一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qpcr定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术：

植物寄生线虫是水稻生产上的重要病原物，其中危害最为严重的是拟禾本科根结线虫(meloidogynegraminicola)。该线虫是水稻上重要的内寄生线虫，广泛分布于南亚、东南亚、非洲、美洲和欧洲等国家的水稻产区，引起水稻根结线虫病(riceroot-knotdisease)，通常造成水稻减产11％至80％(mantelinetal.，2017)，甚至达100％，严重影响水稻产业的稳定发展。近年来，随着国内耕作模式的改变，特别是直播水稻田面积的逐年增加，由拟禾本科根结线虫引起的水稻根结线虫病扩散蔓延迅速，危害越来越严重。2016年至2019年，我国的湖南、湖北、江西、江苏、海南、广西等多地水稻根结线虫病严重发生，引起水稻大面积减产。拟禾本科根结线虫寄主范围广，危害隐蔽，防治极其困难。目前常用的低毒杀线虫剂大多用于旱地作物线虫病害的防治，而能直接用于水田根结线虫病害防控的安全有效、且低成本的防治措施非常有限。特别是作物定植之后再进行水稻根结线虫病害防治尤其困难。所以，开展稻田土壤样品中拟禾本科根结线虫病原快速、定量检测，对水稻根结线虫病的早期预警和实施有效防控措施具有极其重要的意义。

目前，拟禾本科根结线虫病原鉴定和检测方法主要包括传统的形态学分离鉴定和以及pcr检测鉴定(htayetal.,2016)。但是传统的形态学分离鉴定或pcr检测鉴定都需要将线虫从待检测的土壤样品中进行分离和在显微镜下进行初步的形态学观察及挑取线虫等过程，既费时费力，又需要操作人员具备专业的技能和丰富的经验，不能满足快速检测的需要。

qpcr检测鉴定技术通过提取土壤中生物总dna，快速有效检测土壤dna中拟禾本科根结线虫，并能定量检测土壤中拟禾本科根结线虫的种群密度，为拟禾本科根结线虫的早期预警和制定有效防控措施提供技术支撑。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qpcr定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用，试剂盒用于拟禾本科根结线虫的qpcr定量检测，具有特异性强，灵敏度高、操作简单的特点。对待检样品要求低，可直接应用于土壤中拟禾本科根结线虫的检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qpcr检测的引物组合物，所述引物组合物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示；

所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qpcr检测的试剂盒，包括上述的引物组合物及sybrpremixextaq。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

进一步地，所述阳性对照品包括拟禾本科根结线虫基因组dna；所述阴性对照品包括灭菌ddh2o。

本发明还提供一种上述的试剂盒在检测寄主根围土壤中拟禾本科根结线虫中的应用。

进一步地，所述应用的应用方法，包括以下步骤：

(1)提取待检样品的土壤dna；

(2)以待检样品的土壤dna为模板，利用所述试剂盒进行qpcr扩增反应，收集荧光数据；

(3)分析所述荧光数据的ct值和琼脂糖凝胶电泳结果来判断是否存在拟禾本科根结线虫；当ct值>36或显示n/a，且无明显的扩增曲线，则表示待测样品中不含拟禾本科根结线虫；当29.708＜ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，则根据琼脂糖凝胶电泳检测结果条带有无来判断是否存在拟禾本科根结线虫；当ct值≤29.708，且有明显的扩增曲线，则表示待测样品中含有拟禾本科根结线虫；

(4)当ct值≤29.708时，按照公式(ⅰ)计算待测样品中拟禾本科根结线虫数量x，所述拟禾本科根结线虫数量x的单位为条(j2)；

x＝10^{(29.708-ct值)/3.146}(ⅰ)。

进一步地，步骤(2)中所述qpcr扩增反应体系为20μl，包括：待测样品基因组dna1μl，上游引物0.4μl(浓度10μm)，下游引物0.4μl(浓度10μm)，sybrpremixextaq10μl，灭菌ddh2o8.2μl。

进一步地，步骤(2)中所述qpcr扩增反应的程序为：95℃30s，[95℃5s、64℃30s，39个循环]，72℃30s，反应结束。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明提供了一种用于qpcr检测土壤中拟禾本科根结线虫的引物组合物，该引物组合物是根据拟禾本科根结线虫scar序列测定结果设计筛选出引物，特异性强，只对含有拟禾本科根结线虫土壤样品检测结果才有荧光信号。

(2)本发明提供了一种用于检测土壤中拟禾本科根结线虫的试剂盒，其灵敏度高，在0.5g土壤中对拟禾本科根结线虫的检测灵敏度可达到0.01条j2幼虫，比常规普通pcr检测灵敏度高100倍。

(3)本发明提供了一种试剂盒在检测拟禾本科根结线虫中的应用，土壤样品总dna提取简便快速，不需要对待检测的土壤或根样进行线虫分离、显微镜下形态鉴定及挑虫等操作过程，直接提取土壤或根样总dna进行快速检测，从提取土壤总dna到获得检测结果仅需要3h左右，耗时短、操作简单。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为引物的qpcr检测以及溶解曲线，其中，1为以拟禾本科根结线虫，2为去离子水为模板扩增；

