棉花GhACO基因在促进植物开花中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地，涉及ghaco基因在促进植物开花中的应用。

背景技术：

棉花是重要的经济作物，作为纺织、医药、化工等领域的重要原料，在我国国民经济中占有非常重要的地位。我国人多地少，粮棉争地，为保证粮食安全同时确保棉花种植面积及产量。解决这一矛盾的有效途径——早熟棉育种。早熟棉品种，可以实现黄河和长江流域棉区麦(油菜)后直播；有利于西北内陆棉区实现提质增效，保障国家用棉安全。棉花的早熟性是一个复合性状，花发育与棉花早熟性密切相关，开花时间决定熟性的早晚。

目前有关棉花早熟性相关的基因研究仍然较少，缺乏有效的基因资源可用于棉花早熟品种的遗传工程育种。

技术实现要素：

发明人利用棉花的转录组数据发掘出一个类1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(ghaco基因)，并从陆地棉中克隆了ghaco基因。荧光定量结果表明该基因与棉花花芽发育相关，通过构建该基因的过表达载体，花序侵染法转化拟南芥，结果表明转基因拟南芥抽薹时的莲座叶数目显著减少，开花时间明显提前。因此发明人认为棉花ghaco基因在促进棉花开花方面可能具有关键作用，可以作为短季棉培育的有利基因资源。从而完成本发明。

本发明一方面提供了一种分离的棉花ghaco基因。所述ghaco基因具有seqidno.3所示的核苷酸序列。该基因的开放阅读框为888bp。

在本发明的一些实施方案中，seqidno.3所示的核苷酸序列能够编码seqidno.4所示氨基酸序列。该氨基酸序列包含295个氨基酸，蛋白的相对分子量为33.28kda，等电点为5.11。

本发明另一方面提供了ghaco基因在提高促进植物开花中的应用。

在本发明的一些实施方案中，在植物中提高ghaco基因的表达量，以促进植物开花。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的在植物中提高ghaco基因的表达量是通过如下方法实现：提高植物内源ghaco基因的表达，或在植物中过表达外源ghaco基因。

在本发明的一个具体要求实施方案中所述过表达外源ghaco基因是指将所述ghaco基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中进行表达。

进一步地，所述ghaco基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

更进一步地，所述植物表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述ghaco基因的表达。

再进一步地，所述组成型启动子是35s启动子。

在本发明中，所述促进开花是指促使植物开花期提前。

在本发明中，所述植物是棉花、玉米、水稻、小麦或拟南芥。

本发明的有益效果

本发明通过转基因技术获得的转ghaco基因的拟南芥植株，使得拟南芥抽薹时的莲座叶数目显著减少，开花时间明显提前，表明ghaco基因在促进棉花开花方面可能具有关键作用。本发明为短季棉培育提供了有利的基因资源。

附图说明

图1示出了利用pcr方法从陆地棉盐早2号中扩增出ghaco基因片段的电泳图。marker自下至上四个条带的大小分别代表200bp、500bp、800bp、1200bp。

图2示出了t1代转基因拟南芥株系的pcr检测结果。1-、2-为2个转基因拟南芥株系，每个株系分别挑选了5-6株检测。

图3示出了t3代转基因拟南芥株系的荧光定量鉴定结果。wt为非转基因拟南芥，l1、l2为两个转基因拟南芥株系。

图4示出了t3代转基因拟南芥株系的表型鉴定结果。图中为生长四周的拟南芥，wt为非转基因拟南芥，l1和l2两个转基因拟南芥株系。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

本文中提到的但未列出的各种试剂溶液均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。

本发明用于的材料、试剂与耗材、药品、培养基等如下：

1.植物材料

本实施例选取的实验材料为陆地棉盐早2号，种植在中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室的试验田(河南安阳东场)，管理措施为正常大田管理。

拟南芥材料：野生型拟南芥(哥伦比亚型)，用于后期过表达载体的转化和表型观察。

2.试剂与耗材

2.1酶及试剂盒：(1)限制性内切酶，修饰酶及试剂盒：pcr反应体系、胶回收试剂盒、克隆试剂盒、质粒小题试剂盒购自宝生物工程大连有限公司，dna提取试剂盒购自omega公司。

