本发明涉及生物疫苗领域，具体涉及一种猪乙型脑炎疫苗抗原规模培养方法。
背景技术：
：猪乙型脑炎病毒(japaneseencephalitisvirus,jev)可引起乙型脑炎疾病，乙型脑炎是一种经蚊虫传播的人畜共患病，是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。猪是猪乙型脑炎病毒的重要储存宿主和扩增宿主，是乙型脑炎的主要传染源。猪乙型脑炎病毒是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，目前主要通过免疫接种的方式来预防。猪乙型脑炎病毒可在多种组织培养细胞内增殖，其中bhk-21、vero及c6/36等细胞敏感性较高，可用于jev的培养。jev在bhk-21、vero细胞等细胞中生长可导致细胞发生病变，导致细胞死亡。常规培养方法培养jev病毒接种一次只能收获一次病毒，成本较高。技术实现要素：本发明的目的是提供一种适宜规模化生产的猪乙型脑炎疫苗抗原培养工艺。第一方面，本发明保护一种猪乙型脑炎疫苗抗原培养方法，包括如下步骤：(1)将猪乙型脑炎病毒接种于pk-15细胞，接种的病毒量为0.4～10moi；(2)完成步骤(1)后，继续培养细胞48h后开始连续收获病毒；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。所述方法中，接种的病毒量具体可为0.6～3moi。进一步地，接种的病毒量具体可为0.6～1moi。示例性地，所述病毒量具体为1moi或0.6moi。所述方法中，具体在继续培养细胞的第48h至192h期间连续收获病毒，每次收获病毒间隔24h或48h或72h；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。在本发明的实施例中，最佳方法为分别在继续培养细胞的第48h、96h、120h、144h、168h和192h收获病毒；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。示例性地，收毒方法还可为在继续培养细胞的第48h、96h、144h和192h收获病毒；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。示例性地，收毒方法还可为在继续培养细胞的第48h和120h收获病毒；每次收获方式如下：收集细胞培养液，从细胞培养液中获得病毒，并且添加新的细胞培养液继续培养细胞直至下次收获病毒。所述方法中，所述病毒可以通过病毒液的形式接种至pk-15细胞；所述病毒液具体可采用含有体积百分含量0％-2％小牛血清的细胞培养液配置。其中采用含有体积百分含量2％小牛血清的细胞培养液配置为佳。所述病毒液的浓度具体可为2.5×105.8～8×106.8tcid50/ml。进一步地，所述病毒液的浓度具体可为5×105.8tcid50/ml～2×106.8tcid50/ml。示例性地，所述病毒液的浓度为5×105.8tcid50/ml。所述方法中，将病毒接种于细胞后吸附1h，然后添加含有体积百分含量2％小牛血清的细胞培养液继续培养至收获病毒。添加含有体积百分含量2％小牛血清的细胞培养液前，可弃去病毒液，也可不弃去病毒液。其中，不弃去病毒液为佳。以上任一所述细胞培养液具体可为dmem细胞培养液。所述方法中，所述从细胞培养液中获得病毒的方式具体可为将收集的细胞培养液在-20℃反复冻融一次，然后离心取上清液(病毒液)。第二方面，本发明保护前文所述方法在规模化生产猪乙型脑炎疫苗中的应用。以上任一所述猪乙型脑炎病毒具体可为猪乙型脑炎病毒jev-sc-1株。本发明提供了一种猪乙型脑炎疫苗抗原大规模培养工艺，使用猪肾细胞pk-15细胞培养猪乙型脑炎病毒，病毒接种一次可以连续收获多个批次的病毒，且病毒效价与bhk-21、vero细胞相当或高于现有培养工艺，极大的提高了病毒产量，是一种适宜规模化生产的猪乙型脑炎疫苗大规模培养技术。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pk-15细胞：中国兽医药品监察所。bhk-21细胞：中国兽医药品监察所。vero细胞：中国兽医药品监察所。猪乙型脑炎病毒jev-sc-1株：记载于文献：蔡雨函,周远成,朱玲,王赟,徐志文.3株猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及增值特性[j].中国兽医学报,2014,34(06):915-922.；公众可以从畜科生物工程有限公司获得。dmem培养基、0.25％胰酶、小牛血清均购买自thermofisher公司。本发明中猪乙型脑炎病毒(jev)的病毒效价(tcid50)测定方式如下：将病毒液用含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基进行10倍系列稀释，选择四个适宜稀释度分别接种至已长成良好单层的bhk-21细胞的96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，100ul/孔，于37℃含5％co2条件下培养4～5天，按reed-muench法计算tcid50。本发明中的moi为接种的病毒tcid50和细胞数量的比值。实施例1、jev培养工艺的建立一、最佳接种量的确定方法1：(1)将pk-15细胞接种于10cm培养皿中，加入含有10％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养至细胞形成致密单层(细胞数量约为5×106个)；(2)完成步骤(1)后，选择细胞生长良好的10cm培养皿，弃去细胞培养基；(3)完成步骤(2)后，按1ml病毒液/皿的量加入猪乙型脑炎病毒液(病毒液是将病毒原液采用不含小牛血清的dmem培养液稀释得到的)，接种的病毒量为2.5×105.8～8×106.8tcid50(约0.4～10moi)；接种后置于37℃、5％co2培养箱中吸附1h；(4)完成步骤(3)后，弃去病毒液，重新加入含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基10ml，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养5天，5天后收获细胞培养液，-20℃反复冻融一次，然后12000rpm/min离心10min，收集上清液(病毒液)。