图2为引物的特异性检测，其中，1为拟禾本科根结线虫，2-7分别南方根结线虫、象耳豆根结线虫、旱稻孢囊线虫、柑橘半穿刺线虫、矮化属线虫和咖啡短体线虫，8为去离子水对照；

图3为优化的qpcr体系灵敏度检测，其中，a为qpcr检测，b为普通pcr检测；泳道1-8为0.5g分别含有10、5、1、10-1、10-2、10-3、10-4和0条拟禾本科根结线虫二龄幼虫；

图4为土壤中拟禾本科根结线虫数量与ct值的关系的定量检测标准曲线；

图5为土壤样品中j2数量与ct值间的相关性曲线，其中，“×”表示田间土壤样品的ct值。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

本发明提供一种用于检测植物根围土壤中拟禾本科根结线虫的qpcr检测试剂盒，以及所述试剂盒在检测土壤中拟禾本科根结线虫上的应用。

所述试剂盒包括下述引物组合物，该引物组合物包括：

上游引物mg-f：5’-gcatcttcacatcatcattcctc-3’(seqidno.1)；

下游引物mg-r：5’-ttcacgtcctattgccgtagttt-3’(seqidno.2)。

所述试剂盒还包括sybrpremixextaq(大连takara公司))、阳性对照品和阴性对照品；阳性对照品为拟禾本科根结线虫基因组dna；阴性对照品为灭菌ddh2o。

所述试剂盒在检测土壤中拟禾本科根结线虫的具体应用方法，包括以下步骤：

(1)提取待检土壤dna：取水稻根结线虫病发生田块水稻根围土壤，本发明实施例使用mpbiomedicals公司的fastspinkitforsoil试剂盒提取土壤总dna(具体操作方法参见试剂盒说明书)，该试剂盒只是示例性列出，不应被理解为本发明对提取dna所用试剂盒的限定。

(2)qpcr检测反应体系：qpcr反应体系的总体积为20μl，包括1μl土壤dna模板，0.4μl上游引物mg-f和0.4μl下游引物mg-r，10μlsybrpremixextaq，8.2μl去离子水，所述上游引物mg-f和下游引物mg-r使用浓度为10μm。

(3)qpcr扩增反应程序优选为：95℃30s，[95℃5s、64℃30s，39个循环]，72℃30s，反应结束；所述72℃30s这一阶段收集荧光数据；所述qpcr扩增反应的设备优选为bio-radcfx-96(bio-radlaboratories，usa)。

(4)收集荧光数据后，分析荧光数据的ct值和琼脂糖凝胶电泳检测结果来判断是否存在拟禾本科根结线虫。当ct值>36或显示n/a，且无明显的扩增曲线，则表示待测样品中不含拟禾本科根结线虫；当29.708＜ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，则根据琼脂糖凝胶电泳检测结果条带有无来判断是否存在拟禾本科根结线虫；当ct值≤29.708，且有明显的扩增曲线，则表示待测样品中含有拟禾本科根结线虫。

(5)当ct值≤29.708时，按照公式(ⅰ)计算待测样品中拟禾本科根结线虫数量x，所述拟禾本科根结线虫数量x的单位为条(j2)；

x＝10^{(29.708-ct值)/3.146}(ⅰ)。

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1拟禾本科根结线虫qpcr引物设计

本实施例1的引物组合物是根据拟禾本科根结线虫scar区域序列的测序结果，利用在线引物设计软件primerexplorerv5设计并筛选得到，具体的步骤如下：

(1)拟禾本科根结线虫dna的提取：

挑取单条线虫放入含有8μlddh2o和1μl10×pcrbuffer(mg²⁺free)的200μlpcr管中，放入液氮中冷冻1min后，置于95℃下热激2min。重复冷冻、热激步骤5次。然后向pcr管中加入1μl浓度为1mg/ml蛋白酶k，在65℃温育15min，95℃反应10min，获得dna提取液。前述dna提取液可直接用于qpcr和pcr反应。

(2)拟禾本科根结线虫scar序列扩增：利用已报道拟禾本科根结线虫pcr方法，进行pcr扩增并进行序列测定，得到拟禾本科根结线虫scar序列。具体包括以下步骤：

①pcr扩增引物为scar-mgfw(5’-ggggaagacatttaattgatgatcaac-3’)和scar-mgrev(5’-ggtaccgaaacttagggaaag-3’)。

②以(1)步骤中的dna提取液为模板，以①步骤中的引物，扩增前述dna提取液中拟禾本科根结线虫scar区片段，得到pcr扩增产物。

pcr扩增反应体系(25μl)：

pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

(3)测序：将步骤(2)中得到的pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析后，回收、克隆并测序。序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

