一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒及其使用方法与流程

本发明属于生物医学与器官芯片领域，具体公开了一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒及其使用方法。

背景技术：

随着器官芯片技术的发展，研究者们已经研发出多种器官芯片，包括：肺芯片、肝芯片、肠芯片、肾芯片、肿瘤芯片、等等。这些器官芯片可以为培养的不同组织细胞提供接近体内的仿生微环境，例如：流体剪切力、三维培养、机械力，等，从而促进细胞在芯片内再现接近体内组织器官的结构与功能。因此，研究者们认为在不久的将来，器官芯片技术将会取代或部分取代现有的动物实验，从而极大程度的降低生物医学、新药研发的成本，同时可以有效的缩短新药研发的周期。

虽然，现有的器官芯片技术已经可以为组织细胞提供仿生的微环境。然而，因为人体内的不同组织的含氧量存在着极大的差异，例如：肺的含氧量极高，而肠道内几乎为无氧环境。传统的器官芯片设备中缺乏能够灵活调节氧气浓度的装置。

技术实现要素：

针对以上不足，本发明在器官芯片技术的基础上，设计了一种可以调节氧气浓度的培养盒及其使用方法，依据该方法，该培养盒可以根据需求调节腔室内的氧气浓度，从而满足不同组织器官细胞培养室对氧浓度的需求。此外，利用本发明还可以用于考察在不同氧气环境下，对不同组织器官的作用。

本发明的技术方案如下：

一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养盒由培养盒盖子和培养盒底座上下两个部分组成；所述培养盒盖子可以盖在所述培养盒底座并上形成一个细胞培养的密闭空间；所述培养盒盖子上穿设有通气管路；所述培养盒底座上穿设有排气管路；所述通气管路上设置有通气阀门和排气阀门；所述培养培养盒盖子还设有至少一个培养基出盒接头和至少一个培养基进盒接头；所述培养盒底座内放置有器官芯片、至少一个培养基储液池和废液池；所述培养基储液池通过管道连接所述培养基出盒接头；所述器官芯片上分别设置有芯片培养基入口接头和芯片培养基出口接头，所述芯片培养基入口接头通过管道连接所述培养基进盒接头，所述芯片培养基出口接头通过管道连接所述废液池。

使用本方案时，将培养基储液池通过管道连接所述培养基出盒接头、培养基出盒接头再通过管道连接培养基输送机构，所述培养基输送机构可以为实验室中常用的各种泵；所述管道再回流连接到培养基进盒接头上，将接种好细胞的器官芯片放在培养盒底座里，芯片培养基入口接头通过管道连接培养基进盒接头，芯片培养基出口接头通过管道连接所述废液池，将培养盒盖子和培养盒底座密封好，保证内部腔室的密封；将细胞培养所需的气瓶，例如氮气钢瓶先连接一个孔径为0.22微米的滤膜，再连接到通气管路；将氧气检测装置，例如数显的氧气检测仪连接孔径0.22微米的滤膜后连接到排气管路或直接放置在密封的腔室内，将通气阀门和排气阀门打开，再打开气瓶，让新的气体进入培养盒，并排出原培养盒腔室内的气体；通气3-10分钟，或氧气检测装置显示达到目标浓度后，关闭气瓶，并将培养盒上的通气阀门和排气阀门调整到关闭状态；最后将培养盒放置到培养箱中，打开培养基输送机构进行培养。

所述培养盒只是提供一个空间，其中的器官芯片、培养基储液池、培养盒上的管道和接头数量等都可以通过需要进行数量的增减，以满足实际培养的需要，例如当需要进行多种细胞培养时，相应的可以为每一种细胞配备单独的培养基储液池，并增加进入培养盒的管路和接头。

进一步的，上述一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养基储液池上方设置有密封盖子；所述密封盖子上有储液池培养基出口接头和气压平衡孔；所述储液池培养基出口接头通过管道连接所述培养基出盒接头；所述气压平衡孔用0.22微米滤膜封闭。使用滤膜是为了防止细菌污染。

进一步的，上述一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养盒盖子外部设置有蠕动泵，所述培养基出盒接头上连接有管道，所述管道经过所述蠕动泵再连接到所述培养基进盒接头上。

进一步的，上述一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养盒底座中还设置有无菌水器皿。放置无菌水器皿，在其中放置无菌水，保持培养盒内的湿度。

