增强植物免疫效应的方法及其用途

1.本发明涉及植物对病原微生物的免疫领域，尤其涉及增强植物免疫效应的方法。


背景技术：

2.自然界中，植物已经进化出两层先天免疫系统来对抗病原微生物的入侵，第一层免疫是由位于细胞膜上的模式识别受体prrs(pattern-recognition receptors)通过识别病原微生物上保守的病原相关分子模式pamps(pathogen associated molecular patterns)进而触发的植物免疫，称为模式触发免疫(pattern triggered immunity，pti)。已证明pti在植物抗病免疫系统发挥着十分重要的作用。尽管植物pti成功抵挡了大部分病原微生物，然而少数病原微生物则进化出相应的对策来突破pti防线：向寄主植物细胞注入毒性蛋白或者叫效应因子(effectors)来抑制植物的pti。一些效应因子在植物体内造成扰动，直接或间接地被植物细胞的抗病蛋白识别，从而启动植物抵抗外来微生物入侵的另外一层免疫：效应因子触发免疫(effector-triggered immunity，eti)。eti由位于胞内的nlr蛋白(nucleotide-binding,leucine-rich repeat proteins)特异识别病原菌的效应因子从而介导的植物免疫。
3.之前的研究中，人们认为pti和eti是两种不同的免疫信号通路。在植物抗病领域，植物的两个基础免疫信号通路pti和eti之间的关系是领域内的一个重要的但尚未解决的科学问题。前期的研究表明，pti和eti的免疫激活是由不同亚细胞定位的不同受体识别特定的信号，然后通过不同的激活机制来介导的。然而，pti和eti信号却拥有众多相似的下游免疫信号的输出，其中包括防御基因的表达、活性氧(ros)的产生和胼胝质的沉积。本领域尚未解析出pti和eti信号通路之间是否存在关联以及如何相互协调植物免疫输出，因此对于pti联合eti增强植物抗病性的方法存在空白。


技术实现要素：

4.本发明发现pti通路和eti通路中的关联因子，提供使植物更加抗病的试剂和方法。
5.本发明第一方面提供一种增强植物或植物细胞的eti效应的方法，所述方法包括增强所述植物或植物细胞的pti效应，优选所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
6.(1)使用诱导pti的试剂处理细胞。
7.(2)上调增强pti效应的蛋白的表达或活性，
8.(3)下调抑制pti效应的蛋白的表达或活性。
9.在一个或多个实施方案中，所述方法包括使植物或植物细胞接触选自以下一种或任意多种试剂的组合：
10.(1)诱导pti的试剂，
11.(2)上调增强pti效应的蛋白的表达或活性的试剂，
12.(3)下调抑制pti效应的蛋白的表达或活性的试剂。
13.在一个或多个实施方案中，诱导pti的试剂为来自细菌鞭毛蛋白的flg22、伸长因子elf18、真菌的几丁质等。
14.在一个或多个实施方案中，几丁质是β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-d-葡聚糖，化学式为(c8h13o5n)
n
。
15.在一个或多个实施方案中，flg22的氨基酸序列如seq id no:19所示。
16.在一个或多个实施方案中，elf18的氨基酸序列如seq id no:20所示。
17.在一个或多个实施方案中，所述上调增强pti效应的蛋白的表达或活性包括以下的一个或多个步骤：
18.(1)上调rbohd的表达或活性，
19.(2)上调prr受体的表达或活性，
20.(3)上调prr共受体的表达或活性，
21.(4)上调bik1或其同源物的表达或活性。
22.在一个或多个实施方案中，所述方法包括使植物接触选自以下一种或任意多种试剂的组合：
23.(1)上调rbohd的表达或活性的试剂；
24.(2)上调prr受体的表达或活性的试剂；
25.(3)上调prr共受体的表达或活性的试剂，
26.(4)上调bik1或其同源物的表达或活性。
27.在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、抗体、碳水化合物、脂类或小分子化合物。
28.在一个或多个实施方案中，上调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物表达的试剂为
29.(1)增强相应基因转录活性的试剂；
30.(2)提高相应基因转录水平的试剂；
31.(3)抑制相应基因mrna降解的试剂；
32.(4)促进相应基因mrna翻译的试剂；或
33.(5)含相应基因的表达载体和/或整合载体。
34.在一个或多个实施方案中，所述上调rbohd表达的试剂为rbohd的表达载体。
35.在一个或多个实施方案中，所述上调prr受体表达的试剂为prr受体的表达载体。
36.在一个或多个实施方案中，所述上调prr共受体表达的试剂为prr共受体的表达载体。
37.在一个或多个实施方案中，所述上调bik1或其同源物的表达的试剂为bik1或其同源物的表达载体。
38.在一个或多个实施方案中，bik1的同源物是osrlck185、osrlck176。
39.在一个或多个实施方案中，所述prr受体选自fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、oscebip、oslyp4/6、fls3或core，优选fls2或oscebip或fls3。
40.在一个或多个实施方案中，所述prr共受体选自bak1、bkk1、cerk1或oscerk1，优选bak1或cerk1。
41.本发明还提供一种减弱植物或植物细胞的eti效应的方法，所述方法包括减弱所
述植物或植物细胞的pti效应，优选所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
42.(1)使用抑制pti的试剂处理植物或植物细胞，
43.(2)下调增强pti效应的蛋白的表达或活性，
44.(3)上调抑制pti效应的蛋白的表达或活性。
45.在一个或多个实施方案中，所述方法包括使植物或植物细胞接触选自以下一种或任意多种试剂的组合：
46.(1)抑制pti的试剂，
47.(2)下调增强pti效应的蛋白的表达或活性的试剂，
48.(3)上调抑制pti效应的蛋白的表达或活性的试剂。
49.在一个或多个实施方案中，所述下调增强pti效应的蛋白的表达或活性包括选自以下的一个或任意多个步骤的组合：
50.(1)下调rbohd的表达或活性，
51.(2)下调prr受体的表达或活性，
52.(3)下调prr共受体的表达或活性，
53.(4)下调bik1或其同源物的表达或活性。
54.在一个或多个实施方案中，所述方法包括使植物接触选自以下一种或任意多种试剂的组合：
55.(1)下调rbohd的表达或活性的试剂；
56.(2)下调prr受体的表达或活性的试剂；
57.(3)下调prr共受体的表达或活性的试剂；和
58.(4)下调bik1或其同源物的表达或活性的试剂。
59.在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、抗体、碳水化合物、脂类或小分子化合物。
60.在一个或多个实施方案中，下调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的表达包括：
61.(1)抑制对应基因转录活性；
62.(2)下调相应基因转录水平；
63.(3)促进相应基因mrna降解；
64.(4)抑制相应基因mrna翻译；
65.(5)在细胞中引入特异性识别相应基因的导向核酸并进行剪切以降低其表达水平；和
66.(6)敲除或敲减基因组中的基因。
67.在一个或多个实施方案中，下调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的活性包括：
68.(1)上调促进rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物降解的e3泛素连接酶的表达；或
69.(2)上调抑制rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物活性的激酶或磷酸酶的表达。
70.在一个或多个实施方案中，所述e3泛素连接酶选自fls2的e3泛素连接酶pub12或
pub13、或bik1的e3泛素连接酶pub25或pub26。
71.在一个或多个实施方案中，所述抑制rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物活性的激酶或磷酸酶选自cpk28、kapp、pp2a及pp2c38。
72.在一个或多个实施方案中，下调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的活性的试剂包括：促进rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物降解的e3泛素连接酶的表达载体或抑制rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物活性的激酶或磷酸酶的表达载体
73.在一个或多个实施方案中，所述下调rbohd表达的试剂为rbohd的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的rbohd的核酸，例如sirna或shrna。
74.在一个或多个实施方案中，所述下调prr受体表达的试剂为prr受体的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的prr受体的核酸，例如sirna或shrna。
75.在一个或多个实施方案中，所述下调prr共受体表达的试剂为prr共受体的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的prr共受体的核酸，例如sirna或shrna。
76.在一个或多个实施方案中，所述下调bik1或其同源物表达的试剂为bik1或其同源物的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的bik1或其同源物的核酸，例如sirna或shrna。
77.在一个或多个实施方案中，bik1的同源物是osrlck185、osrlck176。
78.在一个或多个实施方案中，所述prr受体选自fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、oscebip、oslyp4/6、fls3或core，优选fls2或oscebip或fls3。
79.在一个或多个实施方案中，所述prr共受体选自bak1、bkk1、cerk1或oscerk1，优选bak1或cerk1。
