一种L-赖氨酸选择性结构修饰的方法与流程

本发明属于化学合成领域，具体涉及一种l-赖氨酸选择性结构修饰的方法。

背景技术：

氨基酸的选择性保护是合成定向肽的重要手段。对于包含多功能组的氨基酸,如赖氨酸、酪氨酸,精氨酸等,应采用不同的保护方法、以有选择地保护这些氨基酸的活性官能团,从而达到氨基酸的方向选择性偶联反应。其中，l-赖氨酸作为一种必需氨基酸，在多肽合成中起着重要作用。然而，由于赖氨酸的两个氨基具有基本相同的化学性质，很难控制反应的选择性，从而难以得到保护侧链氨基的单一赖氨酸。

目前，文献报道的l-赖氨酸选择性保护的方法主要有：(1)在酸性条件下，通过硫酸铜与l-赖氨酸的α-nh2络合，暂时保护α-nh2,再将赖氨酸络合铜加入水与四氢呋喃的混合溶剂中，加入氢氧化钠或碳酸钠将溶液调整至碱性，在冰浴条件下逐滴加入氯甲酸苄酯进行反应。反应结束后添加脱铜试剂以脱除络合态的铜离子，得到终产物。该方法有较高产率，生产成本低廉，但在生产过程中会产生大量含有重金属铜的废水，造成环境污染问题。(2)以β-环糊精为催化剂，以水作溶剂，将l-赖氨酸与氯甲酸苄酯在室温下反应,得到终产物(例如：org.biomol.chem.,2012,10,9319–9324。中国专利：一种赖氨酸氨基的辛氧裁基高效选择性保护方法及其产品，申请号201110422510.4)。环糊精具有外亲水内疏水的特性，能够为反应提供独特的微环境，因此该方法反应速率快，产物产率高，反应条件温和。但由于反应在环糊精疏水空腔内进行，反应后产物具有较强的疏水性，导致产物与β-环糊精难以在水溶液中直接分离。按照文中描述，该方法的后续分离处理较为容易，只需加入乙酸乙酯萃取处理后即得产物。然而发明人在实际操作中发现：在反应结束后，环糊精与产物的混合物浮于反应液表面，呈白色固体状。按照文献中的萃取方法处理后，所得仍为环糊精与产物的混合物，无法实现分离产物与环糊精的目的。发明人进一步优化该方法的后处理方式：加入乙酸乙酯至反应液中，超声处理五分钟，大力搅拌一小时，静置分层后，分离出产物。但这种优化的后处理方法需要使用大量挥发性有机溶剂，后处理操作复杂、纯化难度大。

因此，提供一种后处理操作简便、分离效果优异、有机溶剂用量少的l-赖氨酸选择性结构修饰方法，具有重要的科研价值和现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种l-赖氨酸选择性结构修饰的方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种用于l-赖氨酸选择性保护反应的催化剂，所述催化剂为β-环糊精表面功能化的二氧化硅纳米粒子。

优选的，所述催化剂粒径为100nm。

优选的，所述催化剂中，β-环糊精的质量百分比为10％±0.5％。

相应的，所述催化剂的制备方法包括如下步骤：

(1)通过β-环糊精的6位羟基与异氰酸丙基三乙氧基硅烷的异氰酸基团进行偶联反应，获得功能单体cdsi；

(3)将球状二氧化硅纳米粒子与所述cdsi以质量比为1:1的比例添加到无水dmf中，在惰性气氛下110℃反应、过滤、洗涤、干燥，得所述催化剂。

优选的，所述球状二氧化硅纳米粒子的粒径为20～200nm。

相应的，一种选择性修饰l-赖氨酸的方法，以l-赖氨酸为原料，以所述β-环糊精表面功能化的二氧化硅纳米粒子为催化剂，在氨基保护剂的存在下进行反应。

优选的，所述氨基保护剂为氯甲酸苄酯、苄溴、苄氯、9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯、芴甲氧羰酰氯、烯丙基氯甲酸酯、二碳酸二叔丁酯、对甲基苯磺酰氯、对硝基苯磺酰氯、对甲氧基氯化苄、三苯甲基溴中的任意一种。

