一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法与流程

本发明涉及原生质体分离技术领域，具体涉及一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法。

背景技术：

八仙花又名绣球、紫阳花，为虎耳草科八仙花属植物，是常见的盆栽观赏花木。由于八仙花的粉色花瓣在不同的栽培条件下可变为紫色或蓝色，从而大大提高了其观赏价值和商业价值，研究发现这是由于八仙花花萼片的着色细胞液泡的生理生化状态不同而导致的。八仙花不同于其它观赏植物的着色层位于花瓣表皮，八仙花萼片的着色细胞位于表皮下层，与无色叶肉细胞位于同一组织中，所以仅靠机械分离不仅难以区分无色及着色细胞，不能对着色细胞在基因水平、蛋白水平和代谢等水平做更精细的研究，还会造成着色细胞失活和花色降解等状况发生，更不利于对着色细胞的后续研究。

目前酶解提取原生质体时大都选择组织疏松、细胞间空间较大的组织作为材料，从而使得酶解液能够浸入，使纤维素酶能够将细胞从组织上游离下来，能破除胞壁纤维素，果胶酶也能及时分解果胶。并且去除细胞壁后荧光染料等物质也能更易进入植物细胞中，能够更好的分析细胞微环境对细胞形成、生长、发育的影响。但是八仙花萼片的组织质密紧实，酶液不易浸入，单纯靠普通的处理方法并不能获得足量的原生质体。因此，发明人发明了一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法。

技术实现要素：

基于以上问题，本发明提供一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法，本发明能有效提取出八仙花萼片中的着色细胞原生质体，为进一步对八仙花萼片中的着色细胞的研究奠定了基础。

为解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：

一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法，包括以下步骤：

s1：处理八仙花萼片

将八仙花的花簇采下，插入水中，在冰箱冷藏室4℃冷藏1～2小时，取0.5g冷藏后的萼片，用尖头镊子分离萼片的表皮与叶肉；

s2：酶解

将步骤s1中的萼片的叶肉迅速放入10ml酶解液中酶解，其中酶解液的组成成分包括25mmmes-trisph＝6.3、6％纤维素酶、0.6％离析酶、0.6m甘露醇、1mmcacl2和0.1％bsa；酶解方式如下：先配制25mmmes-trisph＝6.3、6％纤维素酶、0.6％离析酶和0.6m甘露醇的溶液，并将上述溶液放入55℃恒温水浴锅中水浴10min，激发酶的活性，并使甘露醇充分溶解；待上述溶液自然冷却后再向上述溶液中加入1mmcacl2和0.1％bsa，并混匀；然后取上述溶液10ml转入离心管中，再将经步骤s1处理之后的萼片的叶肉放入离心管中，之后抽真空至萼片的叶肉不再悬浮于酶解液的表面后，将离心管放入恒温震荡培养箱中，于30rpm28℃暗孵育3h；

s3：纯化

将经步骤s2处理之后的酶解混合物用200目网筛过滤，将过滤后所得的液体放入低温离心机中于4℃70g离心5min，弃上清，用w5洗液轻轻吹打清洗离心后的沉淀物，并重复上述离心过程两次；w5洗液的组成成分如下：54mmnacl，125mmcacl2，5mmkcl，ph＝6.02mmmes-tris；

s4：储存

向经步骤s3处理后的沉淀物中滴入100μl储存液，4℃避光保存，备用；所用储存液的组成成分如下：20mmph＝6.0mes-tris，0.6m甘露醇，2mmmgso4，5mmegta，10mmkcl，2％甘油。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明专门针对八仙花萼片的组织质密紧实、酶液不易浸入的特点，利用温和的酶解反应，在不损害八仙花萼片的细胞活性的条件下有效的提取出了八仙花萼片着色细胞原生质体，并且能清晰准确的辨别解离出的细胞颜色，为有针对性的对八仙花萼片中的特定着色细胞原生质体的基因水平、蛋白水平和代谢水平的研究奠定了基础。

附图说明

图1为本发明的实施例的剃须刀片快速将萼片切成细丝的普通处理组的镜检图；

图2为本发明的实施例中采用本发明的萼片处理方法处理之后的镜检图；

图3为本发明的实施例中的两种萼片处理方式下的粉色萼片的原生质体的个数对比图；

图4为本发明的实施例中的两种萼片处理方式下的蓝色萼片的原生质体的个数对比图；

图5为本发明的实施例中的酶解液浓度水平(1)的镜检图；

图6为本发明的实施例中的酶解液浓度水平(2)的镜检图；

图7为本发明的实施例中的酶解液浓度水平(3)的镜检图；

图8为本发明的实施例中的酶解液浓度水平(4)的镜检图；

图9为本发明的实施例中的不同酶解液浓度水平的粉色萼片的原生质体的个数对比图；

图10为本发明的实施例中的不同酶解液浓度水平的蓝色萼片的原生质体的个数对比图；

图11为本发明的实施例中的2h酶解时间的镜检图；

图12为本发明的实施例中的3h酶解时间的镜检图；

图13为本发明的实施例中的4h酶解时间的镜检图；

图14为本发明的实施例中的不同酶解时间的粉色萼片的原生质体的个数对比图；

图15为本发明的实施例中的不同酶解时间的蓝色萼片的原生质体的个数对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