80.本发明还提供一种提高植物eti效应的活性氧ros产生的方法，所述方法包括增强所述植物或植物细胞的pti效应，优选所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
81.(1)使用诱导pti的试剂处理细胞，
82.(2)上调增强pti效应的蛋白的表达或活性，
83.(3)下调抑制pti效应的蛋白的表达或活性。
84.在一个或多个实施方案中，所述方法包括使植物接触选自以下一种或任意多种试剂的组合：
85.(1)诱导pti的试剂，
86.(2)上调增强pti效应的蛋白的表达或活性的试剂，
87.(3)下调抑制pti效应的蛋白的表达或活性的试剂。
88.在一个或多个实施方案中，所述上调增强pti效应的蛋白的表达或活性包括以下的一个或多个步骤：
89.(1)上调rbohd的表达或活性，
90.(2)上调prr受体的表达或活性，
91.(3)上调prr共受体的表达或活性，
92.(4)上调bik1或其同源物的表达或活性。
93.在一个或多个实施方案中，所述方法包括使植物接触选自以下一种或任意多种试剂的组合：
94.(1)上调rbohd的表达或活性的试剂；
95.(2)上调prr受体的表达或活性的试剂；
96.(3)上调prr共受体的表达或活性的试剂；和
97.(4)上调bik1或其同源物的表达或活性的试剂。
98.在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、抗体、碳水化合物、脂类或小分子化合物。
99.在一个或多个实施方案中，上调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的表达的试剂为
100.(1)增强相应基因转录活性的试剂；
101.(2)提高相应基因转录水平的试剂；
102.(3)抑制相应基因mrna降解的试剂；
103.(4)促进相应基因mrna翻译的试剂；或
104.(5)含相应基因的表达载体和/或整合载体。
105.在一个或多个实施方案中，所述上调rbohd表达的试剂为rbohd的表达载体。
106.在一个或多个实施方案中，所述上调prr受体表达的试剂为prr受体的表达载体。
107.在一个或多个实施方案中，所述上调prr共受体表达的试剂为prr共受体的表达载体。
108.在一个或多个实施方案中，所述上调bik1或其同源物表达的试剂为bik1或其同源物的表达载体。
109.在一个或多个实施方案中，bik1的同源物是osrlck185、osrlck176。
110.在一个或多个实施方案中，所述prr受体选自fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、oscebip、oslyp4/6、fls3或core，优选fls2或oscebip或fls3。
111.在一个或多个实施方案中，所述prr共受体选自bak1、bkk1、cerk1或oscerk1，优选bak1或cerk1。
112.本发明还提供一种植物、其部分或其细胞，其特征在于，所述植物、部分或细胞过表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种，和/或所述植物、部分或细胞包含表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种的载体。
113.在一个或多个实施方案中，bik1的同源物是osrlck185、osrlck176。
114.在一个或多个实施方案中，所述prr受体选自fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、oscebip、oslyp4/6、fls3或core，优选fls2或oscebip或fls3。
115.在一个或多个实施方案中，所述prr共受体选自bak1、bkk1、cerk1或oscerk1，优选bak1或cerk1。
116.在一个或多个实施方案中，所述植物选自拟南芥、番茄、马铃薯、甘蓝、烟草、黄瓜、芥花、菜苔、油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿、高粱。
117.所述植物、其部分或其细胞还具有本发明第一方面所述的特征。
118.本发明还提供一种产品，其特征在于，所述产品包含植物、其部分或其细胞或由植物、其部分或其细胞制备，所述植物、部分或细胞过表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种，和/或所述植物、部分或细胞包含表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种的载体。
119.在一个或多个实施方案中，所述植物产品是食品原料，所述食品原料包含所述植物、其部分或其细胞，或由所述植物、其部分或其细胞制备，或所述植物产品是食品，所述食品包含所述植物、其部分或其细胞，或由所述植物、其部分或其细胞制备，或由所述食品原料制备。
120.在一个或多个实施方案中，bik1的同源物是osrlck185、osrlck176。
121.在一个或多个实施方案中，所述prr受体选自fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、oscebip、oslyp4/6、fls3或core，优选fls2或oscebip或fls3。
122.在一个或多个实施方案中，所述prr共受体选自bak1、bkk1、cerk1或oscerk1，优选bak1或cerk1。
123.在一个或多个实施方案中，所述植物选自拟南芥、番茄、马铃薯、甘蓝、烟草、黄瓜、芥花、菜苔、油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿、高粱。
124.所述产品还具有本发明第一方面所述的特征。
125.本发明还提供一种生产食品原料或食品的方法，包括(1)获得包含植物、其部分或其细胞，所述植物、其部分或其细胞过表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种，和/或所述植物、其部分或其细胞包含表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种的载体，和(2)由所述植物、其部分或其细胞生产所述食品原料或食品。
126.在一个或多个实施方案中，bik1的同源物是osrlck185、osrlck176。
127.在一个或多个实施方案中，所述prr受体选自fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、oscebip、oslyp4/6、fls3或core，优选fls2或oscebip或fls3。
128.在一个或多个实施方案中，所述prr共受体选自bak1、bkk1、cerk1或oscerk1，优选bak1或cerk1。
129.在一个或多个实施方案中，所述植物选自拟南芥、番茄、马铃薯、甘蓝、烟草、黄瓜、芥花、菜苔、油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿、高粱。
130.所述方法还具有本发明第一方面所述的特征。
131.本发明还提供一种降低植物eti效应的活性氧ros产生的方法，所述方法包括减弱所述植物或植物细胞的pti效应，优选所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
132.(1)使用抑制pti的试剂处理植物或植物细胞，
133.(2)下调增强pti效应的蛋白的表达或活性，
134.(3)上调抑制pti效应的蛋白的表达或活性。
135.在一个或多个实施方案中，所述方法包括使植物或植物细胞接触选自以下一种或任意多种试剂的组合：
136.(1)抑制pti的试剂，
137.(2)下调增强pti效应的蛋白的表达或活性的试剂，
138.(3)上调抑制pti效应的蛋白的表达或活性的试剂。
139.在一个或多个实施方案中，所述下调增强pti效应的蛋白的表达或活性包括选自以下的一个或任意多个步骤的组合：
140.(1)下调rbohd的表达或活性，
141.(2)下调prr受体的表达或活性，
142.(3)下调prr共受体的表达或活性，
143.(4)下调bik1或其同源物的表达或活性。
144.在一个或多个实施方案中，所述方法包括使植物接触选自以下一种或任意多种试剂的组合：
145.(1)下调rbohd的表达或活性的试剂；
146.(2)下调prr受体的表达或活性的试剂；
147.(3)下调prr共受体的表达或活性的试剂；和
148.(4)下调bik1或其同源物的表达或活性的试剂。
149.在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、抗体、碳水化合物、脂类或小分子化合物。
150.在一个或多个实施方案中，下调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的表达包括：
151.(1)抑制相应基因转录活性；
152.(2)下调相应基因转录水平；
153.(3)促进相应基因mrna降解；
154.(4)抑制相应基因mrna翻译；
155.(5)在细胞中引入特异性识别相应基因的导向核酸并进行剪切以降低其表达水平；和
156.(6)敲除或敲减基因组中的基因。
157.在一个或多个实施方案中，下调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的活性包括：
158.(1)上调促进rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物降解的e3泛素连接酶的表达；或
159.(2)上调抑制rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物活性的激酶或磷酸酶的表达。
160.在一个或多个实施方案中，下调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的活性的试剂包括：促进rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物降解的e3泛素连接酶的表达载体或抑制rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物活性的激酶或磷酸酶的表达载体。
161.在一个或多个实施方案中，所述e3泛素连接酶选自fls2的e3泛素连接酶pub12或pub13、或bik1的e3泛素连接酶pub25或pub26。
162.在一个或多个实施方案中，所述抑制rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物活性的激酶或磷酸酶选自cpk28、kapp、pp2a及pp2c38。
