转录调控因子TR2的突变体在制备维生素B12中的应用的制作方法

本申请是申请号为202010012114.3，申请日为2020年1月7日，发明名称为“转录调控因子和其突变体及其在制备维生素b12中的应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及转录调控因子tr2的突变体在制备维生素b12中的应用。

背景技术：
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维生素b12(vb12)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是b族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基(r基团)种类不同，维生素b12可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素b12参与了大量的生化反应过程包括dna的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。

由于维生素b12分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素b12的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。

目前，国内外针对维生素b12生产菌生物合成维生素b12的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括ph和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb基因来增加细胞生产维生素b12的能力(程立芳等,不同来源的尿卟啉原iii转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素b12的影响.工业微生物，2017，第47卷第3期)。

微生物拥有一系列通过调节自身基因的表达来使生物体适应不同环境的机制。在基因表达过程中，一种称为转录调控因子的蛋白质分子通过结合在特定的dna区域调节特定基因的表达。然而，在产维生素b12菌种中哪个转录调控因子影响维生素b12的产量尚未见到报道。

技术实现要素：
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本发明人前期筛选出了一株高产维生素b12的苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638菌株(cn104342390a)，可发酵生产维生素b12。通过对其进行诱变，获得产维生素b12能力提高的诱变菌株，再挖掘分析其中能够增加产维生素b12的能力转录调控因子，本发明其中两个转录因子tr1和tr2有重要影响，因而做了进一步研究，最终完成本发明，而提供两个转录调控因子和其突变体，以及它们制备维生素b12中的应用。

因此，本发明首先提供一种转录调控因子基因tr1或tr2，其编码的多肽氨基酸序列分别如seqidno.5或7所示。

优选地，其核苷酸序列分别如seqidno.1或3所示。

进一步本发明提供所述的转录调控因子基因编码的多肽。

另外，本发明还提供一种转录调控因子tr1的突变基因，其编码的多肽氨基酸序列在seqidno.5所示的氨基酸序列上具有第117位氨基酸替换v的突变，优选的其核苷酸序列如seqidno.2所示；同时，提供一种转录调控因子tr2的突变基因，其在seqidno.7所示的氨基酸序列上具有第235位氨基酸替换为f的突变，优选地核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明还提供上述的转录调控因子的突变基因编码的多肽。

本发明还提供转录调控因子tr1或tr2的编码基因在制备维生素b12中的应用。

在具体实施方式中，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达，其中导入的编码基因位于质粒或染色体上。

优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有cgmccno.9638保藏号的菌株。

在一个具体实施方式中，所述转录调控因子tr1的编码基因编码具有seqidno：5、或seqidno：6所示氨基酸序列的多肽；所述转录调控因子tr2的编码基因编码具有seqidno：7、或seqidno：8所示氨基酸序列的多肽。

优选地，所述转录调控因子tr1的编码基因具有seqidno：1、或seqidno：2所示核苷酸序列；所述转录调控因子tr2的编码基因编码具有seqidno：3、或seqidno：4所示核苷酸序列。

本发明还提供一种制备维生素b12的方法，其包括培养过表达转录调控因子的编码基因的基因工程菌，并从发酵液中收集维生素b12的步骤，其中所述编码基因编码具有seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、或seqidno：8所示氨基酸序列的多肽。

在具体实施方式中，所述基因工程菌为苜蓿中华根瘤菌。优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有cgmccno.9638保藏号的菌株。

通过对多个转录因子的研究，表明其中转录因子基因tr1和tr2及其突变体基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，不仅对基因工程菌生物安全(菌内过表达未对菌体的生长造成影响)，同时可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素b12的能力。实验数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，过表达转录因子tr1和其突变，可提高产维生素b12的能力达12.8％和19.2％；过表达转录因子tr2和其突变，可提高产维生素b12的能力15.4％和20.5％。因此，对于制备维生素b12具有较高的应用价值。

