一种高通量的多器官芯片及其使用方法与流程

本发明涉及一种高通量的多器官芯片及其使用方法，属于微流控和器官芯片技术领域。

技术背景

器官芯片技术基于微流控技术，可以实现对芯片内培养的细胞提供更接近体内的动态微环境，包括：流体剪切力，空间分布等，从而在芯片构建更具有仿生功能的器官。器官芯片可以广泛用于药物研发、病理学、毒理学、食品安全、化妆品等领域。

随着器官芯片技术的发展，各种功能化的器官芯片已经被研究者们构建出来，包括：肠、肝、肾、肺、血管、血脑屏障（bbb）等，基于此，一些多器官联用的芯片也在逐渐被研发出来，未来会形成人体芯片。

然而，目前的器官芯片的发展仍有需要限制因素，例如：目前大部分器官芯片产品依然依托于pdms作为主要材质，在产量与成本上难以做到快速的批量化生产以及低成本。此外，现有的器官芯片产品在细胞培养的操作中需要将细胞注入到芯片的通道内，这种新的操作方式在一定程度上改变了现有细胞培养的操作习惯，并且操作难度也相应增加。还有一些其他的操作步骤，包括：芯片插管，芯片打孔等等。这些繁琐的操作步骤会引入一定的细胞污染情况。

其次，现有芯片产品大多需要一个芯片配上一套流体操控系统，不单降低了通量，同时会提升操控系统的成本。

技术实现要素：

本发明为了解决上述器官芯片产品的不足，提供了一种高通量、低成本、用户友好方式的器官芯片，该芯片设计灵活多变，可以满足高通量多种器官联合培养的需求，可以用于病理学、医学、药学、毒理学等领域的研究工作。

为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种高通量的多器官芯片，所述多器官芯片是由若干数量的微芯片组成孔板状的芯片；所述每一个微芯片由下往上至少包含三层组合结构，包括底层基底结构，与所述底层基底结构对应的至少数量为1的第一中间层和与第一中间层对应的顶层盖子结构；所述底层基底结构与所述第一中间层结构均为有一定壁厚的无盖中空容器，所述顶层盖子结构由顶盖和顶盖下方的塞子构成；所述第一中间层可嵌套在所述底层基底结构上，并且底部形成第一培养空间；所述顶层盖子结构可通过塞子嵌套在所述中间层上，并在底部形成第二培养空间；所述底层基底结构的壁上对称开设有两条底层壁槽；所述第一中间层的壁上对称开设有第一中间层壁槽；所述第一中间层的顶部壁口部分有一圈大于其容器直径的第一环形结构；所述第一环形结构上开设有第一中间层通孔组，当第一中间层嵌套在所述底层基底结构上时，所述第一中间层通孔组可与所述底层壁槽连通；所述顶层盖子结构上的顶盖上开设有与所述第一中间层的第一中间层壁槽和所述第一中间层通孔组一一对应的顶盖通孔；当顶层盖子结构嵌套入所述第一中间层时，所述塞子进入所述第一中间层的容器中，所述顶盖密封所述第一中间层顶部，所述顶盖通孔分别与第一中间层壁槽和第一中间层通孔组连通；所述顶盖通孔上还安装有接头；所述第一中间层结构的底部为多孔膜结构。工作时，首先微芯片的三层组合结构是分离状态的，分别在底层基底结构的底部和第一中间层的底部接种不同的细胞，待细胞粘附生长后，将底层基底结构、第一中间层、顶层盖子结构进行组合；首先将第一中间层套接在底层基底结构上，使得第一中间层的第一环形结构上的第一中间层通孔组对准底层基底结构的底层壁槽，随后再将顶层盖子结构上的塞子塞入所述第一中间层中，使得顶盖上的顶盖通孔与第一中间层的第一中间层壁槽以及第一中间层通孔组连通；也就是说底层基底结构的底层壁槽与第一中间层通孔组连通后再连通顶盖通孔，形成提供给第一培养空间的一条进液的流体通路和一条出液的流体通路；同时第一中间层的第一中间层壁槽与顶层盖子结构上的顶盖通孔连通，形成第二培养空间的一条进液的流体通路和一条出液的流体通路；使得每个培养空间都可以独立的进液和出液；随后可以将微芯片组合成12、24、48等多孔板的结构，再使用蠕动泵和导管连接顶盖通孔上的接头对微芯片进行灌注。在本技术方案中，关键特点是，所述微芯片是可拆分的多层结构，其中所述底层基底结构是与所述孔板一体成型的或者所述底层基底结构是可拆卸的插在所述孔板上；同理可以变化得出，所述第一中间层亦可以是分离或者可拆卸的形成与底层的孔板形状类似的阵列；所述顶层盖子结构亦然。体现本高通量多器官芯片的灵活性。