2.2其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(x-gal)、异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)、氨苄青霉素等购自宝生物工程大连有限公司，大肠杆菌感受态细胞dh5α购自北京天根生化科技公司。

2.3培养基：lb液体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeastextract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l；lb固体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l、酵母提取物(yeastextract)5g/l、氯化钠(nacl)10g/l、琼脂粉(agar)15g/l，定容至1l；lb选择培养基：在lb铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。

2.4主要仪器：：pcr扩增仪(bio-rad)，高速离心机(hettichmikro200r)、电泳设备(bio-rad)、凝胶成像系统(bio-rad)、荧光定量pcr仪(abi7500)。

实施例ghaco的基因序列的克隆

1取样方法

在棉花的盛花期，取成熟的棉花叶片，速冻于液氮，存于-80℃冰箱备用。

2rna的提取

以下所有离心步骤均在室温下进行。

1)匀浆处理：100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入700μlsl(使用前加入β-巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀。

2)12,000rpm离心2min。

3)将上清液转移至过滤柱cs上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase-free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片。

4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱cr3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。

5)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。

6)dnasei工作液：取10μldnasei储存液和70μlrdd溶液轻柔混匀。

7)向cr3中加入80μl的dnasei工作液，室温静止15min。

8)静置完后，向cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。

9)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。

10)重复步骤9。

11)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱cr3放入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到rna溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。rna样品请在-70℃中保存。如果预期rna得率大于30μg，可将步骤11中离心得到的rna溶液再加入吸附柱cr3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到rna溶液。

为预防rnase污染，注意事项：

1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致rnase污染；

2)使用无rnase的塑料制品和枪头避免交叉污染；

3)rna在裂解液sl中时不会被rnase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含rnase的塑料和玻璃器皿。

4)配制溶液应使用rnase-freeddh2o。

3反转录

上述获得的rna样品，参照采用takara的反转录试剂盒(drr037a)的说明书进行具体的操作，其中反转录的反应液的配置在冰上进行，具体操作如下：

反转录反应条件如下：

37℃15min(反转录反应)；

85℃5sec(反转录酶的失活反应)。

最终将500ngrna样品反转录为cdna，并将得到的反转录产物cdna溶液稀释8倍作为pcr反应的模板。

4ghaco基因的扩增：包括引物设计、pcr反应体系、程序和产物检测

1)设计引物

从cottonfgdnauassembly中获取ghaco(gh_a09g0562)的基因序列，利用primer5软件设计ghaco基因的引物；

上游引物f(seqidno.1)：

5'-atggcagaaataagcttagaacg-3'

下游引物r(seqidno.6)：

5'-ttaaggtgggcttgcctgcatca-3'

2)pcr反应体系

在冰上配制以下体系：

根据takaralataqhotstartversion2.0(drr042)酶说明书，pcr反应体系如下：

3)pcr反应程序

10℃延伸--

4)pcr产物的检测

取1μlpcr产物，加入1μl6×loadingbuffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测。