附图说明

图1：质粒载体pbbr-p21-tr1的图谱。

图2：质粒载体pbbr-p21-tr2的图谱。

图3：质粒载体pbbr-p21-tr3的图谱。

图4：质粒载体pbbr-p21-tr4的图谱。

图5：质粒载体pbbr-p21-tr5的图谱。

图6：维生素b12的标准曲线图。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

1、培养基配方：

lb培养基(g/l)：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。

种子培养基(g/l)：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(nh4)2so41，(nh4)2hpo42，mnso4·h2o0.8，cocl2·6h2o0.02，mgo0.3，dmbi0.01，znso4·7h2o0.01，caco31.5,ph通过naoh控制在7.0～7.4。

发酵培养基(g/l)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(nh4)2so42，mgso41.5,k2hpo40.75，cocl2·6h2o0.14,dmbi0.075，znso4·7h2o0.08，caco31，ph通过naoh控制在7.0～7.4。

2、检测方法

(1)样品预处理

取1ml发酵液，加入8％的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25ml摇匀，置于95～100℃水浴中30-40min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl2％的nacn(w/v)至1ml的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。

(2)标准品的制备

配置梯度维生素b12标准品(20mg/l，50mg/l，100mg/l，150mg/l)。

(3)hplc检测条件

c18-250a柱(agilent，4.6mmid9×250mm，5μm)。流动相为70％有机相(乙腈)和30％无机相(乙酸钠水溶液)，吸收波长为361nm，柱温为35℃，流速0.8ml/min，进样量20μl。

(4)维生素b12标准曲线的绘制

将不同浓度的标准品按上述条件进行hplc检测，绘制峰面积a-vb12浓度标准曲线。以测得的峰面积a为纵坐标，维生素b12质量浓度c(mg/l)记为横坐标，绘制维生素b12标准曲线。见图6，得回归方程y＝19.846x-80.857，r²＝0.999，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据维生素b12标准曲线计算样品产量。

实施例1：常压室温等离子体(artp)诱变时间的确定、突变体库的构建及高产菌种的获得

(1)致死率的测定

为了获得一个比较广的突变体库，我们对底盘细胞苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638进行了常压室温等离子体(artp)诱变。首先，对等离子诱变条件下cgmccno.9638的致死率进行测定。将种子用lb培养基培养至对数中期的cgmccno.9638细胞(od600＝1)用0.85％nacl溶液冲洗两遍，然后用0.85％nacl溶液稀释成10⁸个细胞/ml的悬液。取10ul悬液均匀的涂布在铁片上，进行artp诱变，诱变时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、25s，每个诱变时间点2个重复，每个时间点的涂板3个重复。诱变后将带有细胞的铁片置于1ml无菌水中漩涡震荡洗下细胞，将细胞悬液10倍梯度稀释至10^-3，取稀释后的细胞悬液100μl涂lb培养基平板，30℃培养72h后统计菌落数。根据下列公式计算不同诱变时间下的致死率，以诱变时间为横坐标，不同诱变时间下的致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。致死率的计算公式为：致死率(％)＝[(诱变0s菌落数－诱变ns菌落数)/诱变0s菌落数]×100％，其中n＝5、10、15、20、25。

从表1中可知，诱变10s时的致死率为82.2％，诱变15s时的致死率达到95％以上，致死率为80％-90％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择10s作为最终构建突变体库的诱变时间。

(2)突变体库的构建及筛选

取浓度为10⁸个/ml的细胞悬液10ul涂布于铁片上进行artp诱变，诱变时间为10s，共对3个铁片上的细胞进行诱变处理，诱变结束后，将这3个铁片上的细胞在含有1mllb培养基的1.5ml离心管中涡旋振荡重悬。将细胞悬液10倍梯度稀释至10^-3，取稀释后的细胞悬液100μl涂lb培养基平板，30℃培养72h，长出270个单菌落。

(3)突变株96深孔板发酵初筛

分别挑取平板上的所有单菌落接种于含有500ul的种子培养基的96深孔板中(每个孔板上包含6株对照菌株cgmccno.9638)，30℃、800rpm、80％湿度振荡培养36h后，按10％(v/v)接种量转接含有450ul发酵培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养120h后检测维生素b12产量。