163.在一个或多个实施方案中，所述下调rbohd表达的试剂为rbohd的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的rbohd的核酸，例如sirna或shrna。
164.在一个或多个实施方案中，所述下调prr受体表达的试剂为prr受体的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的prr受体的核酸，例如sirna或shrna。
165.在一个或多个实施方案中，所述下调prr共受体表达的试剂为prr共受体的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的prr共受体的核酸，例如sirna或shrna。
166.在一个或多个实施方案中，所述下调bik1或其同源物表达的试剂为bik1或其同源物的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的bik1或其同源物的核酸，例如sirna或shrna。
167.在一个或多个实施方案中，bik1的同源物是osrlck185、osrlck176。
168.在一个或多个实施方案中，所述prr受体选自fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、oscebip、oslyp4/6、fls3或core，优选fls2或oscebip或fls3。
169.在一个或多个实施方案中，所述prr共受体选自bak1、bkk1、cerk1或oscerk1，优选bak1或cerk1。
170.一种增加植物或植物细胞的bak1、bik1或其同源物、mpk3、rbohd基因表达或活性的方法，包括增强所述植物或植物细胞的eti效应，优选所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
171.(1)在植物或植物细胞中表达eti诱导剂，
172.(2)上调增强eti效应的基因的表达或活性，
173.(3)下调抑制eti效应的基因的表达或活性。
174.在一个或多个实施方案中，所述eti诱导剂选自avrrpt2、avrpphb、avrrps4、受诱导型启动子调控的nlr蛋白(例如rpm1的突变版本rpm1-d505v)，或其它能够诱导eti的效应因子。
175.一种增强植物或植物细胞的pti效应或减弱或防止植物或植物细胞的pti效应受到抑制的方法，包括增强所述植物或植物细胞的eti效应，优选所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
176.(1)在植物或植物细胞中表达eti诱导剂，
177.(2)上调增强eti效应的基因的表达或活性，
178.(3)下调抑制eti效应的基因的表达或活性。
179.在一个或多个实施方案中，所述的pti效应受到抑制由植物或植物细胞自反馈引起和/或由病原微生物的效应因子引起。
180.在一个或多个实施方案中，所述eti诱导剂选自avrrpt2、avrpphb、avrrps4、受诱导型启动子调控的nlr蛋白(例如rpm1的突变版本rpm1-d505v)，或其它能够诱导eti的效应因子。
181.一种降低植物或植物细胞的bak1、bik1或其同源物、mpk3、rbohd基因表达或活性的方法，包括减弱所述植物或植物细胞的eti效应，优选所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
182.(1)使用抑制eti效应的试剂处理植物或植物细胞，
183.(2)下调增强eti效应的基因的表达或活性，
184.(3)上调抑制eti效应的基因的表达或活性。
185.在一个或多个实施方案中，抑制eti效应的试剂是离子螯合剂或离子通道抑制剂。例如edta、egta或氯化镧。
186.一种减弱植物或植物细胞的pti效应或促进对pti效应的抑制的方法，包括减弱所述植物或植物细胞的eti效应，优选所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
187.(1)使用抑制eti效应的试剂处理植物或植物细胞，
188.(2)下调增强eti效应的基因的表达或活性，
189.(3)上调抑制eti效应的基因的表达或活性。
190.在一个或多个实施方案中，抑制eti效应的试剂是离子螯合剂或离子通道抑制剂。例如edta、egta或氯化镧。
191.在一个或多个实施方案中，所述对pti效应的抑制由植物或植物细胞自反馈引起和/或由病原微生物的效应因子引起。
192.本发明还提供增强植物或植物细胞的pti效应的试剂在增强植物或植物细胞的eti效应或提高植物eti效应的活性氧ros产生中的应用，优选地，所述试剂选自以下的一种或任意多种试剂：
193.(1)诱导pti的试剂，
194.(2)上调增强pti效应的蛋白的表达或活性的试剂，和
195.(3)下调抑制pti效应的蛋白的表达或活性的试剂。
196.在一个或多个实施方案中，上调增强pti效应的蛋白的表达或活性的试剂选自以下一种或任意多种试剂的组合：
197.(1)上调rbohd的表达或活性的试剂；
198.(2)上调prr受体的表达或活性的试剂；
199.(3)上调prr共受体的表达或活性的试剂；和
200.(4)上调bik1或其同源物的表达或活性的试剂。
201.在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、抗体、碳水化合物、脂类或小分子化合物。
202.在一个或多个实施方案中，所述上调rbohd表达的试剂为rbohd的表达载体。
203.在一个或多个实施方案中，所述上调prr受体表达的试剂为prr受体的表达载体。
204.在一个或多个实施方案中，所述上调prr共受体表达的试剂为prr共受体的表达载体。
205.在一个或多个实施方案中，所述上调bik1或其同源物表达的试剂为bik1或其同源物的表达载体。
206.在一个或多个实施方案中，bik1的同源物是osrlck185、osrlck176。
207.在一个或多个实施方案中，所述prr受体选自fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、oscebip、oslyp4/6、fls3或core，优选fls2或oscebip或fls3。
208.在一个或多个实施方案中，所述prr共受体选自bak1、bkk1、cerk1或oscerk1，优选bak1或cerk1。
209.本发明还提供减弱植物或植物细胞的pti效应的试剂在减弱植物或植物细胞的eti效应或降低植物eti效应的活性氧ros产生中的应用，优选地，所述试剂选自以下的一种或任意多种试剂：
210.(1)抑制pti的试剂，
211.(2)下调增强pti效应的蛋白的表达或活性的试剂，
212.(3)上调抑制pti效应的蛋白的表达或活性的试剂。
213.在一个或多个实施方案中，下调增强pti效应的蛋白的表达或活性的试剂选自以
下一种或任意多种试剂的组合：
214.(1)下调rbohd的表达或活性的试剂；
215.(2)下调prr受体的表达或活性的试剂；和
216.(3)下调prr共受体的表达或活性的试剂；和
217.(3)下调bik1或其同源物的表达或活性的试剂。
218.在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、抗体、碳水化合物、脂类或小分子化合物。
219.在一个或多个实施方案中，下调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的表达包括：
220.(1)抑制相应基因转录活性；
221.(2)下调相应基因转录水平；
222.(3)促进相应基因mrna降解；
223.(4)抑制相应基因mrna翻译；
224.(5)在细胞中引入特异性识别相应基因的导向核酸并进行剪切以降低其表达水平；和
225.(6)敲除或敲减基因组中的基因。
226.在一个或多个实施方案中，下调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的活性的试剂包括：
227.(1)上调促进rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物降解的e3泛素连接酶的试剂；或
228.(2)上调抑制rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物活性的激酶或磷酸酶的试剂。
229.在一个或多个实施方案中，下调rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物的活性的试剂包括：促进rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物降解的e3泛素连接酶的表达载体或抑制rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物活性的激酶或磷酸酶的表达载体。
230.在一个或多个实施方案中，所述e3泛素连接酶选自fls2的e3泛素连接酶pub12或pub13、或bik1的e3泛素连接酶pub25或pub26。
231.在一个或多个实施方案中，所述抑制rbohd、prr受体、prr共受体或bik1或其同源物活性的激酶或磷酸酶选自cpk28、kapp、pp2a及pp2c38。
232.在一个或多个实施方案中，所述下调rbohd表达的试剂为rbohd的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的rbohd的核酸。
233.在一个或多个实施方案中，所述下调prr受体表达的试剂为prr受体的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的prr受体的核酸。
234.在一个或多个实施方案中，所述下调prr共受体表达的试剂为prr共受体的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的prr共受体的核酸。
235.在一个或多个实施方案中，所述下调bik1或其同源物表达的试剂为bik1或其同源物的抑制剂，或敲除或敲减细胞中的bik1或其同源物的核酸。
236.在一个或多个实施方案中，bik1的同源物是osrlck185、osrlck176。
237.在一个或多个实施方案中，所述prr受体选自fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、oscebip、oslyp4/6、fls3或core，优选fls2或oscebip或fls3。
