柱锈菌科多基因谱系筛查方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及柱锈菌科多基因谱系筛查方法。

背景技术：

引起危害世界林木的三大真菌病害之一的松疱锈病的病原物由植物病原真菌柱锈菌科的物种组成。该科物种属于真菌界担子菌门(basidimycota)，柄锈菌纲(pucciniomycetes)，柄锈菌目(pucciniales)的柱锈菌科(cronartiaceae)科内。该科仅有两属，柱锈菌属(cronartium)和内柱锈菌属(endocronartium)。其中内柱锈菌属于2019年已划归柱锈菌内，目前整个科包含1属，共含种属36种。这些真菌对人工或自然松林威胁严重，一旦成灾就会造成巨大的经济损失和生态破坏。

因此，需要发现一种柱锈菌科(cronartiaceae)鉴定方法。

技术实现要素：

本发明一个目的是提供a)和/或b)所示的物质的应用。

本发明提供了a)和/或b)所示的物质在如下1)-6)至少一种功能或制备具有1)-6)至少一种功能的产品中的应用：

a)所示的物质为检测如下基因序列：its和lsu的物质；

b)所示的物质为记载现有柱锈菌科种属及各种属中its和lsu基因序列的可读载体；

1)鉴定或区分柱锈菌科种属；

2)鉴定或辅助鉴定待测病原菌是否为柱锈菌科；

3)鉴定或辅助鉴定待测病原菌属于哪种柱锈菌科种属；

4)对待测病原菌进行柱锈菌科种属归属；

5)对待测病原菌进行柱锈菌科种属聚类；

6)鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有柱锈菌科种属。

上述应用中，b)所示的物质中所述现有柱锈菌科种属及各种属中its和lsu基因序列来源于现有数据库中所有柱锈菌科种属模式和/或凭证模式的its和lsu基因序列；

或，b)所示的物质中所述现有柱锈菌科种属及各种属中its和lsu基因序列来源于现有数据库中所有柱锈菌科种属模式和凭证模式的its和lsu基因序列，以及，所述数据库中缺失的现有柱锈菌科种属中的its和lsu基因序列。

上述可读载体可以为光盘等任何可以记载现有柱锈菌科种属及各种属中its和lsu基因序列的硬件。

在本发明的实施例中，现有数据库中所有柱锈菌科种属模式和凭证模式的its和lsu基因序列为来源于ncbi的数据库中现有柱锈菌科种属及各种属中its和lsu基因序列；所述数据库中缺失的现有柱锈菌科种属中的its和lsu基因序列为采集的ncbi数据库中缺失现有柱锈菌科种属中的its和lsu基因序列。具体本发明实施例中，所述现有柱锈菌科种属为16个，对应的its和lsu基因序列及种属信息具体见实施例中的表1所示。

上述应用中，a)所示的物质包括特异捕获待测样本或待测病原菌中its和lsu基因的物质，还包括测序相关试剂或仪器。

上述应用中，所述特异捕获待测样本或待测病原菌中its和lsu基因的物质为用于扩增its和lsu基因的引物对，在本发明的实施例中如表2所示。

本发明另一个目的是提供一种具有1)-6)至少一种功能的产品。

本发明提供的产品为上述应用中的a)和/或b)所示的物质；

1)鉴定或区分柱锈菌科种属；

2)鉴定或辅助鉴定待测病原菌是否为柱锈菌科；

3)鉴定或辅助鉴定待测病原菌属于哪种柱锈菌科种属；

4)对待测病原菌进行柱锈菌科种属归属；

5)对待测病原菌进行柱锈菌科种属聚类；

6)鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有柱锈菌科种属。

本发明还有一个目的是提供如下方法：

本发明提供的一种检测或辅助检测待测样本中是否含有柱锈菌科种属的方法，包括如下1)-3)的步骤：

1)捕获待测样本基因组中的its和lsu基因，测序，得到待测样本中各个基因的序列；

2)将所述待测样本中各个基因的序列与上述第一个目的中的现有柱锈菌科种属对应的its和lsu基因构建系统发育树，若待测样本归属于所述系统发育树中某支，则该待测样本含有或候选含有该支对应的柱锈菌科种属；若待测样本不归属于所述系统发育树中任何支，则该待测样本不含有或候选不含有柱锈菌科。

本发明还提供了一种检测或辅助检测待测病原菌是否为柱锈菌科的种属的方法，包括如下1)-3)的步骤：

1)捕获待测病原菌基因组中的its和lsu基因，测序，得到待测病原菌各个基因序列；

2)将所述各个基因序列与上述现有柱锈菌科种属对应的its和lsu基因，构建系统发育树，

若待测病原菌归属于所述系统发育树中某支，则该待测病原菌为或候选为该支对应的柱锈菌科种属；若待测病原菌归不归属于所述系统发育树中任何支，则该待测病原菌不为或候选不为柱锈菌科。