5pcr产物的胶回收

1)在紫外灯下从电泳胶上切下所需回收的条带，注意刀片需消毒，胶块应尽量小，使之易融化完全；

2)事先将一个eppendorf管称重，然后将胶块放入后再次称重，获得胶块的重量；

3)以每100mg胶块加入300μl的量加入bindingbuffer，查看胶块是否浸在液体中；

4)55℃水浴10min以融化胶块释放dna，期间每2-3min需取出震荡；

5)待胶块完全融化后按照每100mg胶块150μl的量加入异丙醇，充分震荡混匀；

6)将highpurefiltertube安装到collectiontube上；

7)将所有eppendorf管中的液体转移到highpurefiltertube中去，注意不要超过700μl，若超过需分两次离心；

8)12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；

9)加入500μlwashbuffer后再次离心1min；

10)倒掉收集管中的液体后再次加200μl的washbuffer，12,000rpm离心1min；

11)小心将filtertube取下后装入一个新的effendorf管上；

12)在滤芯的正中加上30μl的elutionbuffer，室温放置1min，12,000rpm离心1min。

6胶回收产物与克隆载体pmd-18t连接

1)在微量离心管中配制下列dna溶液，全量为5μl。

2)加入5μl(等量)的solutioni；

3)16℃反应30min。

7连接产物转化大肠杆菌

1)向100μl大肠杆菌dh5α感受态中加入10μl连接反应体系；

2)冰浴30min；

3)42℃水浴热激45s；

4)冰浴2min；

5)加入500μllb液体培养基，37℃，190rpm，孵育1h；

6)离心，4,000rpm，1min，弃上层上清，留约100μl混匀后涂布在含氨苄抗性(amp)的lb平板；

7)37℃，恒温培养过夜(12-16h)。

8阳性克隆的检测及测序

1)从转化平板上挑取正常的单个菌落，放入含有amp的液体lb培养基中，37℃恒温摇床培养6-8h；

2)菌落pcr检测阳性克隆，将验证片段大小正确的的单克隆送去生物公司测序。

3)阳性菌液的保存

菌液pcr验证且测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-80℃保存。

结果显示：

(1)利用pcr方法从陆地棉盐早2号中扩增出ghaco基因的片段，发现该基因的片段在800bp以上，结果如图1所示。

(2)获得ghaco基因序列信息

1)通过测序，得到ghaco基因的开放阅读框888bp，序列如下(seqidno.3)：

atggcagaaataagcttagaacgagctcaagaatccattgtcaatcgacaacaggaattgaaagctttcgatgaaacaaaatcaggagtgaaagcgctggtagattcgggcttgtcaaagattccaacgattttcaccgatgaacagtacaagcttgagagaaacaacatcctcaaccagaaacctggaagccccaccaacaatgacggaatcccaatcataaacttgaccggtgtcgacgataatccaaatttacgtcgcgaaatagtgaagaaagttggagaagcttgcgagaaatggggtttctttcaagttatcaaccatgggattccgttggctactacggatgaaatgataaacggggttcgcaggtttcatgaacaggatgacgaagctaagaaagagatttattctcgagattattccaagaaagtgtattataacagtaacatcgatctttacaaggcggaagcaaccaattggagggatactttgtgttgtgttatggcacctcgccaccctcttcctcaagaactgcctgcaatttgcagagatataatgatagaatattcaagcaaaatgatgaaattagggcagactttgttagaattgatgtcggaagccttgggtctgaatcggagttatttggaagatattgggtgcggtgagggaatgtttgtgaaaggccattactatccaccgtgccctgaaccggacttgacattgggcaccagcaggcacaccgataccggcttctgcaccgtaattttacaagatgaaatcggcggacttcaaatcctccatcaaaatcaatggcttgatattaatcctgtccggggagctcttgttgtaaatttgggcgatatgatgcaggcaagcccaccttaa

2)生物信息学分析表明ghaco基因编码295个氨基酸，蛋白的相对分子量为33.28kda，等电点为5.11。

ghaco基因编码的氨基酸序列为(seqidno.4)：

maeisleraqesivnrqqelkafdetksgvkalvdsglskiptiftdeqyklernnilnqkpgsptnndgipiinltgvddnpnlrreivkkvgeacekwgffqvinhgiplattdemingvrrfheqddeakkeiysrdyskkvyynsnidlykaeatnwrdtlccvmaprhplpqelpaicrdimieysskmmklgqtllelmsealglnrsyledigcgegmfvkghyyppcpepdltlgtsrhtdtgfctvilqdeigglqilhqnqwldinpvrgalvvnlgdmmqaspp

实施例2pbi121-ghaco植物表达载体的构建

1带有特定酶切位点的目的基因片段的获得

将克隆到的ghaco基因的cdna序列，分别在起始密码子atg和终止密码子处设计含有适合酶切位点引物。所用酶切位点为xbai(t/ctaga)和smai(ccc/ggg)。

ghaco基因酶切位点引物序列如下：

上游引物f(seqidno.5)：

5'-ctagtctagaatggcagaaataagcttagaacg-3'

下游引物r(seqidno.6)：

5'-tcccccgggttaaggtgggcttgcctgcatca-3'