238.在一个或多个实施方案中，所述prr共受体选自bak1、bkk1、cerk1或oscerk1，优选bak1或cerk1。
239.在本文所述实施方案的优选例中，rbohd的氨基酸序列如seq id no:1所示。
240.在本文所述实施方案的优选例中，fls2的氨基酸序列如seq id no:2所示。
241.在本文所述实施方案的优选例中，bak1的氨基酸序列如seq id no:3所示。
242.在本文所述实施方案的优选例中，bik1的氨基酸序列如seq id no:4所示。
附图说明
243.图1、eti免疫响应依赖于prrs受体及共受体.(a,b)fec和bbc三突突变体缺失由效应因子avrrpt2、avrpphb和avrrps4介导的eti免疫。拟南芥植株分别用od
600
＝0.002或0.004(～1x106cfu/ml或～2x106cfu/ml)的不同菌株处理。注射三天后取样统计细菌的数量。利用two-way anova进行统计学分析，不同的字母表示细菌的数量差异具有显著的生物学意义。(mean
±
sd；n≥3；p<0.05)。(c)在fec和bbc突变体中，超敏反应(hr)引起的细胞死亡也有所延迟。用浓度为od
600
＝0.2的pst dc3000(avrrpt2)菌株分别注射拟南芥的叶片，并于注射完7.5小时进行取样拍照。右侧比率为死亡的叶片占全部注射的叶片的比值。(d)prrs受体及共受体的三突突变体植物对d36e(avrrpt2)菌株更加敏感。用od
600
＝0.004(～2x106cfu/ml)的菌株分别注射野生型col-0及突变体fec和bbc，并于三或四天后取样统计细菌的数量。利用two-way anova进行统计学分析，不同的字母表示细菌的数量差异具有显著的生物学意义。(mean
±
sd；n≥3；p<0.05)。
244.图2、avrrpt2激活的eti引起的第二次持久的活性氧ros的产生依赖于prrs或共受体。(a,b)基于luminol-hrp的方法检测100nm flg22、5μm dex和两者都加的三种方式处理的转基因材料col-0/dex::avrrpt2中ros的产生情况。rlu表示相对的发光单元。总光子数为对应的a图的时间区间的总和。利用one-way anova进行统计学分析，不同的字母表示总光子数差异具有显著的生物学意义。(mean
±
s.e.m(n≥27)；p<0.05)。(c)不同的avrrpt2的转基因材料在注射5μm dex 2小时后，avrrpt2的基因表达水平。利用one-way anova进行统计学分析，不同的字母表示不同处理间的差异具有显著的生物学意义。(mean
±
s.e.m；n≥3；p<0.05)。(d,e)基于luminol-hrp的方法检测5μm dex或100nm flg22+5μm dex处理的转基因材料col-0/dex::avrrpt2和bbc/dex::avrrpt2中ros的产生情况。总光子数为对应的(d)图的时间区间的总和。利用two-way anova进行统计学分析，不同的字母表示总光子数差异具有显著的生物学意义。(mean
±
s.e.m(n≥6)；p<0.05)。
245.图3、avrrpt2激活的eti引起的ros产生依赖于rbohd。(a)利用荧光染料h2dcfda检测d36e(avrrpt2)接种col-0、bbc和rps2五小时后或d36e菌株接种col-0五小时后的ros产生情况。白色的剪头表示叶片的胞间质区域。比例尺＝25μm。(b,c)nadph氧化酶的抑制剂dpi能够抑制转基因材料col-0/dex::avrrpt2 l1植株中的ros产生。叶片用100nm flg22+5μm dex处理并分别同时加上dpi、sham或nan3(b)。叶片先用100nm flg22+5μm dex处理引起第一次的ros产生，大概40分钟后，再分别向溶液中加入抑制剂dpi、sham或dpi(c)。(mean
±
s.e.m；n≥6)。(d)利用荧光染料h2dcfda检测d36e(avrrpt2)注射col-0和rbohd突变体五小
时后ros的产生情况。比例尺＝25μm。(e)在接种完病原菌后，col和bbc中rbohd基因的转录表达水平。利用two-way anova进行统计学分析，不同的字母表示差异具有显著的生物学意义。(mean
±
s.e.m；n≥3；p<0.05)。(f)col-0和bbc突变体在接种完h2o(mock)、d36e和d36e(avrrpt2)后在不同时间点检测rbohd的蛋白水平。
246.图4、avrrpt2激活的eti引起的ros产生依赖于bik1。bik1突变体而非cpk4/5/6/11突变体极大地缺失由avrrpt2激活eti产生的ros。植物处理完d36e(avrrpt2)4.5小时后用h2dcfda进行染色。比例尺＝25μm。
247.图5、eti上调pti的核心信号组分(a)代表性的pti信号组分基因的qrt-pcr定量结果。利用不同菌处理col-0和bbc，3小时后取样检测基因的表达情况。利用two-way anova进行统计学分析，不同的字母表示差异具有显著的生物学意义。(mean
±
s.e.m；n≥3；p<0.05)。(b)bak1、bik1和mpk3在不同菌的处理下的蛋白水平变化。不同菌分别处理col-0后于相应的时间点取样检测蛋白变化。相同量的总蛋白上样到蛋白胶中。
具体实施方式
248.应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
249.发明人利用拟南芥-丁香假单胞杆菌(pseudomonas syringae)模式研究系统，发现拟南芥的模式识别受体(prrs)及其共受体的多突变体极大地缺失了由细菌效应因子触发的eti免疫，因此pti对eti免疫是必需的。并且模式识别受体及其共受体对于eti反应中活性氧ros(reactive oxygen species)的产生至关重要，这一过程由rbohd蛋白介导而模式识别受体对其激活至关重要。
250.因此，本文提供一种通过调控植物的rbohd的表达或活性来调控植物eti效应的活性氧ros产生方法。同时，发明人还发现rbohd的激活需要prr受体(例如fls2和efr)和共受体(例如bak1、bkk1或cekr1)及下游激酶bik1或其同源物，并且bik1可能是激活rbohd介导eti-ros产生的重要激酶。因此，本文还提供利用调控植物的prr受体或共受体及bik1的表达或活性继而改变rbohd的表达或活性从而调控植物eti效应的活性氧ros产生或调控植物eti抗病效应的方法。本文中，“调控”包括上调和下调，上调包括促进、增加和/或增强，下调包括抑制、降低、减弱、破坏和/或减少。本文中，“植物”包括植株或其部分，例如植物的细胞，尤其是高等植物或其细胞。“eti效应的活性氧ros”表示植物的由eti效应引起的ros产生。prr受体包括源自拟南芥的fls2、efr、lym1/2/3、lyk4/5、lore、或源自水稻的efroscebip、oslyp4/6、或源自番茄的fls3、core，优选fls2、oscebip或fls3。prr共受体包括源自拟南芥的bak1、bkk1、cerk1、或源自水稻的oscerk1，优选bak1或cerk1。拟南芥来源的rbohd的氨基酸序列如seq id no:1所示。拟南芥来源的prr受体fls2的氨基酸序列如seq id no:2所示。拟南芥来源的prr共受体bak1的氨基酸序列如seq id no:3所示。拟南芥来源的bik1的氨基酸序列如seq id no:4所示。应理解的是，本文所述的rbohd、prr受体、prr共受体、bik1可来自感兴趣的各种植物，所述植物包括但不限于拟南芥、番茄、马铃薯、甘蓝、烟草、黄瓜、芥花、菜苔、油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿、高粱。因此，本文还涉及不同物种的rbohd的同源物：水稻的xp_015616929.1、玉米的xp_008655905.1、马铃薯
的np_001305507.1、甘蓝的xp_013598618.1、烟草的np_001313052.1和xp_016510188.1及大豆的xp_003554649.1等。本文还涉及不同物种的fls2的同源物：水稻的xp_015634951.1、玉米的xp_008668880.1、马铃薯的xp_006365570.1、大豆的xp_003532650.1、甘蓝的xp_013611677.1及烟草的xp_016490799.1等。本文还涉及不同物种的bak1的同源物：水稻的xp_015649858.1、玉米的np_001313384.1、西红柿的np_001234626.1和np_001233871.1、烟草的xp_016442040.1、大豆的xp_003547599.1、高粱的xp_002454054.1等。本文还涉及不同物种的bik1的的同源物：水稻的xp_015639740.1、玉米的np_001141912.1、花生的xp_025690300.1、黄瓜的xp_008458866.1、油菜的xp_013734585.1、甘蓝的xp_013623444.1及高粱的xp_002466186.1等。在优选实施方案中，本文还包括rbohd、bik1的同源物，例如bik1在水稻中的同源物rlck185或rlck176。本文也提供rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的突变体，只要其仍具有各自在植物免疫中的功能即可。
251.可通过在植物细胞中上调rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的活性来上调植物eti效应的活性氧ros产生或上调植物eti抗病效应。可使用rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的激动剂(例如来自细菌的病原分子相关模式，鞭毛蛋白的flg22、伸长因子elf18、几丁质)或提高rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的活性的小分子化合物来提高rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的活性。或者可通过基因敲入或转基因手段向细胞引入使rbohd、prr受体、prr共受体、bik1发生活性增强的突变。通常，蛋白活性的提高指与野生型相比，蛋白活性具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％的提高；或者与野生型细胞相比，宿主细胞中的蛋白活性有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％的提高。