一种分离八仙花萼片着色细胞原生质体的方法，包括以下步骤：

s1：处理八仙花萼片

本实施例以八仙花品种‘bailmer’花萼片为实验材料，显色后的初、中、盛期均可；将八仙花的花簇采下，插入水中，在冰箱冷藏室4℃冷藏1～2小时，取0.5g冷藏后的萼片，用尖头镊子分离萼片的表皮与叶肉；

s2：酶解

将步骤s1中的萼片的叶肉迅速放入10ml酶解液中酶解，其中酶解液的组成成分包括25mmmes-trisph＝6.3、6％纤维素酶、0.6％离析酶、0.6m甘露醇、1mmcacl2和0.1％bsa；酶解方式如下：先配制25mmmes-trisph＝6.3、6％纤维素酶、0.6％离析酶和0.6m甘露醇的溶液，并将上述溶液放入55℃恒温水浴锅中水浴10min，激发酶的活性，并使甘露醇充分溶解；待上述溶液自然冷却后再向上述溶液中加入1mmcacl2和0.1％bsa，并混匀；然后取上述溶液10ml转入离心管中，再将经步骤s1处理之后的萼片的叶肉放入离心管中，之后抽真空至萼片的叶肉不再悬浮于酶解液的表面后，将离心管放入恒温震荡培养箱中，于30rpm28℃暗孵育3h；

s3：纯化

将经步骤s2处理之后的酶解混合物用200目网筛过滤，将过滤后所得的液体放入低温离心机中于4℃70g离心5min，弃上清，用w5洗液轻轻吹打清洗离心后的沉淀物，并重复上述离心过程两次；w5洗液的组成成分如下：54mmnacl，125mmcacl2，5mmkcl，ph＝6.02mmmes-tris；

s4：储存

向经步骤s3处理后的沉淀物中滴入100μl储存液，4℃避光保存，备用；所用储存液的组成成分如下：20mmph＝6.0mes-tris，0.6m甘露醇，2mmmgso4，5mmegta，10mmkcl，2％甘油。

本实施例将现有的八仙花萼片的普通处理方法与本发明的处理方法进行了对比，对比实验如下：

普通处理方法：直接用剃须刀片快速将萼片切成细丝；本发明的处理方法：用尖头镊子分离萼片表皮与叶肉；

利用相同的酶解液分别对上述两种处理方式的萼片进行酶解，其他实验操作方式同本发明的操作方式，本对比实验中所用的酶解液为：20mmmes-trisph＝6.3，2％纤维素酶，0.2％离析酶，0.6m甘露醇，1mmcacl2，0.1％bsa；酶解离时间为2h；镜检结果及原生质体的个数见附图1、附图2、附图3和附图4，结果表明本发明的萼片处理方法所提取出的原生质体个数明显高于普通处理方法。

本实施例还设置了四个水平的酶解液浓度，如下：(1)2％纤维素酶，0.2％离析酶，(2)4％纤维素酶，0.4％离析酶，(3)6％纤维素酶，0.6％离析酶，(4)8％纤维素酶，0.8％离析酶；萼片处理采用尖头镊子分离萼片表皮与叶肉的方法，酶解时间为2h；其他实验操作方式同本发明的操作方式；镜检结果及原生质体的个数见附图5、附图6、附图7和附图8，结果表明：从原生质体提取个数与实验成本考虑，6％纤维素酶与0.6％离析酶为最优酶解浓度。

本实施例还设置了三个水平的酶解时间：2h、3h、4h；其中萼片处理采用尖头镊子分离萼片表皮与叶肉的方法，所用酶液为：20mmmes-trisph＝6.3，6％纤维素酶，0.6％离析酶，0.6m甘露醇，1mmcacl2，0.1％bsa；其他实验操作方式同本发明的操作方式；镜检结果及原生质体的个数见附图9、附图10、附图11、附图12、附图13、附图14和附图15，结果表明：从原生质体的提取个数与时间成本考虑，3小时为最优酶解时间。

所以综合两种颜色bailmer萼片原生质体的提取量、时间成本和经济成本，在本处理的基础上，酶解浓度采用0.6％离析酶，6％纤维素酶，酶解时间采用3小时。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。