本发明还提供了一种检测或辅助检测待测病原菌属于哪种柱锈菌科种属的方法，包括如下1)-3)的步骤：

1)捕获待测病原菌基因组中的its和lsu基因，测序，得到待测病原菌各个基因序列；

2)将所述各个基因序列与上述现有柱锈菌科种属对应的its和lsu基因构建系统发育树，

若待测病原菌归属于所述系统发育树中某支，则该待测病原菌为或候选为该支对应的柱锈菌科种属。

上述方法中，在所述方法中，在所述步骤2)后还包括如下结合同源性进行辅助判断的步骤(当进化树中不能判断时(如2个以上种属在进化树上地位相同)，结合同源性进行判断)：

将所述待测样本或所述待测病原菌its和lsu基因与所述现有柱锈菌科种属对应基因进行同源性比对，若至少2个基因的同源性与某种现有柱锈菌科种属对应基因的同源性均大于97％，则所述待测样本含有该种现有柱锈菌科种属或所述待测病原菌为该种现有柱锈菌科种属。

上述方法中，所述捕获待测病原菌基因组中的its和lsu基因为提取待测病原菌基因组dna，扩增its和lsu基因；

或所述捕获待测样本基因组中的its和lsu基因为提取待测样本基因组dna，扩增its和lsu基因。

上述方法中，无论是同源性比对还是构建系统发育树，均可以用现有的方法或软件，也可以用本发明实施例1中<基于blast的菌株dna条形码(柱锈菌科)鉴定系统>构建鉴定数据及其代码去实现。

本发明的实验证明，本发明采用its和lsu基因序列进行进化树的构建和同源性比对，能够检测柱锈菌科，在检疫口岸，能够对含有柱锈菌科真菌的样品进行快速准确筛查，防止病菌随种子及其它繁殖材料进出口、调运而传播蔓延，以保护我国农业生产的健康发展，具有重要的意义。

附图说明

图1为柱锈菌科多基因谱系分型筛查的基准数据库内种属的系统发育骨架树。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。值得指出的是，给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍应属于本发明保护范围。

实施例1、柱锈菌科多基因选择及其分型筛查数据库的构建及使用方法

一、柱锈菌科多基因选择及其分型筛查数据库的构建

1、柱锈菌科多基因选择

收集现有柱锈菌科种属的如下2种基因序列：its和lsu；

上述现有柱锈菌科种属2种基因序列可以来在于ncbi的数据库中的所有柱锈菌科种属模式和凭证模式的its和lsu基因序列；也可以来自采集的ncbi数据库中缺失现有柱锈菌科种属中的its和lsu基因序列。

在本发明的实施例中，采用的现有柱锈菌科种属中its和lsu基因序列如下表1所示。

2、构建数据库

上述1得到的源于ncbi的数据库和源于采集现有柱锈菌科种属的所有its和lsu基因序列及其对应的种属基本信息如下表1所示。

将上述信息采用中国科学院微生物研究所开发的<基于blast的菌株dna条形码(柱锈菌科)鉴定系统>构建鉴定数据库(计算机软件著作权登记号：2019sr1314189)，该数据库具备录入菌株或标本的dna条码序列及其他信息(种属名称、菌株编号、其他编号、是否模式、复合种群、寄主、采集地等)的功能，该数据库通过整合muscle、fasttree、phylo等软件实现序列联配、系统发育树构建等功能，依据柱锈菌科内种属的its、gapdh、chs-1、his3、act、tub2、cal、gs或apmat基因实现“序列输入→结果输出”的一站式种属鉴定。

构建该数据库的代码如下：

表1柱锈菌科及近缘科属内种属的序列

二、柱锈菌科多基因或其数据库鉴定待测病菌是否为柱锈菌科的方法建立1、获得待测病菌its和lsu的基因序列

提取待测病菌的基因组dna，分别用这3个基因的引物对(表2)进行pcr扩增，测序扩增产物，得到待测样本中its和lsu的基因序列。

表2引物列表

表2中第4列从上到下依次为序列1至序列8，其中如lsu基因用各种forward和各种reverse引物配对进行扩增，选择任意扩增出的产物进行下一步测序。

2、判断

将上述1得到的待测病菌的its和lsu的fasta基因序列与现有柱锈菌科种属的its和lsu这2个基因序列(在本发明的实施例中采用表1所示的基因序列)构建系统发育树(系统发育骨架树参考图1)，通过待测病菌归属于系统发育树的哪一支判断，该待测病菌为或候选为柱锈菌科中的哪个种属。

为了进一步准确判断，也可以结合如下同源性比对：将待测病菌这2个基因和现有的柱锈菌科的这2个基因序列(在本发明的实施例中采用表1所示的基因序列)进行同源性比对，若待测病菌这3个基因中至少its基因与某个现有柱锈菌科种属的对应基因的同源性均大于等于97％，则该待测病菌为该柱锈菌科种属。

上述构建系统发育树和上述同源性比对可以通过现有的软件完成，也可以通过上述一中构建数据库的代码的相关软件进行操作。

因此，可通过现有柱锈菌科种属中its和lsu这几个基因的序列来区分或鉴定柱锈菌科真菌的种属，或者鉴定待测病菌是否为柱锈菌科。

也可以通过上述方法检测或辅助检测待测样本中是否含有柱锈菌科种属的方法，包括如下1)-2)的步骤：

1)捕获待测样本基因组中的its和lsu基因，测序，得到待测样本中各个基因的序列；

2)将所述待测样本中各个基因的序列与现有柱锈菌科种属对应的its和lsu基因构建系统发育树，若待测样本归属于系统发育树中某支，则该待测样本含有或候选含有该支对应的柱锈菌科种属；若待测样本不归属于所述系统发育树中任何支，则该待测样本不含有或候选不含有柱锈菌科。