252.相应地，可通过在植物细胞中下调rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的活性来下调植物eti效应的活性氧ros产生或下调植物eti抗病效应。可使用rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的拮抗剂、特异性抗体或编码其的核酸序列、或降低rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的活性的小分子化合物(如:dpi能特异的抑制rbohd的活性)来下调rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的活性。或者可通过基因敲入手段向细胞引入使rbohd、prr受体、prr共受体、bik1发生活性降低的突变。本文中，降低蛋白的活性包括使宿主细胞与对照细胞(野生型细胞)相比，蛋白的活性降低至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至完全不表达这些蛋白或完全检测不到这些蛋白的活性。
253.可通过在植物细胞中上调rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的表达来上调植物eti效应的活性氧ros产生或上调植物eti效应。上调rbohd、prr受体、prr共受体、bik1表达的方法包括但不限于(1)增强基因的转录活性；(2)提高基因的转录水平；(3)抑制基因的mrna降解；(4)促进基因mrna的翻译；和(5)在细胞中导入含基因的表达载体和/或整合载体。rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的各自表达的上调可通过在宿主或宿主细胞中过表达这些分子而实现其表达的上调。例如，可利用本领域常规的技术构建适于在宿主细胞中表达这些分子的表达载体，并通过常规方法转入宿主细胞中，使得表达载体在宿主细胞中表达所述分子，从而实现其表达的上调。在某些实施方案中，可调控这些分子的上游基因的表达，从而提高这类分子的表达。
254.相应地，可通过在植物细胞中下调rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的表达来下调植物eti效应的活性氧ros产生或下调植物eti抗病效应。下调rbohd、prr受体、prr共受体、bik1表达或活性的方法包括但不限于(1)抑制基因的转录活性；(2)下调基因的转录水平；
(3)促进基因mrna的降解；(4)抑制基因mrna的翻译，例如sirna或shrna；(5)在细胞中导入特异性识别蛋白基因的导向核酸并进行剪切以降低其表达水平；和(6)部分或全部敲除基因组中的基因；(7)上调调控这些蛋白降解的e3泛素连接酶和(8)上调抑制这些蛋白活性的激酶或磷酸酶。
255.也可通过在rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的蛋白中引入突变而使其活性降低。因此，在某些实施方案中，在rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的蛋白的功能域中引入致其相应活性减弱或丧失的突变。突变可以是1个或数个甚至更多(例如10个以上、20个以上、30个以上)个氨基酸的插入、缺失或取代。可通过给予作用于rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的基因的试剂，使其所编码的蛋白的功能域中存在导致其相关生物学活性减弱或丧失的突变。这类试剂可改变rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的基因的序列，导致所编码的蛋白存在相应的突变，从而具有减弱的活性，或活性丧失。例如，可通过同源重组技术用突变的rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的基因替换野生型细胞中的响应基因，从而导致其表达弱活性或无活性的rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的蛋白。
256.本文中，病原微生物(包括细菌、真菌、卵菌等)引起的植物病害统称为植物病原微生物病。植物病害往往会导致农作物非常严重的产量及品质的下降，威胁着人类的食品安全。植物病原细菌主要有以下5个属：假单胞杆菌属(pseudomonas)、黄单胞杆菌属(xanthomonas)、欧氏杆菌属(erwinia)、野杆菌属(arobacterium)和棒杆菌属(corynebacterium)。植物病原细菌病害常常引起植物的各种各样的病症，如假单胞杆菌属导致的番茄斑点病，水稻细菌性褐斑病、黄瓜细菌性角斑病、番茄及马铃薯的青枯病等，其中青枯假单胞杆菌可以侵害44个科的300多种植物；黄单胞杆菌属的病害有水稻白叶枯病，黄瓜细菌性叶枯病等；欧文氏杆菌属的大豆细菌性斑疹病及番茄果实细菌性斑疹病等。植物真菌(菌物)界包括粘菌门和真菌门，而真菌门包括5个亚门：鞭毛菌亚门(mastigomycotina)、接合菌亚门(zygomycotina)、子囊菌亚门(ascomycotina)、担子菌亚门(basidiomycotina)、半知菌亚门(deuteromycotina)。主要导致的植物病害有水稻稻瘟病、禾谷类的赤霉病、禾谷镰孢菌引起的茎腐病、小麦锈病、蔬菜白粉病、甘薯黑斑病等。卵菌是一类真核生物，也是非常重要的植物致病菌，其主要导致的农作物的一些病症有马铃薯晚疫病、大豆霜霉病、大豆疫霉病和烟草黑胫病等。本文实施例中示例性细菌是假单胞杆菌属的丁香假单胞杆菌种的来源于番茄宿主的pst dc3000。应理解的是，本文所述的病原微生物可以是任何感兴趣的微生物。
257.另一方面，发明人还发现eti能够强烈地上调很多pti重要信号组分的转录和蛋白水平。以上发现表明植物的两类免疫受体(prr受体/共受体和nlr)在功能上存在重要关联，pti和eti通路之间互相依赖和激活，并且pti实际上是eti免疫中不可或缺的一个组分。通过调控eti，能够调控pti信号的关键组分，其中包括bak1、bik1、rbohd和mpk3等。同时，通过调控植物的eti效应可以克服由于植物自身的负反馈机制或者外源病原物的效应因子的抑制作用。
258.因此，本发明提供通过增强植物的eti效应来上调bak1、bik1、rbohd和mpk3等基因表达或活性的方法，和通过增强植物的eti效应来减弱或防止pti效应受到抑制的方法。可通过将eti通路的诱导剂引入植物或植物细胞来增强eti效应。所述诱导剂可以是能引起eti的微生物效应因子，例如可通过将表达效应因子的载体导入植物细胞来诱导eti效应
等。所述效应因子例如avrrpt2(wp_080397204.1)、avrpphb(q52430.1)、avrrps4(wp_122271384.1)或其它已报道的能够诱导起eti的效应因子(包括来源于侵染各种植物的不同病原物的效应因子)；此外可以用诱导型启动子接激活版本的nlr蛋白rpm1(d505v)。还可以通过上调eti通路中增强eti效应的基因的表达或活性，或下调eti通路中抑制eti效应的基因的表达或活性来增强eti效应。上调基因表达的方法包括但不限于(1)增强基因的转录活性；(2)提高基因的转录水平；(3)抑制基因的mrna降解；(4)促进基因mrna的翻译；和(5)在细胞中导入含基因的表达载体和/或整合载体。下调基因表达的方法包括但不限于(1)抑制基因的转录活性；(2)下调基因的转录水平；(3)促进基因的mrna降解；(4)抑制基因mrna的翻译；(5)在细胞中引入特异性识别蛋白基因的导向核酸并进行剪切以降低其表达水平；和(6)部分或全部敲除基因组中的蛋白基因；(7)上调调控这些蛋白降解的e3泛素连接酶和(8)上调抑制这些蛋白活性的激酶或磷酸酶。
259.本发明还提供通过抑制植物的eti效应来下调bak1、bik1、mpk3、rbohd基因表达或活性的方法，和通过抑制植物的eti效应来促进pti效应受到抑制的方法。可通过使用eti通路的抑制剂处理植物或植物细胞来增强eti效应。这样的抑制剂例如离子螯合剂或离子通道抑制剂。还可以通过下调eti通路中增强eti效应的基因的表达或活性，或上调eti通路中抑制eti效应的基因的表达或活性来增强eti效应。上调和下调基因的方法如本文他处所述。
260.本文的试剂可以是核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化合物和蛋白，例如抗体。本文中，核酸分子可以是例如sirna、shrna、表达载体或打靶载体。小分子化合物通常指采用化学方法合成的分子量较低的化学合成化合物。蛋白包括特异性抗体。例如，试剂可以是与rbohd、prr受体、prr共受体、bik1特异性结合的抗体。在某些实施方案中，本发明的上述方法包括将过表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1的植物载体或过表达mir-146a的反义互补序列的植物载体导入植物中，从而抑制或促进eti效应。
261.本文所述蛋白或多肽也包括与所述蛋白或多肽具有至少80％序列相同性并保留蛋白或多肽活性的变体。所述变体包括：与参照序列具有至少70％，至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性(如nadph氧化酶活性、激酶活性)的氨基酸序列。可采用例如ncbi的blastp计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在所述氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该参照序列的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－50个以内，例如1-20、1-10、1-8、1-5或1-3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
262.本文所述蛋白或多肽与其相邻多肽可直接连接，或者可通过本领域周知的接头序列连接，例如含有g和/或s的接头。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是gggs、ggggs、ssssg、gsgsa和ggsgg。
263.本发明还包括本文所述的各种蛋白或其突变体的编码序列及其互补序列，以及含有所述编码序列或互补序列的核酸构建体。本文中，核酸构建体是可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。该核酸构建体含有本文所述的编码序列或其互补序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。