方法2：与方法1的差别在于：步骤(3)中，采用含2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基稀释病毒原液制备病毒液；步骤(4)中，完成步骤(3)后直接加入10ml含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基，加入前不弃去病毒液。方法1和方法2中每次收获的病毒液约为10ml/皿。测定方法1和方法2收获的病毒液的tcid50，结果如表1所示。表1接种剂量对jevtcid50的影响结果显示，当采用方法2进行病毒培养，接种病毒的量为5×105.8tcid50/皿～2×106.8tcid50/皿时(即moi约为0.6～3时)，收获的病毒液效价相对较高。二、最佳收毒方式的确定方法3：(1)将pk-15细胞接种于10cm培养皿中，加入含有10％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养至细胞形成致密单层(细胞数量约为5×106个)；(2)完成步骤(1)后，选择细胞生长良好的10cm培养皿，弃去细胞培养基；(3)完成步骤(2)后，按1ml病毒液/皿的量加入猪乙型脑炎病毒液(病毒液是将病毒原液采用含2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养液稀释得到的)，接种的病毒量为5×105.8tcid50(约0.6moi)；接种后置于37℃、5％co2培养箱中吸附1h；(4)完成步骤(3)后，直接向培养皿加入含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基10ml，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养，每间隔2天，即在培养2天(48h)后、4天(96h)后、6天(144h)后和8天(192h)后收获细胞培养液上清，同时向培养皿中添加新的含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基继续培养，收获的细胞培养液-20℃反复冻融一次，然后12000rpm/min离心10min，收集上清液(病毒液)。方法4：与方法3的区别在于：步骤(4)中，继续培养直接向培养皿加入含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基10ml，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养，在培养2天(48h)后、4天(96h)后、5天(120h)后、6天(144h)后、7天(168h)后和8天(192h)后收获细胞培养液，同时向培养皿中添加新的含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基继续培养，收获的细胞培养液-20℃反复冻融一次，然后12000rpm/min离心10min，收集上清液(病毒液)。方法5：与方法3的区别在于：步骤(4)中，继续培养直接向培养皿加入含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基10ml，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养，在培养2天(48h)后和5天(120h)后收获细胞培养液，同时向培养皿中添加新的含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基继续培养，收获的细胞培养液-20℃反复冻融一次，然后12000rpm/min离心10min，收集上清液(病毒液)。方法3、4、5中每次收获的病毒液约为10ml/皿。测定方法3、4、5收获的病毒液的tcid50，结果如表2所示。表2不同收毒情况下jevtcid50测定结果结果显示，采用方法4的培养模式可以获得更多高效价的病毒液。三、最佳工艺方法的确定分别采用pk-15细胞、vero细胞进行如下实验：(1)将细胞接种于15l转瓶中，加入含有10％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基，置于转瓶培养箱中，37℃，10转/min培养至细胞形成致密单层(细胞数量约为2×108个)；(2)完成步骤(1)后，选择三个细胞生长良好的15l转瓶，弃去细胞培养基；(3)完成步骤(2)后，按100ml病毒液/瓶的量加入猪乙型脑炎病毒液(病毒液是将病毒原液采用含2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养液稀释得到的)，接种的病毒量为5×107.8tcid50(约1moi)；接种后置于转瓶培养箱中，37℃、8转/min吸附1小时；(4)完成步骤(3)后，每个转瓶添加1500ml含2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基并置于转瓶培养箱中37℃、10转/min培养，在培养2天(48h)后、4天(96h)后、5天(120h)后、6天(144h)后、7天(168h)后和8天(192h)后收获细胞培养液，同时向转瓶中添加1500ml新的含有2％(体积百分含量)小牛血清的dmem培养基并置于转瓶培养箱中37℃、10转/min继续培养，收获的细胞培养液转入无菌转瓶中，-20℃反复冻融一次，然后8000rpm/min离心10min，收集上清液(病毒液)。测定收获的所有批次病毒液的病毒含量。结果见表3所示。表3最佳培养工艺转瓶培养结果统计工艺48h96h120h144h168h192h收获病毒总量pk15细胞培养工艺108.4108.5108.11108.0107.89107.54.07×1012常规vero细胞培养工艺108.0106.5103.0---4.64×1011注：表3中，48h～192h的数据为每个批次三个转瓶单独收获病毒液后测定病毒浓度并取平均值，单位为tcid50/ml；收获病毒总量的数据为三个转瓶所有批次收获的病毒总量，单位为tcid50。表3结果显示，两种培养工艺相比，均使用三个转瓶培时，pk15细胞培养工艺最终可收获病毒4.07×1012tcid50，而常规vero细胞培养工艺只能获得4.64×1011tcid50的病毒，pk15细胞培养工艺较传统的vero细胞培养工艺病毒产量提高了约8.8倍。当前第1页12