(4)突变株96深孔板发酵复筛

将步骤(3)中产量排前30的株菌的单菌落(包含一个对照菌株cgmccno.9638)接种于含有500ul种子培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80％湿度振荡培养36h后，按10％(v/v)接种量转接含有450ul发酵培养基的96深孔板中(每株菌3个平行)，30℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养120h后检测维生素b12产量。

重复步骤(3)和(4)三次，最后获得一株高产维生素b12的菌种sm*，96孔板中产量从50mg/l提高到80mg/l，是底盘菌株产量的1.6倍。

实施例2：突变菌株与出发菌株进行比较基因组分析

将菌种sm*和出发菌株cgmccno.9638送金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序。通过比较两个菌株的全基因组序列发现有5个转录调控因子发生了点突变，见表2。为了验证突变位点对维生素b12产量的影响，我们将突变后的转录调控因子基因在出发菌种cgmccno.9638中进行了过量表达。

实施例3：质粒载体的构建

1、pbbr-p21-tr1的构建

分别利用表3的引物对p21-xbai-f和p21-r，以ensiferadhaerenscasidaa(黏着剑菌)基因组为模板，通过pcr扩增，引入xbai酶切位点，得到启动子p21片段，经电泳验证，用限制性内切酶dpni(neb公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的p21片段。p21启动子序列如seqidno.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.x的专利文件中。

分别利用表3的引物对tr1-f和tr1-ecori-r，以cgmccno.9638基因组为模板，通过pcr扩增，引入ecori酶切位点，得到tr1片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的tr1片段。tr1基因序列如seqidno.1所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.5所示。

然后，利用引物对p21-xbai-f和tr1-ecori-r，以纯化的p21片段和tr1片段为模板，通过融合pcr，得到p21-tr1片段(含xbai和ecori酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的p21-tr1片段。

将上述纯化的p21-tr1片段和pbbr1mcs2质粒分别用xbai和ecori进行双酶切，将p21-tr1片段的双酶切产物与pbbr1mcs2质粒双酶切的产物经过t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-p21-tr1。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-p21-tr1备用，质粒图谱如图1所示。

2、pbbr-p21-tr1(c350t)的构建

以菌种sm*基因组为模板用于获得tr1(c350t)片段(如seqidno：2所示核苷酸序列，氨基酸序列如seqidno：6所示)，按照pbbr-p21-tr1的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pbbr-p21-tr1(c350t)。

3、pbbr-p21-tr2的构建：

分别利用表3的引物对p21-xbai-f和p21-r2，以ensiferadhaerenscasidaa(黏着剑菌)基因组为模板，通过pcr扩增，引入xbai酶切位点，得到启动子p21-2片段，经电泳验证，用限制性内切酶dpni(neb公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的p21-2片段。p21启动子序列如seqidno.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.x的专利文件中。

分别利用表3的引物对tr2-f和tr2-ecori-r，以cgmccno.9638基因组为模板，通过pcr扩增，引入ecori酶切位点，得到tr2片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的tr2片段。tr2基因序列如seqidno.3所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.7所示。tr2基因为rbsr基因。

然后，利用引物对p21-xbai-f和tr2-ecori-r，以纯化的p21-2片段和tr2片段为模板，通过融合pcr，得到p21-tr2片段(含xbai和ecori酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的p21-tr2片段。

将上述纯化的p21-tr2片段和pbbr1mcs2质粒分别用xbai和ecori进行双酶切，将p21-tr2片段的双酶切产物与pbbr1mcs2质粒双酶切的产物经过t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-p21-tr2。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-p21-tr2备用，质粒图谱如图2所示。

4、pbbr-p21-tr2(c703t)的构建

以菌种sm*基因组为模板用于获得tr2(c703t)片段(如seqidno：4所示核苷酸序列，氨基酸序列如seqidno：8所示)，按照pbbr-p21-tr2的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pbbr-p21-tr2(c703t)。

5、pbbr-p21-tr3的构建

分别利用表3的引物对p21-xbai-f和p21-r3，以ensiferadhaerenscasidaa(黏着剑菌)基因组为模板，通过pcr扩增，引入xbai酶切位点，得到启动子p21-3片段，经电泳验证，用限制性内切酶dpni(neb公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的p21-3片段。p21启动子序列如seqidno.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.x的专利文件中。

