与新型冠状病毒的抗体有效结合的表位

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及与新型冠状病毒(sars-cov-2) 的抗体有效结合的表位。


背景技术：

2.新型冠状病毒sars-cov-2作为新发的突发传染病病原，目前还没有 针对该病毒的特效药物获批上市。
3.治疗性抗体药物不但在肿瘤和自身免疫疾病方面占有重要地位，在传 染性疾病的治疗中也同样有效。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药 物有预防小儿呼吸道合胞病毒(rsv)感染的帕利珠单抗(synagis)，治疗 hiv感染的艾巴利珠单抗(trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的 rabishield。同时还有针对众多病毒的单克隆抗体处于临床研究的不同阶段 (https：//clinicaltrials.gov/)。
4.sars-cov-2属于冠状病毒。同属冠状病毒的重症急性呼吸综合征冠 状病毒(sars-cov)以及中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)也曾 在分别在2002-2003年和2012年引发疫情。据世界卫生组织(who)统 计sars-cov共引发8000人感染，794人死亡(https：//www.who.int/)。 自2012年至今，mers-cov感染病毒病例在持续增加，截至2019年底， 全球确诊2499例感染病例，861例死亡病例。2020年1月12日，世界卫 生组织正式命名了
″
2019新型冠状病毒(2019-ncov)
″
，其后在2020年2 月11-12日国际病毒分类委员会(international committee on taxonomy ofviruses，ictv)宣布，新型冠状病毒(2019-ncov)的正式分类名为严重 急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， sars-cov-2)，世界卫生组织(who)同日在日内瓦举办全球研究和创 新论坛上宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为
″
covid-19
″
。
[0005][0006]
病毒要感染细胞，首先需要通过囊膜蛋白结合宿主的受体。抗体，尤 其是中和活性抗体，通过结合到囊膜蛋白上，阻断病毒与细胞受体的结合， 从而阻断病毒感染。同时，抗体结合到囊膜蛋白上，从而对游离的病毒或 是被感染的细胞进行标记，通过抗体的fc区募集巨噬细胞或是补体等免 疫细胞和免疫分子，从而清除游离的病毒以及被感染的细胞。因此，靶向 受体结合区(rbd)的抗体，不但具有中和病毒感染的活性，还可以通过 fc区发挥作用，促进病毒以及被感染细胞的清除。
[0007]
基于对其它冠状病毒，尤其是sars-cov和mers-cov的研究，与 受体结合的重要囊膜蛋白是刺突蛋白(s)。s可进一步分为s1和s2两部 分。s2的作用是介导膜融合。s1的n端(ntd)和c端(ctd)都可能 是rbd。通过对sars-cov-2的研究，团队发现ctd是此冠状病毒的rbd， 结合受体ace2。
[0008]
抗原表位由连续序列(蛋白质一级结构)或不连续的蛋白质三维结构组 成，这些氨基酸决定了特殊化学基团的抗原性，也称为抗原表位。抗原表 位主要存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，只有经过酶 或其他方法处理后才能暴露。一种天然抗
原物质可能有多个表位。抗原分 子越大，决定簇的数量就越多。
[0009]
抗原分子的b细胞表位大小不同，有些表位由以线性排列方式彼此相 邻排列的氨基酸组成，因此被称为线性或连续表位。还有一些表位的氨基 酸残基在一级结构上互不相邻，但在蛋白质折叠过程中，这些氨基酸在2 级结构和3级结构上彼此接近，形成可被抗体识别的结构，这样的表位被 称为空间表位或构象表位。球蛋白是一个具有三维空间的折叠肽链，因此 它的大多数表位都隐藏在里面，这可以称为隐性表位。只存在于蛋白表面 的表位可以被免疫细胞识别被称为功能表位。已经证明抗原分子的抗原性 是由其表位的氨基酸序列、空间构型决定的。
[0010]
表位决定了蛋白的免疫原性，也决定了免疫球蛋白及其他多肽结合抗 原的具体位置和亲和力强弱；通过表位的鉴定，可以找到最有效的抗体结 合位点，也可以为疫苗设计提供准确的理论支持。