将扩增获得的带有酶切位点的目的片段连接至pgem-teasy克隆载体，转化dh5α感受态细胞，通过pcr及酶切验证和序列测定筛选出序列没有突变的中介重组子。

2pbi121-ghaco植物表达载体的构建

具体过程如下：

1)将重组子ghaco的克隆载体和pbi121质粒分别用smai和xbai双酶切；

2)电泳，胶回收目的片段和pbi121载体的大片段产物；

3)目的基因片段和pbi121的酶切大片段产物用的t4连接酶连接过夜；

4)连接产物转化大肠杆菌dh5α，37℃培养过夜；

5)挑取单克隆摇菌，测序验证序列的正确性。

实施例3利用农杆菌介导法将重组载体pbi121-ghaco转化拟南芥

1lba4404农杆菌感受态的制备

采用cacl2法感受态细胞的制备，具体过程如下：

1)挑取单菌落接种于4ml含有抗生素的lb液体培养基中，28℃，190rpm培养过夜；

2)以1：90的比例转接于80ml含抗生素的lb液体培养基中，28℃，170rpm培养至od600＝0.6；

3)将菌液冰浴30min后，转入50ml离心管，4℃，5,000rpm，离心10min，弃上清；

4)加入5ml预冷的70mmcacl2，轻轻悬浮，冰上静置20min，4℃，5,000rpm，离心5min，弃上清；

5)加入2ml预冷的含15％甘油的70mmcacl2，重悬沉淀；

6)悬浮液分装于无菌离心管中，每管200μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。

2转化农杆菌

利用冻融法转化根癌农杆菌lba4404感受态细胞，具体转化过程如下：

1)根癌农杆菌lba4404感受态细胞100μl中加入质粒1μg，混匀后冰浴30min；

2)液氮速冻75s，37℃热激2～6min；

3)冰浴5min，再加入600μllb液体培养基；

4)190rpm，28℃，培养4h后取100μl菌液涂在含有卡那霉素、链霉素和利福平的lb筛选培养基上，28℃培养大约36～48h，抗性菌落可见；

5)挑选阳性克隆，在lb液体培养基上28度培养48h，将阳性克隆的菌液加入一定的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-80℃保存备用。

3农杆菌介导的拟南芥的转化

采取花序浸染法转化拟南芥，具体操作如下：

1)将-80℃保存的农杆菌菌液20μl接种到1mllb液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养过夜；

2)取活化菌液200μl加入到50mllb液体培养基28℃、180rpm振荡培养；

3)待菌液od值约为1.2时，离心菌液4,000rpm，5min，收集菌体；

4)转化介质的配制，配方为：1/2ms(大量元素减半，其他不变)、5％蔗糖，0.01μg/ml苄氨基嘌呤(bap)，0.03％silwetl-77，20mg/l乙酰丁香酮，koh调ph值至5.7。

5)用上述转化介质悬浮菌体，调od至0.8开始浸染；

6)将拟南芥花序置于转化介质中30-50sec，浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养一天后置于正常条件下培养。

收获成熟的转基因拟南芥种子，为t0代种子。

4转基因拟南芥植株的鉴定

(1)转基因拟南芥株系鉴定

1)将收获的t0代种子消毒后种植在含卡那霉素(kan)的1/2ms上，后在4℃低温处理3天，转移到人工气候试验箱中，10天左右会阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄，不再生长；

2)将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取dna用pcr进行检测，检测时所用引物为：

上游引物f(seqidno.7)：

5'-atggagatctcagtggagaaga-3'

下游引物r(seqidno.8)：

5'-ggccatcaaactccataaccaa-3'

3)每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至t3代，获得纯合转基因拟南芥株系；

t3代株系的表达量的鉴定

荧光定量(qrt-pcr)验证的过程如下：

提取rna，反转录成cdna，分别设计ghaco基因和拟南芥内参基因ubq10荧光定量的引物：

ghaco

上游引物(seqidno.9)：5'-tgaaagcgctggtagattcggg-3'

下游引物(seqidno.10)：5'-tcattgttggtggggcttccag-3'

atubq1

上游引物(seqidno.11)：5'-agatccaggacaaggaaggtattc-3'

下游引物(seqidno.12)：5'-cgcaggaccaagtgaagagtag-3'

冰上配制qrt-pcr反应体系，进行荧光定量pcr反应。

pcr反应体系为：

pcr反应程序：

融解曲线分析

结果显示：

(1)t1代转基因拟南芥株系的pcr检测结果

通过提取t1代转基因拟南芥不同株系的dna，利用特异引物进行pcr扩增，共鉴定出多个阳性株系，这里我们选择2个阳性株系，pcr鉴定结果如图2所示。

(2)t3代转基因拟南芥株系的荧光定量鉴定结果

通过提取t3代转基因拟南芥株系的rna，反转录后利用ghaco基因的特异的荧光定量引物，进行荧光定量，结果表明转基因株系相对对照(wt)，ghaco基因的表达量有显著的升高(图3)。