或，检测或辅助检测待测病原菌是否为柱锈菌科的种属的方法，包括如下1)-2)的步骤：

1)捕获待测病原菌基因组中的its和lsu基因，测序，得到待测病原菌各个基因序列；

2)将所述各个基因序列与现有柱锈菌科种属对应的its和lsu基因，构建系统发育树，

若待测病原菌归属于系统发育树中某支，则该待测病原菌为或候选为该支对应的柱锈菌科种属；若待测病原菌归不归属于所述系统发育树中任何支，则该待测病原菌不为或候选不为柱锈菌科。

实施例2、柱锈菌科种属凭证标本和菌株的多基因基准序列筛查数据库在鉴定待测病菌是否为柱锈菌科中的应用

1、获得待测病菌its和lsu的基因序列

以柱锈菌科内重要检疫种属油松疱锈病菌(cronartiumcoleosporioides)标本mich253346、北美松疱锈病菌(c.comandrae)标本mich253364、松疱锈病菌(c.ribicola)标本ny267053以及松芍柱锈菌(c.flaccidum)的标本hmas82784和栅锈菌科内落叶松杨栅锈菌melampsoralarici-populina标本hmas247968作为待测病菌。

分别提取柱锈菌科内6个待测标本和栅锈菌科内1个标本的基因组dna，分别用这3个基因的引物对(表2)扩增这2个基因，分别测序扩增产物，得到2个待测病菌的its和lsu这3个基因序列。

2、利用柱锈菌科多基因或其数据库来鉴定待测病菌是否为柱锈菌科

将上述1得到的2种待测病菌的its和lsu这2个基因序列的fasta与现有柱锈菌科种属的its和lsu这2个基因序列(在本发明的实施例中采用表1所示的基因序列)构建系统发育树，通过待测病菌归属于系统发育树的哪一支判断，该待测病菌为或候选为柱锈菌科中的哪个种属。

为了进一步准确判断，也可以将待测病菌这3个基因和现有的柱锈菌科的这2个基因序列(在本发明的实施例中采用表1所示的基因序列)进行同源性比对，若待测病菌这2个基因中至少its与某个现有柱锈菌科种属的对应基因的同源性均大于等于97％，则该待测病菌为该柱锈菌科种属。

在本发明的实施例中，上述构建系统发育树和同源性比对为直接输入实施例1制备的数据库的代码中。

结果如下：

待测柱锈菌科内油松疱锈病菌(cronartiumcoleosporioides)标本mich253346系统发育树中该菌与cronartiumcoleosporioides序列在同一分支，获得its(mk208284)和lsu(mk193824)，其中its序列与数据库中cronartiumcoleosporioides的its序列ay955828、ay955834、l76500、ay955835、l76511及l76513有100％的相似性，与数据库内其他科属种属相似度不高，该菌为柱锈菌科内种属。

待测北美松疱锈病菌(c.comandrae)标本mich253364系统发育树中该菌与c.comandrae的这些序列在同一分支，获得its(mk208293)和lsu(mk193825),其中its序列与数据库中cronartiumcoleosporioides的its序列mg806102、mg806113、l76483、u75985、l76481、l76487、l76486有100％的相似性，与数据库内其他科属种属相似度不高，该菌为柱锈菌科内种属。

待测松疱锈病菌(c.ribicola)标本ny267053系统发育树中该菌与系统发育树中与c.ribicola这些序列在同一分支，获得its(mk208298)和lsu(mk193829)，其与c.ribicola的its序列ku320184、hq317529、mh071421、dq445908、kf387533等有99％-100％的相似性，与数据库内其他科属种属相似度不高，该菌为柱锈菌科内种属。

松芍柱锈菌(c.flaccidum)的标本hmas82784系统发育树中该菌与系统发育树中与c.flaccidum这些序列在同一分支，获得its(mk208287)和lsu(mk193818)，与c.flaccidum的its序列ku320169、mh071411、ku320175、ku320171、kj959599、mh071409、mh071418有99％-100％的相似性，与数据库内其他科属种属相似度不高，该菌为柱锈菌科内种属。

待测栅锈菌科内落叶松杨栅锈菌(melampsoralarici-populina)标本hmas247968在系统发育树上不归属于柱锈菌科内种属的任何一支，但归于栅锈菌科内；获得its序列(mk028576)和lsu序列(mk064523)，其its序列与数据库中柱锈菌科内种属的相似度为92％-94％，lsu序列与数据库中柱锈菌科内种属的相似度为79％-94％,依据序列相似度及系统发育分析，该菌不是柱锈菌科内真菌。

综上所述，本发明的方法可以成功判断待测病菌是否为柱锈菌科，且可以判断待测病菌具体为哪个柱锈菌科种属。

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