技术实现要素：

[0011]
发明人先前获得了能阻断sars-cov-2rbd与ace2结合的单克隆抗 体cb6(参见专利申请202010114283.8(2020年2月24日提交))。在本发 明中，发明人通过不同结晶条件筛选，获得了sars-cov-2 rbd与cb6 fab 的复合物晶体。利用x射线衍射技术，解析了cb6与sars-cov-2 rbd 结合的位点和关键相互作用氨基酸；通过与sars-cov-2 rbd和ace2 结构数据比较，阐明了cb6发挥阻断功能的机制，并鉴定出关键的结合表 位seq id no：1-6，即单克隆抗体cb6通过与sars-cov-2 rbd上的结 合表位seq id no：1-6结合阻断了sars-cov-2与ace2之间的结合。
[0012]
具体地，在一个方面，本发明提供分离的肽，其氨基酸序列如seq idno：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5或 seq id no：6所示。
[0013]
在一个方面，本发明提供试剂盒，其包含选自由如seq id no：1、seqid no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6 所示的氨基酸序列组成的组中的一个或更多个(例如6个)。
[0014]
在一个方面，本发明提供抗体，其结合选自由如seq id no：1、seqid no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6 所示的氨基酸序列组成的组中的一个或更多个(例如6个)。该抗体可以结 合sars-cov-2 rbd的蛋白，用于预防和治疗冠状病毒感染。
[0015]
本说明书中提及的所有文献均通过引用以其整体并入本文。
附图说明
[0016]
图1：sars-cov-2rbd蛋白制备；
[0017]
图2：cb6抗体制备；
[0018]
图3：cb6抗体阻断sars-cov-2rbd与hek293t-hace2结合；
[0019]
图4：cb6抗体与sars-cov-2rbd复合物筛选；
[0020]
图5：cb6抗体与sars-cov-2rbd晶体结构；
[0021]
图6：cb6抗体与sars-cov-2rbd关键氨基酸的相互作用；
[0022]
图7：cb6抗体及hace2与sars-cov-2rbd竞争结合氨基酸的关 系。
具体实施方式
[0023]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实 施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0024]
实施例1：sars-cov-2 rbd及cb6抗体的表达与纯化
[0025]
在sars-cov-2 rbd蛋白(氨基酸序列如seq id no：7所示，其为 sars-cov-2 s1全长(数据库编号：epi_isl_402119)的319-541位)编 码区的3’端连上6个组氨酸标签(hexa-his-tag)的编码序列及翻译终止密码 子，通过连接ecori和xhoi构建入pfastbac1载体(购自invitrogen)中。 再将连接产物转化到dh10bac感受态细胞(购自tiangen)中，进行杆状病 毒重组。提取重组的杆状病毒，转染至sf9细胞(购自invitrogen)中进行杆 状病毒的包装，再经过病毒的扩增，加入到hi5细胞(购自invitrogen)中， 进行sars-cov-2 rbd蛋白的表达。
[0026]
含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(histraptmhp(ge)) 和凝胶过滤层析(superosetm 6increase 10/300gl(ge))纯化后，可以获 得较纯的目的蛋白。sds-page鉴定大小为30kd，即为sars-cov-2 rbd 蛋白，结果如图1。
[0027]
以含10％fbs的dmem培养293t细胞。将含有专利申请 202010114283.8(2020年2月24日提交)中的cb6抗体轻、重链(cb6抗体 轻、重链的氨基酸序列分别如seq id no：8和seq id no：9所示)的编码 基因克隆至表达载体pcaggs(购自addgene)，转染293t。转染4-6小时 后将细胞培养液更换成无血清的dmem，并且继续培养3天，收集上清 后，再补加dmem，继续培养4天，收集上清。收集的上清经过5000rpm 离心30min后，与含有20mm磷酸钠(ph 8.0)的缓冲液等体积混合，经过 0.22μm滤膜过滤后，与protein a预装柱结合(5ml，ge healthcare)。以 10mm甘氨酸(ph 3.0)洗脱结合的蛋白。收集此蛋白浓缩后进行分子筛层析。 目的峰通过sds-page(还原性和非还原性)确定，结果如图2。得到纯化 的cb6抗体。
[0028]
实施例2：cb6阻断sars-cov-2 rbd与ace2结合的检测
[0029]
将hace2(氨基酸序列如seq id no：10所示)的编码基因通过xhoi 和bamhi构建入pegfp-n1载体(购自addgene)中，并且与gfp融合表达， 形成pegfp-hace2质粒。将质粒pegfp-hace2转染hek293t细胞，24h 可在荧光显微镜下观察到gfp表达，得到hek293t-hace2细胞，2x105个细胞为一个反应，与sars-cov-2 rbd(200ng/ml)在室温条件下孵育 30min。500xg离心5min后，去掉上清，加入pbs洗2次。与anti-his/apc (购自miltenyi)在室温下孵育30min，再经过pbs洗2次后，用bdfacscanto检测细胞表面的荧光情况。
[0030]
为了检测cb6的阻断效果，将实施例1得到的纯化的cb6抗体(阴性 对照用无关抗体4c1(专利申请201810816866.8))与200ng/ml的 sars-cov-2 rbd按摩尔比10∶1的条件下在室温下孵育1h，再与 hek293t-hace2细胞孵育。其余步骤与上面相同，用anti-his/apc(购 自miltenyi)检测蛋白与细胞的结合情况。无关抗体4c1不能阻断 sars-cov-2 rbd与hek293t-hace2细胞的结合，结果如图3(左图)所示。 cb6抗体阻断sars-cov-2 rbd与hek293t-hace2细胞的结合情况如图 3(右图)所示。可见，cb6抗体均能阻断sars-cov-2 rbd与 hek293t-hace2细胞的结合。
[0031]
实施例3：cb6与sars-cov-2 rbd晶体筛选
[0032]
将实施例1得到的纯化的cb6抗体利用木瓜蛋白酶(购自thermo， 20341)酶切后得到cb6抗体的fab片段，将上述获得的cb6抗体的fab 片段与sars-cov-2 rbd抗原，按摩尔比
4、seq id no：5或seq id no：6)，能够有效结合抗体，并发挥阻断 sars-cov-2 rbd和hace2结合的能力。
[0040]
表2：sars-cov-2 rbd与抗体cb6及受体hace2相互作用位点
[0041]
[0042][0043]
注：cb6抗体序列中，斜体为轻链氨基酸、正体为重链氨基酸。
[0044]
sars-cov-2 rbd的氨基酸序号以sars-cov-2 s1全长的氨基酸(seq id no：11)顺序汁算。
[0045]
通过pdb检索，获取sars-cov-2 rbd与hace2的复合物晶体结构 (pdb：6lzg)，利用pymol软件align功能，将该结构与之前获得cb6 与sars-cov-2 rbd的复合物晶体结构进行比较，作出相应结构图，如图 7所示。利用以上步骤获得的图片与数据，阐述cb6抗体的阻断机制。
[0046]
综上，cb6抗体能够与sars-cov-2 rbd关键氨基酸结合，有效阻 断sars-cov-2 rbd与hace2的结合，达到治疗和预防sars-cov-2感 染的效果。
[0047]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行 了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已， 并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。