0078125μg/孔的一抗与caski细胞进行反应，当一抗稀释程度达到最大，即7.8125ng/孔时，caski细胞的细胞核绿色荧光仍然较明显，即反应灵敏度至少为7.8125ng/孔；而在添加相同浓度的一抗和二抗时，hpv18阳性的hela细胞的细胞核无绿色荧光，少数hela细胞的细胞质有荧光，可能是非特异性反应导致的。基于hpv16e7单克隆抗体79a11的性质，初步建立了hpv16e7蛋白免疫荧光试剂盒，灵敏度至少为7.8125ng/孔(见图11)。

9、单抗79a11与caski和hela细胞的westernblot反应

培养和收集caski和hela细胞，用ripa提取caski和hela细胞中的总蛋白，caski细胞总蛋白中含有hpv16e7蛋白，hela细胞中的总蛋白中含有hpv18e7蛋白，所以先用12％sds-page电泳分离caski和hela细胞中的总蛋白以及一个带有组氨酸标签的其他蛋白c-myc(his-tag-c-myc，分子量62kda)，再将胶转印到nc膜上，然后再用5％脱脂乳封闭nc膜，再将一抗79a11与nc膜上的蛋白反应，加二抗羊抗鼠igg-hrp，曝光后拍照，结果如图12所示。

westernblot反应的结果显示：显示单抗79a11与一个带有组氨酸标签的其他蛋白c-myc(his-tag-c-myc)反应后没有曝光的条带出现，提示单抗79a11与组氨酸标签不发生反应；单抗79a11与caski细胞总蛋白反应出现强的曝光条带，而与hela细胞中的总蛋白反应没有出现强的曝光条带。因为caski细胞总蛋白中含有hpv16e7蛋白，hela细胞中的总蛋白中含有hpv18e7蛋白，所以单抗79a11可以检测到caski细胞总蛋白中的hpv16e7蛋白，单抗79a11可以检测到hela细胞总蛋白中的hpv18e7蛋白，提示79a11在检测hpv16e7蛋白的westernblot中有潜在应用价值。

实施例5、单抗79a11的表位鉴定

1、hpv16e7蛋白步移重叠18肽的合成

明确hpv16e7蛋白的氨基酸序列：在ncbi网站中查到caski細胞株里面的hpv16e7蛋白的氨基酸序列(seguenceid:nc-001526.2)。hpv16e7蛋白全长98个氨基酸，具体氨基酸序列如下：

mhgdtptlheymldlqpettdlycyeqlndsseeedeidgpagqaepdrahynivtfcckcdstlrlcvqsthvdirtledllmgtlgivcpicsqkp。

短肽合成：从1号氨基酸开始一次步移6个氨基酸，设计含18个氨基酸的重叠肽，委托上海强耀公司合成，共15条，纯度大于95％，用dmso溶解合成的重叠肽至1mg/ml的储存浓度，分装后于-80℃保存。

2、单抗79a11的表位鉴定

单抗79a11的表位鉴定结果如图13所示。如图13中a所示：重叠肽的间接elisa法显示单抗79a11与重叠肽hpv16e749-66的反应信号最强(p<0.01)，与重叠肽hpv16e749-66的前后重叠肽hpv16e743-60和hpv16e755-72、hpv16e761-78都有反应，符合重叠肽反应的规律；

因为包被重叠肽的间接elisa中单抗只能筛选到疏水性强的氨基酸的肽段，但会漏掉亲水性抢的氨基酸肽段，所以用间接竞争elisa筛选含亲水性强的氨基酸肽段。如图13中b所示：

用抑制率法判定间接竞争elisa法的结果。抑制率＝(阴性对照bsa的od450nm值-被抑制肽的od450nm值)*100％/阴性对照bsa的od450nm值，抑制率≥50％为阳性，抑制率小于50％为阴性。重叠肽的间接竞争elisa结果显示，当重叠肽在10μmol/l时，4个重叠肽hpv16e749-66、hpv16e767-84、hpv16e773-90和hpv16e785-98被单抗79a11抑制的抑制率依次为40.6667％、91.6533％、94.0533％和91.17％，均为阳性结果，与阴性对照bsa相比有显著差异(p<0.01)。

综合间接elisa和间接竞争elisa结果，可以发现单抗79a11与4个重叠肽段hpv16e767-84、hpv16e773-90和hpv16e785-98、hpv16e749-66都有特异结合，但是具体的表位是哪些氨基酸组成不是很清楚。目前虽然没有检索到hpv16e7蛋白的三维晶体结构，但是hpv16e7蛋白的氨基酸序列与hpv45e7蛋白的氨基酸序列的同源性为46％，hpv45e7蛋白有晶体结构，利用swiss-model同源建模，获得以hpv45蛋白为模型的hpv16e7蛋白的第46-97位氨基酸的三维晶体结构建模图。用pymol(thepymolmoleculargraphicssystem2.2.0)呈现hpv16e7蛋白的三维晶体结构建模图，目前只解析了hpv16e7蛋白的第46-97aa的三维晶体结构建模图，锌结合结构域将hpv16e7蛋白的单体连成二聚体，呈二重旋转对称轴，二级结构主要为α螺旋。用圆二色谱测定获得的hpv16e7蛋白的二级结构的确为α螺旋。

将间接elisa中单抗有反应的肽和间接竞争elisa显示有阳性抑制的肽标示在hpv16e7蛋白的三维晶体结构建模图中，可以发现肽段hpv16e767-72和hpv16e786-90在内部，有3个肽段hpv16e749-66、hpv16e773-85和hpv16e791-97外露、不连续但位置邻近；在晶体模型的内部的肽段不可能为表位，只有外露肽段才能是表位。标示为蓝色的是单抗79a11的有特异结合的肽段部分(图13中c)；因为单抗69e2可以与单抗79a11配对，提示单抗69e2的特异性表位在同一个hpv16e7蛋白二聚体的另一个单体上，用红色标示单抗69e2的特异性表位肽。

实施例6、单抗79a11的特异性表位肽的保守性(广谱性)分析

如图14所示：单抗79a11与抗原hpv16e7蛋白上的4个重叠肽hpv16e749-66、hpv16e767-84、hpv16e773-90和hpv16e785-98都有特异性结合，但是hpv16e767-72和hpv16e786-90位于hpv16e7蛋白的三维晶体结构建模图的内部，hpv16e749-66、hpv16e773-85和hpv16e791-97外露、不连续和位置邻近，所以单抗79a11的特异性表位在这3个外露的肽段(hpv16e749-66、hpv16e773-85和hpv16e791-97)中。用软件mega7.0比对这3个外露的肽段与从ncbi中下载另外下载的30株hpv16毒株中的hpv16e7蛋白的氨基酸，发现这3个外露的肽段(hpv16e749-66、hpv16e773-85和hpv16e791-97)与下载的30株hpv16毒株中的hpv16e7蛋白的氨基酸的同源性很高，说明保守性高，提示这株单抗79a11具有潜在的广谱性应用价值。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>重庆理工大学

<120>抗hpv16e7蛋白单抗79a11、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用

<160>8

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