优选的，所述方法包括如下步骤：

(1)以l-赖氨酸为原料，以β-环糊精表面功能化的二氧化硅纳米粒子为催化剂，以水为溶剂，在氨基保护剂的存在下，在25℃下反应3～5小时，得反应终产物；

(2)将所述反应终产物静置，取上层产物，洗涤、分离、过滤，得选择性修饰的l-赖氨酸。

优选的，所述l-赖氨酸与β-环糊精表面功能化的二氧化硅纳米粒子的质量比为1:3.2。

优选的，所述l-赖氨酸与氨基保护剂的摩尔比为1:1。

本发明具有以下有益效果：本发明首次使用β-环糊精表面功能化的二氧化硅纳米材料为催化剂进行l-赖氨酸的选择性结构修饰反应。所述催化剂的原料价廉易得，合成方法简单；合成的催化剂无味、无毒，易于产物分离、可重复利用。该催化剂不仅保留了β-环糊精良好催化性能，同时引入了具有亲水性的纳米粒子，反应结束后,经修饰的l-赖氨酸具有疏水性，催化剂的纳米粒子表面具有亲水性，两者极易分离。从而有效解决了普通β-环糊精催化后产物与环糊精混合物浮于液面而难分离的问题，简化了后处理步骤，减少了有机溶剂的用量，大幅减少了纯化阶段产生的废液量。

附图说明

图1为β-环糊精表面功能化二氧化硅纳米粒子的制备方法示意图；

图2为cdsi的核磁氢谱鉴定示意图；

图3为sio2纳米粒子和sio2@cd的tga曲线；

图4为sio2纳米颗粒的电镜扫描图。

具体实施方式

一、本发明提供了一种用于l-赖氨酸选择性保护反应的催化剂。具体为一种β-环糊精表面功能化的二氧化硅纳米粒子(全文简称为：sio2@cd)。所述sio2@cd的粒径为20～200nm，优选为100nm。所述sio2@cd中，β-环糊精的质量百分比为10％±0.5％。

所述sio2@cd的制备过程如图1所示，具体包括如下步骤：

(1)采用法(journalofcolloidandinterfacescience,1968,26，62-69)，制备出大小均一、粒径范围为20～200nm的球状二氧化硅纳米粒子(简称为：sio2nps)。所述sio2nps优选的粒径为100nm。所述sio2nps也可市购获得。

(2)通过β-环糊精(β-cd)的6位羟基与异氰酸丙基三乙氧基硅烷(iptes)的异氰酸基团进行偶联反应。具体方法为：将β-环糊精与iptes以摩尔比1:1.5的比例溶于无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，在惰性气氛下80℃反应6小时，反应结束后，冷却至室温，加入丙酮沉淀纯化，过滤，得白色固体产物，即功能单体cdsi。

为确定β-环糊精与iptes的偶联反应是否成功，通过400m核磁氢谱进行鉴定分析，图谱如图2所示。结果为：¹hnmr(dmso)dppm0.48-0.87(4h,m,ch2ch2si)；1.15-1.60(9h,m,(ch3)3)；3.15-3.18(2h,m,ch2)；3.56-3.62(6h,m,(ch2)3)；4.13-4.16(2h,m,ch2)；4.48(h,m,oh)；4.83(h,d,oh)；5.68-5.74(2h,m,oh)；7.95(h,s,nh)。将该谱图与未修饰的环糊精进行对比发现：在δ0.48-0.87区域出现硅烷基团(ch2ch2si)的峰；在δ4.48处，6位羟基氢峰值比例降低；在δ4.13-4.16处出现新的峰，该峰归属为6位羟基被iptes取代后的6位烷基氢的峰。结合各峰积分面积的比例，确定该化合物为β-环糊精与功能单体的复合物，即cdsi。