进一步的，上述一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养基出盒接头或培养基进盒接头选自鲁尔接头或宝塔样接头；所述培养基出盒接头或培养基进盒接头设置的数量根据培养的需求进行增减。

进一步的，上述一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述器官芯片至少含有一个培养基入口，一个细胞培养区域，以及一个废液出口。

进一步的，上述一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养盒盖子的横截面为圆形，内径为10-30厘米，高度为10-20厘米，壁厚为0.5-2厘米；所述通气管路长度为5-10厘米，该管路内径为2-5毫米，外径为5-15毫米；所述培养盒底座的横截面为圆形，内径为10-30厘米，高度为10-20厘米，壁厚为0.5-2厘米；所述排气管路长度为5-10厘米，该管路内径为2-5毫米，外径为5-15毫米。

进一步的，上述一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养盒盖子和培养盒底座的开口的边缘有一圈裙边，通过在裙边的上下面用螺丝螺孔密封连接、螺帽螺柱连接或者外置夹子配合密封垫片等方法来进行密封连接。

进一步的，上述一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养盒为透明的塑料材质。使用透明材质可以很方便的从外部对培养情况进行观察。

进一步的，上述可调节氧气浓度的器官芯片培养盒的使用方法，包括以下步骤：

1）将培养盒所有部件进行灭菌，灭菌方法选自酒精、漂白水、双氧水的擦拭方法或紫外照射灭菌；

2）使用前，确保培养盒的通气阀门和排气阀门处于关闭状态；

3）为保持培养盒内的湿度，将盛有10-40毫升无菌水的无菌水器皿放置在培养盒底座中；

4）将培养基储液池通过管道连接所述培养基出盒接头、培养基出盒接头再通过管道连接蠕动泵，所述管道再回流连接到培养基进盒接头上；

5）将接种好细胞的器官芯片放在培养盒底座里，芯片培养基入口接头通过管道连接培养基进盒接头，芯片培养基出口接头通过管道连接所述废液池；

6）将培养盒盖子和培养盒底座密封好，保证内部腔室的密封；

7）将所需的气瓶先连接一个孔径为0.22微米的滤膜，再连接到通气管路；

8）将氧气检测装置连接孔径0.22微米的滤膜后连接到排气管路，可选的，氧气浓度检测装置可以直接放置在密封的腔室内；

9）将通气阀门和排气阀门打开，再打开气瓶，让气体从培养盒的上部进入，并将培养盒腔室内原有气体从培养盒底座排出；

10）通气3-10分钟，或氧气检测装置显示达到目标浓度后，关闭气瓶，并将培养盒上的通气阀门和排气阀门调整到关闭状态；

11）最后将培养盒放置到培养箱中，打开蠕动泵进行培养；

12）培养结束后，关闭蠕动泵后从培养箱中取出培养盒；

13）打开培养盒盖子上的通气阀门和排气阀门；

14）打开培养盒盖子，破除密封；

15）解除器官芯片与培养基储液池和废液池连接的管道后，将器官芯片从培养盒底座中取出；

16）将培养盒所有部件清洗干净，灭菌备用。

从上述技术方案可以得出，本发明具有如下有益效果：本发明公开了一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒及其使用方法，可以模拟体内不同组织器官的氧气浓度，例如：低氧、厌氧等，使器官芯片内培养的组织细胞具有更接近体内的微环境，从而使器官芯片具有更仿生的功能。本发明还可以用于考察不同氧浓度对不用组织器官的作用。

附图说明

附图1为实施例1中一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒的示意图；

附图2为实施例2中一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒的示意图；

其中：10第一培养空间、20第二培养空间、100培养盒盖子、101通气管路、102通气阀门、103培养基出盒接头、104培养基进盒接头、200培养盒底座、201排气管路、202排气阀门、300器官芯片、301芯片培养基入口接头、302芯片培养基出口接头、400培养基储液池、410密封盖子、411储液池培养基出口接头、412气压平衡孔、500废液池、600蠕动泵、700无菌水器皿、800裙边。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