264.在某些实施方案中，所述核酸构建体是载体。具体而言，可将本文所述的编码序列克隆入许多类型的载体，这些类型的载体包括但不限于用于植物或细菌的质粒。本领域知晓通过基因工程技术将编码序列克隆入这些载体中的方法。载体可以是表达载体、打靶载体、或克隆载体。
265.通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；真核启动子包括cmv35s启动子、玉米或水稻ubi启动子、植物蛋白自身的启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。当本文所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，则将会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
266.本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。可采用本领域技术人员熟知的方法构建含本文所述的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。
267.本文还包括包含本文所述多核苷酸序列或其核酸构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真核细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞等。
268.可采用常规的方法将本文的载体导入宿主细胞、植物种子或植物中，这些方法包括显微注射法、基因枪法、电穿孔法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法、农杆菌浸花法、组织培养农杆菌侵染。本领域技术人员知晓利用导入有载体的宿主细胞或植物种子获取转基因植物植株的方法，例如植物组织培养、植物自交或杂交。
269.因此，本发明还提供一种植物、其部分或其细胞，所述植物、部分或细胞过表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种，和/或所述植物、部分或细胞包含表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种的载体。所述植
物选自拟南芥、番茄、马铃薯、甘蓝、烟草、黄瓜、芥花、菜苔、油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油棕、亚麻、葵花、玉米、水稻、大麦、粟、黑麦、小麦、燕麦、苜蓿、高粱。
270.本文所述植物或其部分可制作为产品，例如食品原料或食品。所述食品原料包含所述植物、其部分或其细胞，或由所述植物、其部分或其细胞制备。所述食品包含所述植物、其部分或其细胞，或由所述植物、其部分或其细胞制备，或由所述食品原料制备。这些植物、部分或细胞过表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种，和/或所述植物、部分或细胞包含表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种的载体。例如，食品或食品原料可以是油、青贮饲料、粗粉、谷粒或细粉。本文所述产品(例如食品原料或食品)的生产方法本领域熟知，包括(1)获得包含植物、其部分或其细胞，所述植物、其部分或其细胞过表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种，和/或所述植物、其部分或其细胞包含表达rbohd、prr受体、prr共受体、bik1或其同源物中一种或任意多种的载体，和(2)由所述植物、其部分或其细胞生产所述食品原料或食品。
271.本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
272.实施例
273.i材料和方法
274.1.实验材料
275.1.1.植物材料与生长条件
276.本研究中用到的拟南芥(arabidopsis thaliana)植物均以col-0生态型为背景。生态型col-0与突变体材料fls2/efr/cerk1(fec)、bak1/bkk1/cerk1(bbc)和rps2(获赠自sheng yang he教授，michigan state university和cyril zipfel教授,university of zurich,switzerland)，突变体rbohd与bik1(或赠自周俭民教授，中国科学院遗传与发育生物学研究所)，突变体cpk4/5/6/11(购买自欧洲拟南芥种质中心，eurasian arabidopsis stock centre)。种子用5％的次氯酸钠消毒5～7分钟，无菌水清洗5～7次，之后放入4℃冰箱黑暗处理2天左右，然后直接将种子点到装好拟南芥土的小盆中，移至条件为22℃、相对湿度60％，12小时光照/12小时黑暗的光照培养箱中。一般长至4～5周的拟南芥用于该研究。
277.1.2.菌株和载体
278.大肠杆菌菌株：dh5α(购自唯地生物)；
279.农杆菌菌株：gv3101(购自唯地生物)；
280.丁香假单胞杆菌菌株：pst dc3000、pst dc3000(avrrpt2)、pst dc3000(avrpphb)、pst dc3000(avrrps4)及pst d36e(获赠自sheng yang he教授，michigan state university)，pst d36e(avrrpt2)(构建自本实验室)；
281.转基因构建载体：pbud-dex(pbd)(获赠自sheng yang he教授，michigan state university)；
282.表达载体：pdsk519-avrrpt2(获赠自sheng yang he教授，michigan state university)
283.2.实验方法
284.2.1.转基因表达载体的构建
285.以pst dc3000(avrrpt2)为模板，利用q5高保真dna聚合酶(购买自neb,high-fidelity dna polymerases)，克隆效应因子avrrpt2(768bp)的dna序列，通过利用xhoi/spei酶切的方法，将avrrpt2基因用t4 dna连接酶(购买自invitrogen)直接连接到pbud-dex(pbd)转基因载体中，转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆并测序验证，获得质粒pbd-avrrpt2。获得的转基因表达载体用于转化col-0和bbc植物。引物序列如表1。
286.表1
[0287][0288]
2.2.植物遗传转化及筛选
[0289]
将构建好的载体pbd-avrrpt2通过化学转化法的方法转入农杆菌菌株gv3101中，涂在含有rif+kan双抗的lb培养基上，30℃倒置培养2天。挑取单菌落进行pcr鉴定，鉴定为阳性的克隆接种到5ml含有相应抗生素的lb液体培养基中，30℃振荡培养8～10个小时。晚上按照1:100比例将农杆菌接种于200ml含有相应抗生素的培养基中，振荡培养10-16小时，至od
600
＝0.6～1.0。5000rpm,10min收集菌株，去上清，并用转化缓冲液悬浮菌液。之后利用浸花转化法分别转化col-0和bbc植株，每次浸染45～60秒，然后将植物盖上盖子，暗下处理一晚上。第二天将苗取出，放入培养架上，待种子成熟后，收种进行筛选后代。收到的t0代的种子直接平铺到土壤中，待小苗长至10～14天左右喷除草剂草铵膦(购买自翊圣公司)筛选t1代的阳性苗，并进行pcr扩增鉴定。阳性转基因植株用于后续实验。
[0290]
本实验所用培养基及转化缓冲液配方：
[0291]
1)lb培养基：
[0292]
胰蛋白酶(tryptone)：10g/l
[0293]
酵母提取物(yeast extract)：5g/l
[0294]
氯化钠(nacl)：10g/l
[0295]
2)转化缓冲液：
[0296]
1/2ms：2.2g/l
[0297]
蔗糖：10g/l
[0298]
silwet l-77：0.025％
[0299]
mes：0.5g/l
[0300]
用10m koh调整ph＝5.8
[0301]
2.3.植物病原菌的接种及超敏反应hr实验
[0302]
本研究用到的菌株d36e(avrrpt2)是本课题组将pdsk519-avrrpt2载体通过电击
转化法转入d36e中，获得的d36e(avrrpt2)菌株通过pcr及hr反应进行双重验证。其余菌株均获赠自sheng yang he教授实验室。
[0303]
丁香假单胞杆菌pst菌株从-70℃冰箱取出，接种至含有相应抗生素的lm培养基上，30℃倒置培养2天。挑取单菌落接入4～5ml含有相应抗生素的液体lm培养基中，30℃过夜振荡培养，至od
600
＝0.8～1.0。进行集菌2500g离心，5min，去上清，加入灭菌水清洗一遍。2500g离心，5min，取上清，加入灭菌水。调整每个菌株的od
600
＝0.2(菌落数大约等于108cfu/ml)待用。对于病原菌的接种实验，将od
600
＝0.2的菌株分别稀释至od
600
＝0.002或0.004(～1x106cfu/ml或～2x106cfu/ml)，之后分别用注射器将菌液接种至相应的拟南芥叶片中。注射完的叶片先用纸巾将背面的溶液擦干，然后将植株放置在环境湿度下一个小时左右，至注射完的叶片中的水分完全蒸发干，之后用塑料盖子盖在托盘上保持高湿度3～4天。之后进行取样定量菌落数。取样时一般先用75％乙醇消毒20～40秒左右，杀死叶片表面的菌株，然后用无菌水清洗两遍，之后用直径为7.5mm的打孔器打两片来自不同植株的叶片的4个小圆盘为一个样品作为一个生物学重复，每次实验取3～4个重复。小圆盘用研磨仪磨碎，然后加灭菌水稀释至不同浓度梯度，点在含有利福平(50mg/l)的lm固体培养基上，待晾干后，30℃倒置培养24小时，在体视镜下统计细菌的菌落数。
[0304]
对于超敏反应hr实验，将调整好od
600
＝0.2的菌株dc3000(avrrpt2)直接注射col-0、fec、bbc及rps2植株的叶片中，注射完将植物放置在环境湿度下，大概7小时后统计叶片的死亡情况并进行拍照。
[0305]
本实验所用培养基配方：
[0306]
lm培养基：
[0307]
胰蛋白酶(tryptone)：10g/l
[0308]
酵母提取物(yeast extract)：6g/l
[0309]
氯化钠(nacl)：0.6g/l
[0310]
磷酸二氢钾(kh2po4)：1.5g/l
[0311]
硫酸镁(mgso4)：0.35g/l
[0312]
2.4.活性氧ros的检测
[0313]