进一步的，上述一种高通量的多器官芯片，所述微芯片的第一中间层之上还有第二中间层；所述第二中间层可嵌套于所述第一中间层上，并在底部形成第三培养空间；所述顶层盖子结构盖住所述第二中间层；所述第二中间层的壁上对称开设有第二中间层壁槽；所述第二中间层的顶部壁口部分有一圈大于其容器直径的第二环形结构；所述第二环形结构上开设有第二中间层通孔组一和第二中间层通孔组二；当第二中间层嵌套在所述第一中间层上时，所述第二中间层通孔组一与所述第一中间层的第一中间层壁槽连通，所述第二中间层通孔组二与所述第一中间层通孔组连通；当顶层盖子结构嵌套入所述第二中间层时，所述塞子进入所述第二中间层的容器中，所述顶盖密封所述第二中间层顶部，所述顶盖通孔分别与第二中间层壁槽和第二中间层通孔组一以及第二中间层通孔组二连通；所述第二中间层结构的底部为多孔膜结构。如此方案所述，本发明中所公开的器官芯片，可以方便的添加层数，进而可以灵活的改变同时培养的细胞数，同时，底层基底结构以及中间层的形状不应该被限制，其横截面可以为圆形或者矩形，或者其他形状，只要上下层保持形状相同，大小逐渐减小，即可实现本发明的目的；同时，所述流体通路，并非只能直接通过流体，亦可以通过软管等物穿过所述通孔进入所述培养空间来进行培养基的添加和减少，在本方案的基础上本领域技术人员可以进行多种选择。

进一步的，上述一种高通量的多器官芯片，所述微芯片的第二中间层之上还有第三中间层，所述第三中间层可嵌套于所述第二中间层上，并在底部形成第四培养空间；所述顶层盖子结构盖住所述第三中间层；所述第二中间层的壁上对称开设有第三中间层壁槽；所述第二中间层的顶部壁口部分有一圈大于其容器直径的第三环形结构；所述第三环形结构上开设有第三中间层通孔组一和第三中间层通孔组二以及第三中间层通孔组三；当第三中间层嵌套在所述第二中间层上时，所述第三中间层通孔组一与所述第二中间层的第二中间层壁槽连通，所述第三中间层通孔组二与所述第二中间层通孔组一连通，所述第三中间层通孔组三与所述第二中间层通孔组二连通；当顶层盖子结构嵌套入所述第三中间层时，所述塞子进入所述第三中间层的容器中，所述顶盖密封所述第三中间层顶部，所述顶盖通孔分别与第三中间层壁槽和第三中间层通孔组一、第三中间层通孔组二和第三中间层通孔组三连通；所述第三中间层结构的底部为多孔膜结构。

进一步的，上述一种高通量的多器官芯片，所述底层基底结构和所述第一中间层的内径为0.5-5厘米，深度为1-5厘米，壁厚为0.5-5毫米；所述底层壁槽或第一中间层壁槽的宽度为0.5-1毫米，深度为0.2-1毫米；所述顶层盖子结构的底部塞子的外径为0.5-5厘米，深度为1-5厘米。

进一步的，上述一种高通量的多器官芯片，所述孔板上微芯片的数量为12或24或48个；所述微芯片中的底层基底结构是与所述孔板一体成型的，或者所述底层基底结构是可拆卸的插在所述孔板上，在此情况下所述孔板可以是预先留有孔洞并一体成型制成的。

进一步的，上述一种高通量的多器官芯片，所述多孔膜结构的多孔膜为透明或半透明的膜，材质选自pc、pet、pdms中的一种或多种，所述多孔膜的孔径为0.22-10微米。使用聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯和涤纶树脂等高分子材料，可以通过3d打印来制备成型，制备方便，成本低。也可以通过开模进行注塑加工的方式进行芯片的生产。