(3)t3代转基因拟南芥株系的表型鉴定和统计

将转基因t3代植株与非转基因植株同等条件下种植栽培，观察整个拟南芥株型表型的变化，发现转基因拟南芥抽薹时莲座叶数都比野生型不同程度的减少(表1)，开花时间明显提前(图4)。

表1抽薹时莲座叶数

注：wt为非转基因拟南芥，**p<0.01，***p<0.001

以上结果也证实，ghaco基因在促进棉花开花方面可能具有关键作用，可以作为短季棉培育的有利基因资源。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所，山东众力棉业科技有限公司

<120>棉花ghaco基因在促进植物开花中的应用

<130>xy-2019-1-w-087

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggcagaaataagcttagaacg23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttaaggtgggcttgcctgcatca23

<210>3

<211>888

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atggcagaaataagcttagaacgagctcaagaatccattgtcaatcgacaacaggaattg60

aaagctttcgatgaaacaaaatcaggagtgaaagcgctggtagattcgggcttgtcaaag120

attccaacgattttcaccgatgaacagtacaagcttgagagaaacaacatcctcaaccag180

aaacctggaagccccaccaacaatgacggaatcccaatcataaacttgaccggtgtcgac240

gataatccaaatttacgtcgcgaaatagtgaagaaagttggagaagcttgcgagaaatgg300

ggtttctttcaagttatcaaccatgggattccgttggctactacggatgaaatgataaac360

ggggttcgcaggtttcatgaacaggatgacgaagctaagaaagagatttattctcgagat420

tattccaagaaagtgtattataacagtaacatcgatctttacaaggcggaagcaaccaat480

tggagggatactttgtgttgtgttatggcacctcgccaccctcttcctcaagaactgcct540

gcaatttgcagagatataatgatagaatattcaagcaaaatgatgaaattagggcagact600

ttgttagaattgatgtcggaagccttgggtctgaatcggagttatttggaagatattggg660

tgcggtgagggaatgtttgtgaaaggccattactatccaccgtgccctgaaccggacttg720

acattgggcaccagcaggcacaccgataccggcttctgcaccgtaattttacaagatgaa780

atcggcggacttcaaatcctccatcaaaatcaatggcttgatattaatcctgtccgggga840

gctcttgttgtaaatttgggcgatatgatgcaggcaagcccaccttaa888

<210>4

<211>295

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

metalagluileserleugluargalaglngluserilevalasnarg

151015

glnglngluleulysalapheaspgluthrlysserglyvallysala

202530

leuvalaspserglyleuserlysileprothrilephethraspglu

354045

glntyrlysleugluargasnasnileleuasnglnlysproglyser

505560

prothrasnasnaspglyileproileileasnleuthrglyvalasp

65707580

aspasnproasnleuargarggluilevallyslysvalglygluala

859095

cysglulystrpglyphepheglnvalileasnhisglyileproleu

100105110

alathrthraspglumetileasnglyvalargargphehisglugln

115120125

aspaspglualalyslysgluiletyrserargasptyrserlyslys

130135140

valtyrtyrasnserasnileaspleutyrlysalaglualathrasn

145150155160

trpargaspthrleucyscysvalmetalaproarghisproleupro

165170175

glngluleuproalailecysargaspilemetileglutyrserser

180185190

lysmetmetlysleuglyglnthrleuleugluleumetsergluala

195200205

leuglyleuasnargsertyrleugluaspileglycysglyglugly

210215220

metphevallysglyhistyrtyrproprocysprogluproaspleu

225230235240

thrleuglythrserarghisthraspthrglyphecysthrvalile

245250255

leuglnaspgluileglyglyleuglnileleuhisglnasnglntrp

260265270

leuaspileasnprovalargglyalaleuvalvalasnleuglyasp

275280285

metmetglnalaserpropro

290295

<210>5

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ctagtctagaatggcagaaataagcttagaacg33

<210>6

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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