分别利用表3的引物对tr3-f和tr3-ecori-r，以cgmccno.9638基因组为模板，通过pcr扩增，引入ecori酶切位点，得到tr3片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的tr3片段。tr3基因序列如seqidno.10所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.11所示。

然后，利用引物对p21-xbai-f和tr3-ecori-r，以纯化的p21-3片段和tr3片段为模板，通过融合pcr，得到p21-tr3片段(含xbai和ecori酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的p21-tr3片段。

将上述纯化的p21-tr3片段和pbbr1mcs2质粒分别用xbai和ecori进行双酶切，将p21-tr3片段的双酶切产物与pbbr1mcs2质粒双酶切的产物经过t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-p21-tr3。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-p21-tr3备用，质粒图谱如图3所示。

6、pbbr-p21-tr3(g575a)的构建

以菌种sm*基因组为模板用于获得tr3(g575a)片段(如seqidno：12所示核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如seqidno.13所示)，按照pbbr-p21-tr3的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pbbr-p21-tr3(g575a)。

7、pbbr-p21-tr4的构建

分别利用表3的引物对p21-xbai-f和p21-r4，以ensiferadhaerenscasidaa(黏着剑菌)基因组为模板，通过pcr扩增，引入xbai酶切位点，得到启动子p21-4片段，经电泳验证，用限制性内切酶dpni(neb公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的p21-4片段。p21启动子序列如seqidno.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.x的专利文件中。

分别利用表3的引物对tr4-f和tr4-ecori-r，以cgmccno.9638基因组为模板，通过pcr扩增，引入ecori酶切位点，得到tr4片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的tr4片段。tr4基因序列如seqidno.14所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.15所示。

然后，利用引物对p21-xbai-f和tr4-ecori-r，以纯化的p21-4片段和tr4片段为模板，通过融合pcr，得到p21-tr4片段(含xbai和ecori酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的p21-tr4片段。

将上述纯化的p21-tr4片段和pbbr1mcs2质粒分别用xbai和ecori进行双酶切，将p21-tr4片段的双酶切产物与pbbr1mcs2质粒双酶切的产物经过t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-p21-tr4。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-p21-tr4备用，质粒图谱如图4所示。

8、pbbr-p21-tr4(g734a)的构建

以菌种sm*基因组为模板用于获得tr4(g734a)片段(如seqidno：16所示核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如seqidno.17所示)，按照pbbr-p21-tr4的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pbbr-p21-tr4(g734a)。

9、pbbr-p21-tr5的构建：

分别利用表3的引物对p21-xbai-f和p21-r5，以ensiferadhaerenscasidaa(黏着剑菌)基因组为模板，通过pcr扩增，引入xbai酶切位点，得到启动子p21-5片段，经电泳验证，用限制性内切酶dpni(neb公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的p21-5片段。p21启动子序列如seqidno.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.x的专利文件中。

分别利用表3的引物对tr5-f和tr5-ecori-r，以cgmccno.9638基因组为模板，通过pcr扩增，引入ecori酶切位点，得到tr5片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的tr5片段。tr5基因序列如seqidno.18所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.19所示。

然后，利用引物对p21-xbai-f和tr5-ecori-r，以纯化的p21-5片段和tr5片段为模板，通过融合pcr，得到p21-tr5片段(含xbai和ecori酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的p21-tr5片段。

将上述纯化的p21-tr5片段和pbbr1mcs2质粒分别用xbai和ecori进行双酶切，将p21-tr5片段的双酶切产物与pbbr1mcs2质粒双酶切的产物经过t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-p21-tr5。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-p21-tr5备用，质粒图谱如图5所示。

10、pbbr-p21-tr5(a632g)的构建

以菌种sm*基因组为模板用于获得tr5(a632g)片段(如seqidno：20所示核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如seqidno.21所示)，按照pbbr-p21-tr5的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pbbr-p21-tr5(a632g)。