进一步的，上述一种高通量的多器官芯片，所述器官芯片的制造材料选自pc、pmma、pet中的一种或多种。

进一步的，上述一种高通量的多器官芯片，所述底层基底结构100的底部为平面或为具有阵列微孔结构的表面；所述阵列微孔结构的孔径为100-1000微米，深度为100-1000微米；所述接头为鲁尔接头或宝塔样接头；可以设置为每一个顶盖通孔安装一个接头或者若干个顶盖通孔通过管道汇总到同一个接头上。使用接头连接顶盖通孔，方便连接管路以及蠕动泵等，进行精确的计算机控制下的灌注。

进一步的，上述一种高通量的多器官芯片，当所述中间层的数量大于一时，每增加的一个中间层的外径与前一个中间层的内径相匹配，长度减少200-1000微米。

进一步的，上述一种高通量的多器官芯片的使用方法，包括以下步骤：

（1）将所述的一种高通量多器官芯片的每个微芯片的每个层进行灭菌处理；方法包括但不限于以下方法：酒精、消毒水、紫外线、气体灭菌等；

（2）将所需的不同的细胞接种在芯片的不同层中，其中，每个中间层底部多孔膜上下两侧都可以接种细胞；

（3）将接种好细胞的不同层进行组装成微芯片，组装前移走培养基，将中间层按照顺序插入到底层，注意凹槽结构与通孔的对准，最后插入顶层的盖子，将微芯片组装成孔板，同时确保所有的通孔连接正确；

（4）将流体导管连接到微芯片的顶层盖子结构上的接头，并开始所需的灌流培养。

上述方案表明，本发明至少具有以下有益效果：本发明提供了一种基于现有孔板技术为主的高通量多器官芯片及其使用方法，本发明所设计的芯片保留了现有孔板培养细胞的操作习惯，并且可以实现较高通量和低成本的需求，该芯片设计灵活多变，可以满足高通量多种器官联合培养的需求，可以用于病理学、医学、药学、毒理学等领域的研究工作。

附图说明

附图1为实施例1所述的一种高通量的多器官芯片中的微芯片组成阵列形成12孔孔板的示意图；

附图2为实施例1中单个微芯片组装前的示意图；

附图3为实施例1中单个微芯片组装后的示意图；

附图4为实施例1中单个微芯片的中间层的俯视图；

附图5为实施例2中的一种高通量的多器官芯片中的微芯片组成阵列形成24孔孔板的示意图；

附图6为实施例2中单个微芯片组装前的示意图，其中不包括顶层盖子结构；

附图7为实施例2中单个微芯片的顶层盖子结构和第二中间层的结合图；

附图8为实施例3中的一种高通量的多器官芯片中的微芯片组成阵列形成48孔孔板的示意图；

附图9为实施例3中单个微芯片中第二中间层和第三中间层的结合图；

附图10为实施例4中一种多层组合结构的脑芯片组装完成后的示意图，图中多孔膜底层和表层分别长有细胞；

附图11为实施例5中一种多层组合结构的肠-肝-肿瘤芯片组装完成前的示意图，图中多孔膜底层和表层分别长有细胞；

其中：10第一培养空间、20第二培养空间、30第三培养空间、40第四培养空间、100底层基底结构、101底层壁槽、200顶层盖子结构、211顶盖通孔、210顶盖、220塞子、230接头、300第一中间层、301第一中间层壁槽、310第一环形结构、311第一中间层通孔组、400第二中间层、401第二中间层壁槽、410第二环形结构、411第二中间层通孔组一、412第二中间层通孔组二、500第三中间层、501第三中间层壁槽、510第三环形结构、511第三中间层通孔组一、512第三中间层通孔组二、513第三中间层通孔组三、1000微芯片、2000孔板。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