实施例1

如图1所示的一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养盒由培养盒盖子100和培养盒底座200上下两个部分组成；所述培养盒盖子100可以盖在所述培养盒底座200并上形成一个细胞培养的密闭空间；所述培养盒盖子100上穿设有通气管路101；所述培养盒底座200上穿设有排气管路201；所述通气管路101上设置有通气阀门102和排气阀门202；所述培养培养盒盖子100还设有培养基出盒接头103和培养基进盒接头104；所述培养盒底座200内放置有器官芯片300、至少一个培养基储液池400和废液池500；所述培养基储液池400通过管道连接所述培养基出盒接头103；所述器官芯片300上分别设置有芯片培养基入口接头301和芯片培养基出口接头302，所述芯片培养基入口接头301通过管道连接所述培养基进盒接头104，所述芯片培养基出口接头302通过管道连接所述废液池500。

工作原理：将培养基储液池400通过管道连接所述培养基出盒接头103、培养基出盒接头103再通过管道连接培养基输送机构（图中未示出），所述管道再回流连接到培养基进盒接头104上，将接种好细胞的器官芯片300放在培养盒底座200里，芯片培养基入口接头301通过管道连接培养基进盒接头104，芯片培养基出口接头302通过管道连接所述废液池500，将培养盒盖子100和培养盒底座200密封好，保证内部腔室的密封；将所需的气瓶（图中未示出）先连接一个孔径为0.22微米的滤膜，再连接到通气管路101；将氧气检测装置连接孔径0.22微米的滤膜后连接到排气管路201，将通气阀门102和排气阀门202打开，再打开气瓶，让气体从培养盒的上部进入，并将培养盒腔室内原有气体从培养盒底座排出；通气3-10分钟，或氧气检测装置显示达到目标浓度后，关闭气瓶，并将培养盒上的通气阀门102和排气阀门202调整到关闭状态；最后将培养盒放置到培养箱（图中未示出）中，打开培养基输送机构（图中未示出）进行培养。

实施例2

如图2所示的一种可调节氧气浓度的器官芯片培养盒，所述培养盒由培养盒盖子100和培养盒底座200上下两个部分组成；所述培养盒盖子100可以盖在所述培养盒底座200并上形成一个细胞培养的密闭空间；所述培养盒盖子100上穿设有通气管路101；所述培养盒底座200上穿设有排气管路201；所述通气管路101上设置有通气阀门102和排气阀门202；所述培养培养盒盖子100还设有培养基出盒接头103和培养基进盒接头104；所述培养盒底座200内放置有器官芯片300、至少一个培养基储液池400和废液池500；所述培养基储液池400通过管道连接所述培养基出盒接头103；所述器官芯片300上分别设置有芯片培养基入口接头301和芯片培养基出口接头302，所述芯片培养基入口接头301通过管道连接所述培养基进盒接头104，所述芯片培养基出口接头302通过管道连接所述废液池500；特别的，所述培养基储液池400上方设置有密封盖子410；所述密封盖子上有储液池培养基出口接头411和气压平衡孔412；所述储液池培养基出口接头411通过管道连接所述培养基出盒接头103；所述气压平衡孔412用0.22微米滤膜封闭；优选的，所述培养盒盖子100外部设置有蠕动泵600，所述所述培养基出盒接头103上连接有管道，所述管道经过所述蠕动泵600再连接到所述培养基进盒接头104上；进一步的，所述培养盒底座200中还设置有无菌水器皿700；优选的，所述培养基出盒接头103或培养基进盒接头104选自宝塔样接头；进一步的，所述培养盒盖子100的横截面为圆形，内径为10-30厘米，高度为10-20厘米，壁厚为0.5-2厘米；所述通气管路101长度为5-10厘米，该管路内径为2-5毫米，外径为5-15毫米；所述培养盒底座200的的横截面为圆形，内径为10-30厘米，高度为10-20厘米，壁厚为0.5-2厘米；所述排气管路201长度为5-10厘米，该管路内径为2-5毫米，外径为5-15毫米；特别的，所述培养盒盖子100和培养盒底座200的开口的边缘有一圈裙边800，通过在裙边800的上下面用螺丝螺孔密封连接；优选的，所述培养盒由pmma材质制造。

工作原理参看实施例1。

实施例3

利用实施例1中所述的可调节氧气浓度的器官芯片培养盒进行低氧环境下的类神经元芯片培养，考察低氧对神经元的影响。将小鼠的海马神经元细胞接种在可灌流的轴突培养微流控器官芯片内，先放置在培养箱内静置培养，使神经元细胞粘附在器官芯片内生长。