(3)将步骤(1)的sio2nps与步骤(2)的cdsi以质量比为1:1的比例添加到无水dmf中，在惰性气氛下110℃反应24小时。过滤洗涤干燥后，即得到β-环糊精表面功能化二氧化硅纳米粒子sio2@cd，所得sio2@cd中β-环糊精质量百分比为10％±0.5％。

具体可采用热失重法测定sio2@cd中β-环糊精质量百分比含量。本示例中，sio2纳米粒子和sio2@cd的tga曲线如图3所示。sio2@cd的tga曲线包括两次降解。第一次降解范围为200℃到450℃，为有机物的降解阶段。通过与sio2纳米粒子的热失重结果进行对比发现：sio2@cd表面有机物含量为11％，从而计算出其表面有机物中β-环糊精占比为0.93，由此得出：sio2@cd表面的β-环糊精含量为10.2％。

二、本发明基于所述sio2@cd，还提供了一种选择性修饰l-赖氨酸的方法。反应方程式为：

具体为：

(1)以l-赖氨酸为原料，以所述sio2@cd为催化剂，以a为氨基保护剂，以水为溶剂，在温度为25℃的反应条件下，反应3～5小时，即得反应终产品。

(2)将所述反应终产物移至分液漏斗，静置1h后，产物浮于上层。取上层产物，加水洗涤分离3次后，过滤，再用乙酸乙酯洗涤过滤，即得产物b。当生成的终产物与副产物不易直接分离时，进一步将产物b再通过高效液相色谱法分离，得提纯、去除副产物后的产物b。

其中，氨基保护剂a为氯甲酸苄酯、苄溴、苄氯、9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯、芴甲氧羰酰氯、烯丙基氯甲酸酯、二碳酸二叔丁酯、对甲基苯磺酰氯、对硝基苯磺酰氯、对甲氧基氯化苄、三苯甲基溴中任意一种。产物b中r基团为苄氧羰基、苄基、芴甲氧羰基、烯丙氧羰基、叔丁氧羰基、对甲苯磺酰基、硝基苯磺酰基、对甲氧基苄基、三苯甲基中的任意一种，r基团具体为与a试剂相对应的基团。

优选的方案为：步骤(1)中，l-赖氨酸与sio2@cd的质量比为1:3.2；l-赖氨酸与a的摩尔比为1:1。

下面结合具体的实施例，对本发明进行进一步阐释。

实施例一：制备sio2@cd

1、制备大小均匀的sio2纳米粒子。将乙酸乙酯(44ml)、h2o(11ml)和氨水(1.1ml)加入锥形瓶中，在40℃下搅拌混合，转速调节至300rpm/min。随后将teos(4.4ml)和无水乙醇(20ml)均匀混合，加入上述反应体系中，加入完毕后，转速调至600rpm/min，搅拌3min。而后将转速降至300rpm/min，搅拌15h。所得液体经高速离心(9000rpm/min)，多次洗涤后获得sio2纳米颗粒(sio2nps)，最后将其在120℃下干燥24h，密封干燥储存待用。sio2nps的电镜扫描图如图4所示。

2、制备sio2@cd。将β-cd在100℃、真空条件下干燥24h，随后取β-cd(0.55mmol)溶于的无水dmf(10ml)中。随后逐滴加入iptes(0.15ml)。滴加完成后，在惰性气体条件下，将温度升至80℃反应6h。反应结束后，冷却至室温，加入丙酮沉淀纯化，过滤，得白色固体产物，即为β-cd功能单体复合物(cdsi)。然后将cdsi(500mg)与sio2nps(500mg)加入至无水dmf(30ml)中，在惰性气体下110℃剧烈搅拌反应24h。过滤，洗涤，材料干燥12h，即得sio2@cd。