实施例1

如图1-4所示的一种高通量的多器官芯片，所述多器官芯片是由12个微芯片1000组成孔板2000状的芯片；所述每一个微芯片1000由下往上包含三层组合结构，包括底层基底结构100，与所述底层基底结构100对应的第一中间层300和与第一中间层300对应的顶层盖子结构200；所述底层基底结构100与所述第一中间层结构300均为有一定壁厚的无盖中空容器，所述顶层盖子结构200由顶盖210和顶盖210下方的塞子220构成；所述第一中间层300可嵌套在所述底层基底结构100上，并且底部形成第一培养空间10；所述顶层盖子结构200可通过塞子220嵌套在所述中间层300上，并在底部形成第二培养空间20；所述底层基底结构100的壁上对称开设有两条底层壁槽101；所述第一中间层300的壁上对称开设有第一中间层壁槽301；所述第一中间层300的顶部壁口部分有一圈大于其容器直径的第一环形结构310；所述第一环形结构310上开设有第一中间层通孔组311，当第一中间层300嵌套在所述底层基底结构100上时，所述第一中间层通孔组311可与所述底层壁槽101连通；所述顶层盖子结构200上的顶盖210上开设有与所述第一中间层300的第一中间层壁槽301和所述第一中间层通孔组311一一对应的顶盖通孔211；当顶层盖子结构200嵌套入所述第一中间层300时，所述塞子220进入所述第一中间层300的容器中，所述顶盖210密封所述第一中间层300顶部，所述顶盖通孔211分别与第一中间层壁槽301和第一中间层通孔组311连通；所述顶盖通孔211上还安装有接头230；所述第一中间层结构300的底部为多孔膜结构；所述底层基底结构100和所述第一中间层200的内径为0.5-5厘米，深度为1-5厘米，壁厚为0.5-5毫米；所述底层壁槽101或第一中间层壁槽301的宽度为0.5-1毫米，深度为0.2-1毫米；所述顶层盖子结构200的底部塞子220的外径为0.5-5厘米，深度为1-5厘米。

使用时：首先微芯片1000的三层组合结构是分离状态的，分别在底层基底结构100的底部和第一中间层300的底部接种不同的细胞，待细胞粘附生长后，将底层基底结构100、第一中间层300、顶层盖子结构200进行组合；首先将第一中间层300套接在底层基底结构100上，使得第一中间层300的第一环形结构310上的第一中间层通孔组311对准底层基底结构100的底层壁槽101，随后再将顶层盖子结构200上的塞子220塞入所述第一中间层300中，使得顶盖210上的顶盖通孔211与第一中间层300的第一中间层壁槽301以及第一中间层通孔组311连通；也就是说底层基底结构100的底层壁槽101与第一中间层通孔组311连通后再连通顶盖通孔211，形成提供给第一培养空间10的一条进液的流体通路和一条出液的流体通路；同时第一中间层300的第一中间层壁槽301与顶层盖子结构200上的顶盖通孔211连通，形成第二培养空间20的一条进液的流体通路和一条出液的流体通路；使得每个培养空间都可以独立的进液和出液；随后可以将微芯片1000组合成12孔板的结构，随后使用蠕动泵（图中未示出）和导管（图中未示出）连接顶盖通孔211上的接头230对微芯片1000进行灌注。

实施例2

如图5-7所示的一种高通量的多器官芯片，所述多器官芯片是由24个微芯片1000组成孔板2000状的芯片，在实施例1的结构基础上，所述微芯片1000的第一中间层300之上还有第二中间层400；所述第二中间层400可嵌套于所述第一中间层300上，并在底部形成第三培养空间30；所述顶层盖子结构200盖住所述第二中间层400；所述第二中间层400的壁上对称开设有第二中间层壁槽401；所述第二中间层400的顶部壁口部分有一圈大于其容器直径的第二环形结构410；所述第二环形结构410上开设有第二中间层通孔组一411和第二中间层通孔组二412；当第二中间层400嵌套在所述第一中间层300上时，所述第二中间层通孔组一411与所述第一中间层300的第一中间层壁槽301连通，所述第二中间层通孔组二412与所述第一中间层通孔组311连通；当顶层盖子结构200嵌套入所述第二中间层400时，所述塞子220进入所述第二中间层400的容器中，所述顶盖210密封所述第二中间层400顶部，所述顶盖通孔211分别与第二中间层壁槽401和第二中间层通孔组一411以及第二中间层通孔组二412连通；所述第二中间层结构400的底部为多孔膜结构。