基于luminol-hrp的方法检测体内活性氧ros的产生参照之前的方法，有所小改动。具体的操作方法为：一般取4周左右的拟南芥的叶片，用直径为5.5mm的打孔器，延着叶脉区域打叶片获得圆盘状的小叶片。之后将小叶片近轴面朝上放入含有200μl灭菌水的96孔白板(购买自thermo fisher scientific)中，放在室温持续的光照下处理过夜。第二天配制含有30mg/l(w/v)的luminol(购买自sigma-aldrich)和20mg/l(w/v)的hrp(peroxidase from horseradish,购买自sigma-aldrich)的溶液，使用时分别加上100nm flg22(购买phytotech)、5μm dex(购买自sigma-aldrich)或100nm flg22+5μm dex，充分混匀后，用该溶液替换掉96孔板中的灭菌水。之后将96孔板子放入varioskan flash plate reader酶标仪(thermo fisher scientific)中每隔两分钟检测一次化学发光值，一直持续读数5～6小时。为了检测不同的抑制剂对ros产生的影响，分别在测试前及检测后40min加入10μm dpi(diphenyleneiodonium；购买自sigma-aldrich)、15μm sham(salicylhydroxamic acid；购买自sigma-aldrich)或1μm sodium azide，然后继续按照上述的设置进行统计化学发光值。
[0314]
对于利用荧光指示剂h2dcfda(2’,7
’-
dichlorofluorescein diacetate；购买自sigma-aldrich)处理植物在共聚焦显微镜下检测ros的产生。具体的方法分为：将调好od
600
＝0.02的丁香假单胞杆菌pst d36e和d36e(avrrpt2)分别注射不同基因型的拟南芥叶片，之后将植物叶片擦干，放置在环境湿度下晾干至叶片完全无水渍状态，然后盖上塑料盖子保持高湿度，放入培养箱。大概4～5小时后，再次注射含有10μm h2dcfda染料的溶液，保湿10min后，直接取叶片至载破片上，盖上盖玻片，用leica sp8共聚焦显微镜设置488nm波长的激发光，501～550nm波长的发射光检测dcfda信号，并用发射光640～735nm波长检测叶绿体自发荧光。
[0315]
2.5.拟南芥叶片总rna的提取
[0316]
为探究基因的表达水平变化，生长4周左右的拟南芥叶片分别注射灭菌水(mock)或od
600
＝0.04的不同pst菌株，并于3小时取样用于抽提总rna。来自不同植株的三片叶子为一个生物学样品，每个处理取四个重复。
[0317]
为保障能够提取到高质量的rna，本实验所用的耗材及试剂均为rnase-free的产品。
[0318]
1)样品用液氮研磨成粉末，每50-100mg材料加入到1ml的trizol(购买自invitrogen)中，立即混匀，研磨样品的体积应不超过trizol的10％。
[0319]
2)室温分离5min，若样品较多，放在冰上，防止降解。
[0320]
3)离心去沉淀，4℃，12000rpm，10min，取上清液至新的rnase-free离心管中。
[0321]
4)每1ml trizol加入0.3ml氯仿，盖紧，剧烈震荡15秒，离心，4℃，12000rpm，15min，离心后液体分三层，最下层暗红色为酚-氯仿相，中间相，无色上清水相。rna溶于水相，约占trizol的60％。
[0322]
5)上清液转至新的rnase-free离心管中，加入等体积的氯仿，盖紧，剧烈震荡15秒，离心，4℃，12000rpm，15min。
[0323]
6)上清液转至新的rnase-free离心管中，每1ml的trizol加0.5ml的异丙醇，冰上放置10min，离心，4℃，12000rpm，10min。
[0324]
7)洗涤，去除上清，加入1ml 75％乙醇，混匀(放置)，离心，4℃，7500rpm，5min。
[0325]
8)弃上清，待沉淀完全干燥后，加入rnase free h2o溶解(20～30μl)。
[0326]
9)将利用trizol法抽提完的mrna进行dna降解实验(体系如下，表2)：
[0327]
表2
[0328]
rna30μlrnase free h2o14μlrnaseout
tm
(400u/ul)0.5μl10*dnase buffer5μldnase(rnase free)(5u/ul)0.5μl总计50μl
[0329]
10)配制完的溶液放入37℃水浴锅孵育30min；
[0330]
11)将ep管从水浴锅取出，加入8μl 3.75％sds，立即轻弹混匀，短暂离心；
[0331]
12)再加入2μl proteinase k,37℃水浴锅孵育15min中；
[0332]
13)向上述孵育完的样品中加入40μl的rnase-free h2o(depc h2o)，彻底混匀，配
制成100μl体系的溶液(用于接下来的纯化<qiagenminelute
tm cleanup>)；
[0333]
14)向上述溶液中加入350μl rlt(事先已向rlt溶液中加入bate-巯基乙醇，每1ml加入10μl)，立即混匀；
[0334]
15)然后再向溶液中加入250μl无水乙醇，用于稀释rna，立即用枪头混匀；
[0335]
16)将上步混匀完的700μl溶液全部转移至rneasy minelute吸附柱中，盖上管盖，离心8000g，15s，去除2ml收集管及液体；
[0336]
17)将吸附柱转移至新的2ml收集管中，加入500μl rpe，离心8000g，15s，倒掉收集管中的废液；
[0337]
18)加入500μl 80％乙醇至吸附柱中，离心8000g，2min，去除2ml收集管中废液；
[0338]
19)将吸附柱转移至新的2ml收集管中，打开盖子，离心8000g，5min；
[0339]
20)将吸附柱转移至新的1.5ml收集管中，加入50ul rnase-free h2o于吸附柱中，盖上管盖，14000rpm离心1min，之后用nanodrop测量mrna的浓度及质量。
[0340]
2.6.反转录及定量pcr
[0341]
利用revertraqpcr rt master mix with gdna remover(购买自toyobo)反转录试剂盒进行反转录，具体方法参考标准说明书。
[0342]
1)rna的变性，取1μg总rna放入65℃条件下热变性5min，之后立即取出置于冰上冷却；
[0343]
2)去除基因组dna反应(dnase反应)
[0344]
在冰上配制如下反应液。
[0345][0346]
将反应液轻轻地搅拌均匀后，在37℃条件下温育5分钟。
[0347]
3)逆转录反应
[0348]
接着，在冰上配制如下反应液。
[0349]
步骤(3)的反应液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
8μl
[0350]
5x rt master mix ii
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2μl
[0351]
total
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10μl
[0352]
将反应液轻轻地搅拌均匀后，按以下条件进行反应。
[0353]
37℃,15min
[0354]
50℃,15min
[0355]
98℃,5min
[0356]
4℃,-[0357]
反应结束后，将反转录的cdna直接用灭菌的ddh2o稀释20倍，作为实时荧光定量pcr的模板。定量pcr用green realtime pcr master mix(购买自toyobo)，使用方法参照标准的方法。定量pcr引物参照表3，其中u-box基因作为内参。
[0358]
表3
[0359]
引物名称引物序列(5
’-3’
)u-box qrt-fptgcgctgccagataatacactatt(seq id no:7)u-box qrt-rptgctgcccaacatcaggtt(seq id no:8)rbohd qrt-fpgatcaaggtggctgtttaccc(seq id no:9)rbohd qrt-rptcggcagttcaccaacatga(seq id no:10)bak1 qrt-fpaggtgttctcttggagactagga(seq id no:11)bak1 qrt-rpagagatccagaacttgtagcgt(seq id no:12)bik1 qrt-fpttcttcacagcgatcccgtc(seq id no:13)bik1 qrt-rpttgcgttgtagtccgcatca(seq id no:14)mapk3 qrt-fpccaagaagccatagcactca(seq id no:15)mapk3 qrt-rpagccattcggatggttattg(seq id no:16)avrrpt2 qrt-fpcttttcacgatccccgacaggg(seq id no:17)avrrpt2 qrt-rpgcggtagagcattgcgtgtgg(seq id no:18)
[0360]
2.7.pti信号组分的蛋白提取及免疫检测
[0361]
四周左右的拟南芥叶片分别注射灭菌水(mock)或浓度为od
600
＝0.02的不同的pst菌株进行处理，并于0.5、3、6和8小时后取样用于提取蛋白。来自于不同植株的3～4片叶片作为一个样品。蛋白的提取利用plasma membrane protein isolation kit(购买自invent)试剂盒，具体的操作步骤参照标准的实验方法。细胞质的蛋白浓度用bradford protein assay kit(购买自bio-rad)进行定量。相同数量的总蛋白进行上样跑sds变性蛋白胶。不同的pti信号组分用以下抗体进行检测：anti-rbohd(购买自agrisera),1:1000；anti-bak1(购买自agrisera),1:5000；anti-bik1(购买自agrisera),1:3000；anti-mpk3(购买自sigma-aldrich)。
[0362]
实施例1，eti免疫依赖于prrs受体和共受体
[0363]