实施例二：制备一种选择性结构修饰后的l-赖氨酸

本实施例涉及反应方程式为：

将sio2@cd(40mg)加入到碳酸钠水溶液(4ml)中,ph值约为9.5。搅拌至均匀分散后，加入l-赖氨酸(0.1mmol)，继续搅拌1h后，逐滴加入的a1(氯甲酸苄酯，cbz-cl，0.09mmol)。反应3h后，停止反应，将反应液移至分液漏斗，静置1h，取上层产物，加水洗涤分离3次后，过滤，再用乙酸乙酯(3ml)洗涤，得终产物b1，即nε-cbz-l-赖氨酸，产率为78.6％，其选择性＞99％。

b1为白色固体。谱图数据为：¹hnmr(dmso)dppm1.13-1.45(4h,m,ch2ch2)；1.48-1.76(2h,m,ch2)；2.90-3.01(2h,m,ch2ε)；3.02-3.08(h,t,ch)；5.00(2h,s,ch2ar)；7.23-7.40(5h,m,ar)。¹³c-nmr(dmso)δ171.38,156.56，137.69，128.83,128.22,128.18,65.60,52.26,30.02,29.28,22.02。msm/z:281.1563(m⁺)。

实施例三：制备另一种选择性结构修饰后的l-赖氨酸

本实施例涉及反应方程式为：

将sio2@cd(100mg)加入到碳酸钠水溶液(10ml)中，ph值约为10.5。搅拌至均匀分散后，加入l-赖氨酸(0.1mmol)，继续搅拌1h后，逐滴加入的a2(苄溴，brbn,0.09mmol)，反应5h后，停止反应。将反应液移至分液漏斗，静置1h后，取上层产物，用水洗涤分离三次后，过滤，再用乙酸乙酯(3ml)洗涤，得粗产物。将所述粗产物通过高效液相分离，得终产物b2,即nε-bn-l-赖氨酸，产率为46.6％，选择性＞99％。高效液相色谱分离条件为：流动相：acn/h2o(40/60)，紫外波长:208nm，流速：1ml/min，每针进样25μl。

b2为白色固体。谱图数据为：¹hnmr(dmso)dppm1.21-1.50(6h,m,ch2ch2ch2)；2.97-3.15(2h,m,ch2ε)；3.20-3.25(h,t,ch)；5.00(2h,s,ch2ar)；7.23-7.48(5h,m,ar)。¹³cnmr(dmso)δ173.45,140.03,128.91,128.62,128.21,57.93,53.13,50.77,31.86,26.65,23.64。msm/z:237.1553(m⁺)。

实施例四：制备第三种选择性结构修饰后的l-赖氨酸

本实施例涉及反应方程式为：

将sio2@cd(100mg)加入到碳酸钠水溶液(10ml)中，ph值约为9。搅拌至均匀分散后，加入l-赖氨酸(0.1mmol)，继续搅拌1h后，逐滴加入a3(9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯，fmoc-osu,0.09mmol)，反应5h后，停止反应。因本发明制备获得的产物在ph＞3时难溶于乙酸乙酯，在ph为2～3时可溶于乙酸乙酯，故用稀盐酸将ph值调至2～3，随后再将产物溶于乙酸乙酯(3ml)，过滤，取滤液。高效液相色谱分离，得终产物b3，即nε-fmoc-l-赖氨酸，产率为18.3％，选择性＞97％。高效液相色谱分离条件为：流动相：acn/h2o(35/65)，紫外波长:208nm，流速：1ml/min，每针进样25μl。

b3为白色固体。谱图数据为：¹hnmr(dmso)dppm1.23-1.38(2h,m,ch2)；1.56-1.69(2h,m,ch2)；1.69-1.72(2h,m,ch2)；2.96-2.97(h,m,ch)；3.12(2h,m,ch,ch)；4..21-4.23(h,m,ch)；4.38-4.30(2h,m,ch2)；7.32-7.90(8h,m,ar)。¹³cnmr(dmso)δ171.26,156.53,144.01,141.30,128.10,127.70,125.62,120.52,65.56,52.32,46.98,29.80,29.08,21.92。msm/z:369.1861(m⁺)。