实施例3

如图8-9所示的一种高通量的多器官芯片，所述多器官芯片是由48个微芯片1000组成孔板2000状的芯片，在实施例2的结构基础上，所述微芯片1000的第二中间层400之上还有第三中间层500，所述第三中间层500可嵌套于所述第二中间层400上，并在底部形成第四培养空间40；所述顶层盖子结构200盖住所述第三中间层500；所述第二中间层500的壁上对称开设有第三中间层壁槽501；所述第二中间层400的顶部壁口部分有一圈大于其容器直径的第三环形结构510；所述第三环形结构510上开设有第三中间层通孔组一511和第三中间层通孔组二512以及第三中间层通孔组三513；当第三中间层500嵌套在所述第二中间层400上时，所述第三中间层通孔组一511与所述第二中间层400的第二中间层壁槽401连通，所述第三中间层通孔组二512与所述第二中间层通孔组一411连通，所述第三中间层通孔组三513与所述第二中间层通孔组二412连通；当顶层盖子结构200嵌套入所述第三中间层500时，所述塞子220进入所述第三中间层500的容器中，所述顶盖210密封所述第三中间层500顶部，所述顶盖通孔211分别与第三中间层壁槽501和第三中间层通孔组一511、第三中间层通孔组二512和第三中间层通孔组三513连通；所述第三中间层结构500的底部为多孔膜结构；优选的，所述微芯片1000中的底层基底结构100是可拆卸的插在所述孔板2000上；进一步的，所述多孔膜结构的多孔膜为透明或半透明的膜，材质选自pc、pet、pdms中的一种或多种，所述多孔膜的孔径为0.22-10微米；特别的，所述器官芯片的制造材料选自pc、pmma、pet中的一种或多种；进一步的，所述底层基底结构100的底部为平面或为具有阵列微孔结构的表面；所述阵列微孔结构的孔径为100-1000微米，深度为100-1000微米；所述接头230为鲁尔接头或宝塔样接头；可以设置为每一个顶盖通孔211安装一个接头230或者若干个顶盖通孔211通过管道汇总到同一个接头230上；

实施例4

利用实施例1中的芯片构建类脑芯片，参考附图1、2、3、4、10，具体按照以下步骤进行：

（1）将所述的实施例1中的一种高通量多器官芯片的每个微芯片1000的每个层进行紫外线灭菌处理；

（2）将由多潜能干细胞接种在底层基底结构100的底层壁槽101中，待形成细胞球后进行诱导，形成类脑；

（3）待诱导形成类脑后，将星形胶质细胞接种在第一中间层300的多孔膜底层上，等星形胶质细胞粘附生长后，将血管内皮细胞接种在第一个中间层300的多孔膜上层面上，在多孔膜上形成血脑屏障结构；

（4）将接种好细胞的不同部件进行组装，组装前移走培养基，将中间层结构按插入到基底层，注意凹槽结构与通孔的对准，最后插入顶层的盖子，将微芯片1000组装成孔板2000，同时确保所有的通孔连接正确；

（5）将流体导管连接到微芯片1000的顶层盖子结构200上的接头230，并开始所需的灌流培养，即形成了一种类脑器官与血脑屏障联用芯片，可以用于考察药物分子透过血脑屏障作用于脑的过程。

实施例5

利用实施例2中的芯片构建肠-肝-肿瘤芯片，参考附图5、6、7、11，具体按照以下步骤进行：

（1）将所述的实施例2中的一种高通量多器官芯片的每个微芯片1000的每个层进行酒精灭菌处理；

（2）将卵巢癌细胞接种在底层基底结构100的底面；将血管内皮细胞接种在第一中间层300的多孔膜的底面和第二中间层400的多孔膜的底面上，等血管内皮细胞粘附生长后再将肝细胞（hepg2）接种在第一中间层300的多孔膜的上表面上，将肠细胞（caco2）接种在第二中间层400的多孔膜的上表面上。

（3）将接种好细胞的不同部件进行组装，组装前移走培养基，将两个中间层结构按照顺序插入到基底层，注意凹槽结构与通孔的对准，最后插入顶层的盖子，同时确保所有的通孔连接正确；

（4）将流体导管连接到盖子上的接头，并开始所需的灌流培养，即形成了一种肠-肝-肿瘤器官联用芯片，可以用于考察药物的吸收，代谢与治疗肿瘤的效果评价。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。