为解析模式识别受体prrs与nlr蛋白介导的免疫之间是否存在功能的关联以及prrs受体是否可能在eti介导的免疫中扮演角色，我们利用拟南芥植物的两个独立的且已经报道缺失主要的pti免疫反应的prrs及其共受体的多突变体材料fec(fls2/efr/cerk1)及bbc(bak1/bkk1/cerk1)来研究prrs在eti免疫中的作用。首先，我们选择已经研究的相对清楚的非致病菌株丁香假单胞杆菌的效应因子avrrpt2介导的eti作为主要研究手段。avrrpt2由植物中的受体rps2(resistance to p.syringae 2)蛋白识别而触发eti，因此在野生型植物中并不能致病。我们发现当用丁香假单胞杆菌菌株pst dc3000(avrrpt2)接种完fec及bbc突变体后，相较于野生型(col-0)对照，由eti介导的抗性在两个突变体中均有非常显著地下降(如图1a)，这表明prrs受体对eti介导的抗性至关重要。为进一步探索prrs受体对eti免疫的作用是只针对于特异的效应因子-nlr蛋白介导的eti免疫还是更为广谱，我们选择了另外两个非致病菌株，pst dc3000(avrpphb)和pst dc3000(avrrps4)，来验证prrs对其它nlr蛋白介导的eti是否同样起作用。这两个菌株含有能够分别被拟南芥rps5(resistance to p.syringae 5)和rps4(resistance to p.syringae 2)蛋白识别引起eti的效应因子avrpphb及avrrps4。我们发现与pst dc3000(avrrpt2)的表型类似，pst dc3000(avrpphb)及pst dc3000(avrrps4)处理后的fec及bbc突变体均表现出非常显著地eti抗性缺失的表型(图1b)。这些结果暗示，在拟南芥中prrs受体对于eti信号通路确实存在一个广
谱且至关重要的作用机制。接下来我们将主要利用avrrpt2这个效应因子来进一步解析prrs受体在eti信号通路中的具体分子机制。超敏反应(hr,hypersensitive response)是eti免疫中的另一个非常重要的宏观特征，其主要表现为在高浓度病原菌接种的条件下，植物细胞快速死亡而呈现出肉眼可见的植物组织萎蔫和死亡的特征。当我们利用高浓度的pst dc3000(avrrpt2)接种野生型col-0、fec及bbc突变体后，我们发现在fec及bbc突变体中超敏反应的速率明显慢于野生型(图1c)，进一步证实了eti反应依赖于prrs受体及其共受体。
[0364]
之前的研究中，人们大多利用丁香假单胞杆菌pst dc3000转入能够引起eti的效应因子(如avrrpt2,avrpphb和avrrps4等)来研究eti信号通路，然而pst dc3000菌株中携带大约36个已知的内源效应因子。前期的研究发现，pst dc3000中所携带的效应因子中有很多可以直接或间接干扰pti或eti免疫反应，因此利用pst dc3000携带触发eti的效应因子(如avrrpt2)不太容易清晰地解析出pti和eti之间的直接关系。为克服此问题，我们利用最近发表的敲除pst dc3000中的36个内源效应因子的菌株d36e来达到去除内源效应因子对植物免疫的影响。因此当把avrrpt2转入d36e菌株得到d36e(avrrpt2)后，预期此菌株在侵染植物后只会引起pti免疫及由rps2介导的eti免疫反应。尽管前期的研究发现相较于pst dc3000，d36e菌株的致病能力会极大地降低，但当用d36e(avrrpt2)处理拟南芥野生型col-0后，我们仍然可以观察到d36e(avrrpt2)的菌落数显著少于d36e菌株(图1d)，表明此菌株同样能够诱导极强的eti免疫。同样，我们也发现当用d36e(avrrpt2)处理fec及bbc突变体后，由avrrpt2触发的eti免疫在突变体中极大地降低(图1d)。这一结果再次证实了prrs受体对eti免疫的重要性。
[0365]
实施例2，prr受体及共受体调控eti介导的ros产生
[0366]
与pti和eti密切相关的另一个重要的下游免疫反应是活性氧ros的产生，如超氧化物和过氧化氢，它们被认为是能够直接杀死病原菌的防御分子以及可以进一步激活免疫反应的信号分子。因此我们利用鲁米诺-辣根过氧化氢酶(luminol-horseradish peroxidase(hrp))作为底物的方法来检测在col-0/dex::avrrpt2转基因材料中由pti和eti引起的ros产生情况。在此材料中当我们利用pamps(如flg22，一种来源于病原菌鞭毛蛋白的含有22个氨基酸的多肽，可以触发由fls2受体蛋白介导的pti)和地塞米松(dex，dexamethasone，可以诱导效应因子avrrpt2的表达)处理时，可以模拟病原菌且很好地区分由pti、eti以及二者组合引起的ros产生的变化。如图2a，与前期报道一致，flg22单独处理后可以引起一个快速且短暂的ros产生，而当只处理dex引起avrrpt2的表达时能够激起一个比较晚且比较弱的ros爆发。有趣的是，当同时处理flg22和dex后，除了第一个快速且短暂的ros产生(pti-ros)，还可以引起强烈而持久的二次ros的爆发，大概2-3小时达到峰值，并且能够持续数小时(eti-ros；图2a,b)。这与之前研究在细菌中观察到的ros爆发极为相似。这一重要发现暗示了eti产生强而持久的ros必须依赖于pti免疫的激活。为验证这一假说，我们将相同的dex::avrrpt2的载体通过农杆菌介导的方法转入col-0及bbc突变体中，并且选择dex诱导后avrrpt2的表达水平与col-0/dex::avrrpt2一致或更高的bbc/dex::avrrpt2转基因植株作进一步的分析(图2c)。如图2d-e所示，bbc/dex::avrrpt2转基因植株不但缺失了由flg22引起的第一次ros的产生，而且几乎完全丧失了由avrrpt2触发的第二次ros的产生。这一结果清楚地证明了prrs受体对eti介导的ros产生至关重要。
[0367]
实施例3，bik1激活由rbohd介导的eti-ros产生
[0368]
为进一步解析pti和eti相关的ros爆发产生于相同还是不同的细胞器/亚细胞部位，我们采用可以穿透植物细胞膜从而能够同时检测胞内和质外体的ros的荧光染料h2dcfda来实时观察ros的亚细胞定位。如图3a，当用d36e(avrrpt2)注射col-0植物5小时后，可以在质外体区域观察到非常强的荧光信号，而在bbc突变体中，质外体的信号非常微弱。此外，与预期相符的是，在d36e(avrrpt2)处理的rps2突变体及d36e处理的col-0植物的质外体中几乎无荧光信号。因此，avrrpt2引起的ros主要产生于细胞质外体区域。前期的研究表明，在病原菌侵染植物后，细胞质外体区域的ros产生可以由nadph氧化酶(如rbohd，respiratory burst oxidase homologues d)和过氧化物酶(peroxidases)这两类酶介导。因此，我们利用能够抑制nadph氧化酶活性的化学抑制剂dpi(diphenylene iodonium)及能够抑制过氧化物酶活性的抑制剂sham(salicylhydroxamic acid)和叠氮化钠(nan3)来研究哪类酶主要参与了avrrpt2触发的ros的产生。如图3b，当共处理dpi与flg22和dex，而非sham或叠氮化钠时，不仅可以极大地减少pti引起的ros，而且由eti触发的ros也几乎完全丧失。进一步的研究发现，当我们在处理完flg22+dex引起pti的ros后，大概30-40min后(诱导起eti-ros前)再添加化学抑制剂时，也只有dpi，而非sham或叠氮化钠，能够完全阻止ros的产生(图3c)。上述结果表明nadph氧化酶介导eti触发的ros产生。前期报道表明nadph氧化酶rbohd参与病原菌引起的ros爆发，因此接下来我们想探索eti阶段触发的ros是否由rbohd介导。如图3d，当用荧光染料h2dcfda处理接完d36e(avrrpt2)的rbohd突变体时，在质外体区域几乎检测不到任何信号。因此，我们的结果表明，rbohd介导了eti触发的ros产生并且pti相关的prrs受体在这一过程中起到关键作用。我们接下来检测了rbohd的转录水平及蛋白水平变化，发现在col-0植物中d36e接种后可以促进rbohd的转录及蛋白水平的表达(图3e，f)，有趣的是，d36e(avrrpt2)引起了更强的rbohd的表达。而意外的是，d36e(avrrpt2)处理的bbc植物中rbohd的表达水平与col-0一致(图3e，f)。这些结果表明eti诱导rbohd的表达独立于prrs受体，但是rbohd的激活需要prrs受体。前期的研究已经报道pti信号中的bik1及cpks等几类激酶涉及到直接磷酸化rbohd进而介导ros的产生。因此我们检测了cpk4/5/6/11三突变体及bik1突变体中eti相关的ros产生情况，结果发现相较于col-0植物，bik1突变体中由eti触发的ros极大地下降，而cpk4/5/6/11突变体中没有明显地影响(图4)。这一结果暗示bik1是激活rbohd介导eti-ros产生的重要激酶。
[0369]
实施例4，eti上调bak1、bik1、mpk3和rbohd基因的表达
[0370]
如果prrs及其共受体对eti免疫至关重要，那么植物可能进化出一种机制使eti能够通过增强prrs或其共受体或其它pti通路组分从而增强植物免疫。为验证这一假说，我们通过实时荧光定量pcr(图5a和3e)及蛋白印迹(图5b和3f)分别在转录水平及蛋白水平检测了几个关键的pti核心组分，其中包括bak1、bik1、mpk3和rbohd。我们发现pti信号通路中的这些关键组分在d36e(只激活pti)处理下能诱导起一定水平的上调表达，而诱导eti的菌株d36e(avrrpt2)处理后能显著地诱导这些基因的更高表达。更为重要的是，bbc突变体在处理d36e(avrrpt2)菌株后，同样能诱导这些基因大幅度的上调，因此表明eti引起强烈的pti关键信号组分的表达并且此过程独立于prrs受体或共受体。avrrpt2引起的eti免疫反应的一个重要部分就是确保pti信号通路的关键组分(如prrs共受体和下游信号成分)的高水平表达，这与pti是eti的一个重要组成部分的结论一致。
[0371]
综上所述，我们的研究表明，pti相关的prrs受体或共受体对植物激发正常和高效的eti免疫至关重要，并且我们也揭示了之前未被发现的pti和eti通路之间的相互增强和依赖关系。我们的研究结果提出一种新的植物双层免疫的机制，在这一机制中，植物通过整合包含prrs-bik1-rbohd级联反应在内的pti机制作为eti不可或缺的一个重要的组成成分来激活强健的免疫输出。非常有趣的是，eti还可以强烈地增强pti上游信号通路的关键组分bak1、bik1、rbohd及mpk3的转录及蛋白水平的表达。前期的研究报道，植物中的pti信号在激活后会被自身的反馈机制负调节或者被致病性病原菌的效应因子所抑制。而植物的eti可以通过大幅度地恢复pti信号组分，进而成功克服由于植物自身的负反馈机制或者外源病原菌效应因子的抑制作用。我们的研究很好地诠释pti和eti的下游免疫反应存在很多相似性的原因和机制，同时这一重要的知识理论可能在未来农业中通过增强pti作为激活eti的一个通用策略来指导对抗农业生产上的病虫害影响提供依据。