测序结果参见seqidno.3，具体为：

(4)qpcr引物设计：根据测序结果，利用在线引物设计软件primerexplorerv5设计并筛选得到下述qpcr引物：

上游引物mg-f：5’-gcatcttcacatcatcattcctc-3’(seqidno.1)；

下游引物mg-r：5’-ttcacgtcctattgccgtagttt-3’(seqidno.2)。

(5)引物检测：以步骤(1)中提取的拟禾本科根结线虫dna为模板，进行qpcr扩增，检测引物的扩增效率。qpcr反应体系的总体积为20μl，包括1μldna模板，0.4μl上游引物mg-f(10μm)和0.4μl下游引物mg-r(10μm)，10μlsybrpremixextaq，8.2μl去离子水。qpcr扩增反应程序为：95℃30s，[95℃5s、64℃30s，39个循环]，72℃30s，反应结束。采集的荧光数据分析结果如图1所示，泳道1为拟禾本科根结线虫dna模板，泳道2为去离子水对照。表明设计筛选的引物出现典型的扩增曲线，在77.4℃具有单一的熔解峰，而去离子水对照中没有明显的扩增曲线和熔解峰。

实施例2引物特异性检测

收集南方根结线虫(m.incognita)、象耳豆根结线虫(m.enterolobii)、旱稻孢囊线虫(heteroderaelachista)、柑橘半穿刺线虫(tylenchulussemipenetran)、矮化属线虫(tylenchorhynchusspp)和咖啡短体线虫(pratylenchuscoffeae)，分别提取其dna作为模板与拟禾本科根结线虫dna模板，按照实施例1的方法进行qpcr检测，以验证拟禾本科根结线虫qpcr检测方法中引物的特异性。

图2为采集的荧光数据结果，结果表明，只有拟禾本科根结线虫能出现典型的扩增曲线(泳道1)，而其它植物线虫无扩增曲线(泳道2-7)。

实施例3引物灵敏度检测

利用贝氏漏斗法从土壤中分离获得拟禾本科根结线虫，称取无拟禾本科根结线虫污染0.5g土壤样品，分别加入拟禾本科根结线虫二龄幼虫0条、1条、5条、10条，利用mpbiomedicals公司的fastspinkitforsoil试剂盒提取土壤总dna，并利用含1条二龄幼虫的土壤dna样品进行梯度稀释，分别稀释10倍、100倍、1000倍和10000倍，即相当于dna样品中分别含有10^-1条,10^-2条,10^-3条和10^-4条二龄幼虫。利用提取的土壤dna及稀释样品按照实施例1的方法进行qpcr扩增，扩增结果如图3a所示。从图3中看出，泳道1-5分别为0.5g土壤中含有10条、5条、1条、10^-1条和10^-2条二龄幼虫，而10^-3条、10^-4条和0条样品中没有明显扩增曲线，而利用普通pcr检测只能扩增到单条线虫(如图3b)，说明qpcr检测其灵敏度比普通pcr扩增提高了100倍。

实施例4标准曲线的建立

分别向0.5g无拟禾本科根结线虫污染的土壤中加入1,5,50,500,1,000和10,000条拟禾本科根结线虫二龄幼虫，利用mpbiomedicals公司的fastspinkitforsoil试剂盒提取土壤总dna，按照实施例1的方法进行qpcr扩增。根据qpcr扩增中采集的荧光数据的ct值与0.5g土壤中含有的拟禾本科根结线虫二龄幼虫数量对数值的关系进行标准曲线的绘制。结果如图4所示，土壤中含有的二龄幼虫对数值(x)与对应的qpcr中ct值(y)之间存在的线性关系为：y＝-3.146x+29.708(r²＝0.970)。

实施例5qpcr检测体系的应用

应用建立的qpcr检测体系进行稻田土壤中拟禾本科根结线虫定量检测。采集不同发病田块稻田31个土壤样品，如表1所示，利用贝氏漏斗法进行二龄幼虫的分离，显微镜下进行计数，从表1中可以看出，通过分离计数法采集的土壤样品中含有的拟禾本科根结线虫j2的数量每100g土壤中含有0-5000条。利用建立的qpcr检测体系进行土壤样品检测，结果表明100g土壤中只要含有22条(显微计数)拟禾本科根结线虫j2就能通过qpcr检测出来，而利用普通pcr检测，则100g土壤中需要211条(显微计数)拟禾本科根结线虫j2才能被检测到。而且通过qpcr标准曲线与扩增曲线的ct值，计算出土壤中线虫数量与显微观察计数存在明显的相关性(如图5所示)，其相关系数为0.477，p＝0.0160(p＜0.05)。

表1田间土壤样品信息表

注：+代表检出；-代表未检出。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>湖南省植物保护研究所

<120>一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qpcr定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcatcttcacatcatcattcctc23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttcacgtcctattgccgtagttt23

<210>3

<211>639

<212>dna

<213>拟禾本科根结线虫(meloidogynegraminicola)

<400>3

ggggaagacatttaattgatgatcaacaagttgattcaatgcaagatgaggatgaggagg60

aagagggttatgatggtggaggttatttagaaggaatgggagaagctgttcacggagatc120

aaggtatttatatatatttttaattaaatattcttttcttaaggtgatgacttttcggca180

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