培养盒按照以下步骤进行使用：

1）将培养盒所有部件进行灭菌，灭菌方法选自酒精、漂白水、双氧水的擦拭方法或紫外照射灭菌，；

2）使用前，确保培养盒的通气阀门102和排气阀门202处于关闭状态；

3）将培养基储液池400通过管道连接所述培养基出盒接头103、培养基出盒接头103再通过管道连接培养基输送机构（图中未示出），所述管道再回流连接到培养基进盒接头104上；

4）将接种好神经元细胞的器官芯片300放在培养盒底座200里，芯片培养基入口接头301通过管道连接培养基进盒接头104，芯片培养基出口接头302通过管道连接所述废液池500；

5）将培养盒盖子100和培养盒底座200密封好，保证内部腔室的密封；

6）将所需的气瓶先连接一个孔径为0.22微米的滤膜，再连接到通气管路101；

7）将氧气检测装置连接孔径0.22微米的滤膜后连接到排气管路201；

8）将通气阀门102和排气阀门202打开，再打开气瓶，让气体从培养盒的上部进入，并将培养盒腔室内原有气体从培养盒底座200排出；

9）通气3-10分钟，或氧气检测装置显示达到目标浓度后，关闭气瓶，并将培养盒上的通气阀门102和排气阀门202调整到关闭状态；

10）最后将培养盒放置到培养箱中，打开培养基输送机构（图中未示出）进行培养；

11）培养结束后，关闭培养基输送机构（图中未示出）后从培养箱中取出培养盒；

12）打开培养盒盖子100上的通气阀门102和排气阀门202；

13）打开培养盒盖子100，破除密封；

14）解除接种有神经元细胞的器官芯片300与培养基储液池400和废液池500连接的管道后，将器官芯片300从培养盒底座200中取出；

15）将培养盒所有部件清洗干净，灭菌备用。

实施例4

利用实施例2中所述的可调节氧气浓度的器官芯片培养盒进行厌氧环境下的培养肠芯片。将caco-2细胞和血管内皮细胞接种在一种可灌流培养的上下层结构的器官芯片300内，构建肠芯片。

1）将培养盒所有部件进行灭菌，灭菌方法选自酒精、漂白水、双氧水的擦拭方法或紫外照射灭菌，；

2）使用前，确保培养盒的通气阀门102和排气阀门202处于关闭状态；

3）为保持培养盒内的湿度，将盛有10毫升无菌水的无菌水器皿700放置在培养盒底座200中；

4）将盛有两个盛有10毫升培养基的培养基储液池400放在培养盒底座200里；

5）将每个培养基储液池400分别通过管道连接所述培养基出盒接头103、培养基出盒接头103再通过管道连接蠕动泵600，所述管道再回流连接到培养基进盒接头104上；

6）将培养好的肠芯片300组装好，放在培养盒底座200里，芯片上层和下层分别独立的有管道连接培养基入口接头301，所述培养基入口接头301分别通过管道连接培养基进盒接头104（培养基进盒接头104此处设置有两个，可以分别的独立为芯片上层和下层进行灌注培养基），芯片上层和下层分别独立的有管道连接芯片培养基出口接头302，所述芯片培养基出口接头302通过管道连接所述废液池500（所述废液池可以共用，也可以分别单独设置）；

7）将培养盒盖子100和培养盒底座200密封好，保证内部腔室的密封；

8）将所需的气瓶先连接一个孔径为0.22微米的滤膜，再连接到通气管路101；

9）将氧气检测装置连接孔径0.22微米的滤膜后连接到排气管路201；

10）将通气阀门102和排气阀门202打开，再打开气瓶，让气体从培养盒的上部进入，并将培养盒腔室内原有气体从培养盒底座200排出；

11）通气3-10分钟，或氧气检测装置显示达到目标浓度后，关闭气瓶，并将培养盒上的通气阀门102和排气阀门202调整到关闭状态；

12）最后将培养盒放置到培养箱中，打开蠕动泵600进行培养；

13）培养结束后，关闭蠕动泵600后从培养箱中取出培养盒；

14）打开培养盒盖子100上的通气阀门102和排气阀门202；

15）打开培养盒盖子100，破除密封；

16）解除肠器官芯片300与培养基储液池400和废液池500连接的管道后，将器官芯片300从培养盒底座200中取出，进行后续相关实验；

17）将培养盒所有部件清洗干净，灭菌备用。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。