表3引物表

实施例4：含质粒载体菌株的构建

将实施例3中的11个质粒pbbr1mcs2、pbbr-p21-tr1、pbbr-p21-tr1(c350t)、pbbr-p21-tr2、pbbr-p21-tr2(c703t)、pbbr-p21-tr3、pbbr-p21-tr3(g575a)、pbbr-p21-tr4、pbbr-p21-tr4(g734a)、pbbr-p21-tr5、pbbr-p21-tr5(a632g)按照如下方法转入苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638中：

(1)接种新活化的苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638、大肠杆菌(含有相应的质粒)以及辅助载体mt616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到od值为1.0左右；

(2)无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638的菌液、mt616和大肠杆菌的菌液各500μl转移至1.5ml无菌ep管中并在4℃，12,000rpm条件下离心1min。

(3)在无菌条件下弃掉上清液，并用1ml0.85％的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。

(4)再次在4℃，12,000rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。

(5)分别采用500μl新鲜的lb液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和mt616的沉淀进行悬浮。

(6)分别取各2μl的三种菌液，滴在不添加抗性的lb固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。

(7)待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。

(8)挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。

(9)从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落pcr验证。得到阳性苜蓿中华根瘤菌:sm/pbbr(对照菌)、sm/pbbr-p21-tr1(简写为sm1)、sm/pbbr-p21-tr1(c350t)(简写为sm1*)、sm/pbbr-p21-tr2(简写为sm2)、sm/pbbr-p21-tr2(c703t)(简写为sm2*)、sm/pbbr-p21-tr3(简写为sm3)、sm/pbbr-p21-tr3(g575a)(简写为sm3*)、sm/pbbr-p21-tr4(简写为sm4)、sm/pbbr-p21-tr4(g734a)(简写为sm4*)、sm/pbbr-p21-tr5(简写为sm5)、sm/pbbr-p21-tr5(a632g)(简写为sm5*)。

实施例5：不同菌株评价

1、苜蓿中华根瘤菌的培养条件：

将对照菌、sm1、sm1*、sm2、sm2*、sm3、sm3*、sm4、sm4*、sm5和sm5*共11株菌在无菌条件下用接种针在含100mg/l卡那霉素的lb固体培养基上划线，30℃恒温静置48h培养，获得单菌落。用接种针挑取单菌落于装有5ml含有100mg/l卡那霉素的lb液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养36h。将种子培养基按照10％比例接种至含有100mg/l卡那霉素的30ml发酵培养基中(250ml摇瓶)。30℃震荡(220r/min)培养144h后收集菌体并检测产量。摇瓶发酵每个实验做3个平行。

2、不同苜蓿中华根瘤菌菌株产vb12能力和生物量的比较

其结果如表4所示。

从表4中可以看出，sm1、sm1*、sm2和sm2*四个菌株与对照菌相比生产维生素b12的能力均得到提高。其中sm1提高12.8％，sm1*提高19.2％，sm2提高15.4％，sm2*提高20.5％。而其他几株工程菌生产维生素b12的能力有不同程度的降低。结果说明本发明中的过量表达转录调控因子tr1、tr2和它们的突变体的苜蓿中华根瘤菌生产维生素b12的能力得到了增强。并且各菌株生物量变化不大，说明各转录调控因子基因的过表达未对菌体的生长造成影响。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>转录调控因子tr2的突变体在制备维生素b12中的应用

<160>37

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>441

<212>dna

<213>sinorhizobiummeliloti

<400>1

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<212>dna

<213>sinorhizobiummeliloti

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<213>sinorhizobiummeliloti

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<213>sinorhizobiummeliloti

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<210>6

<211>146

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<213>sinorhizobiummeliloti

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<212>prt

<213>sinorhizobiummeliloti

<400>7

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<210>8

<211>346

<212>prt

<213>sinorhizobiummeliloti

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<213>sinorhizobiummeliloti

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<213>sinorhizobiummeliloti

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<213>人工序列引物

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<213>人工序列引物

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<213>人工序列引物

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<213>人工序列引物

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<213>人工序列引物

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