针对柯萨奇病毒b1型的单克隆抗体及其用途
技术领域：
：1.本发明涉及免疫学领域和病毒学领域，特别是柯萨奇病毒b1型的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及针对柯萨奇病毒b1型的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物(例如，诊断剂和治疗剂)。此外，本发明还涉及所述抗体或其抗原结合片段的用途。本发明的抗体或其抗原结合片段可用于诊断、预防和/或治疗柯萨奇病毒b1型的感染和/或由所述感染引起的疾病。
背景技术：
：：2.柯萨奇病毒b1型(以下简称cvb1)，属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属。研究显示，cvb1感染可导致无菌性脑膜炎、心肌炎、脑膜脑炎、手足口病、胸痛以及新生儿爆发性肝炎伴凝血障碍等(美国国家cdc，2010，发病率和死亡率周报(morbidityandmortalityweeklyreport)59(48):1577-80)，有证据表明cvb1感染还与一些慢性疾病相关，如i型糖尿病(oikarinen等人，2014，糖尿病(diabetes)63(2):655-62)。cvb1为单股正链rna病毒，基因组全长约7500bp。其病毒颗粒为正二十面体结构，无包膜和突起，直径约30nm，其蛋白外壳由结构蛋白vp1、vp2、vp3和vp4构成，中和表位主要在vp1、vp2和vp3上，其中，vp1蛋白是其主要的抗原表位决定区域，而vp4因包裹在衣壳内部，序列高度保守且较少中和表位报道。3.自20世纪90年代以来，柯萨奇病毒b1型总体循环水平逐渐增加。美国1970-2005年国家肠道病毒检测系统报道的52812例肠道病毒患者的病毒鉴定结果显示，cvb1感染率约为2.3％，同时在36年的研究期间中cvb1有17年为年流行肠道病毒型别前15位，1977年更成为年度流行株第二位(khetsuriani等人，2006，发病率与死亡率周报(mmwr)59(48):1577-80)。2010年，美国国家cdc数据显示在2006-2008年间，cvb1为主要的肠道病毒病原体，2006年cvb1处于年度流行株第九位(3.7％)，2007年及2008年则分别占非脊髓灰质炎肠道病毒阳性样本的23.6％和18.6％，均位于第一位，同时在3年中cvb1占总肠道病毒阳性样本比例的首位(16.5％)(美国国家cdc，2010，发病率与死亡率周报(mmwr)59(48)；1577-1580)。中国大陆地区的研究显示，在2002-2012年中国浙江的病毒性脑炎病例和2006-2012年山东省的无菌性脑膜炎患者中均发现了cvb1的流行。此外，在2008-2009年间韩国也发现了cvb1流行感染。4.目前，疫苗免疫被认为是防止肠道病毒感染的最有效且最便捷的方法。研究发现多种肠道病毒存在两种类型的病毒颗粒：空心颗粒(无rna，无感染性)，实心颗粒(有rna，具有感染性)，且这两种病毒颗粒均具有免疫原性。脊髓灰质炎疫苗是目前研究较为成熟且应用成功的疫苗，同属于肠道病毒属的脊髓灰质炎病毒也存在实心和空心两种类型的颗粒，并且实心颗粒抗原可激发人体产生中和抗体，是主要的保护性抗原(mayer等人，1957，免疫学杂志(journalofimmunology)78,435-455.)，因此脊髓灰质炎疫苗的有效成分是以实心颗粒抗原的含量来衡量的。研究显示，cvb1病毒颗粒经过灭活后具有较好的免疫原性，小鼠在接种过灭活病毒颗粒后能在体内产生较强的中和抗体，保护自身免受cvb1病毒的致死性攻击(hankaniemi等人，2017，vaccine，35(30):3718-3725)。其他肠道病毒如ev71(wu等人，2019，plosone，14(1):e0210553)与cva16(chong等人，2012，plosone,7(11):e49973)的相关研究也显示实心颗粒抗原可能在病毒疫苗的免疫原性方面起到重要的作用，故开展对cvb1病毒实心颗粒抗原检测方面的研究是十分必要的。目前尚未有关于cvb1实心颗粒抗原检测方法的报道。因此，获得可特异结合cvb1病毒实心颗粒的单克隆抗体并建立cvb1实心颗粒抗原相关检测方法，对cvb1疫苗的研发及质控具有非常重要的意义。技术实现要素：5.本技术的发明人经过了深入的研究和创造性的劳动，获得了能够特异性结合cvb1病毒实心颗粒和/或空心颗粒的单克隆抗体，并基于此建立了可特异性检测cvb1病毒实心颗粒的检测方法。此外，所获得的单克隆抗体亦能够高效中和cvb1病毒，阻断或抑制病毒对细胞的感染，因此该单克隆抗体具有预防和治疗cvb1感染以及与cvb1感染相关的疾病的潜力。由此提供了下述发明。6.本发明的抗体7.在一个方面，本发明提供了一种特异性结合柯萨奇病毒b1型(cvb1)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含下述根据imgt编号系统定义的互补决定区(cdrs)：8.(1)氨基酸序列分别如seqidno:5-7所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:8-10所示的vlcdr1-3；9.(2)氨基酸序列分别如seqidno:15-17所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:18-20所示的vlcdr1-3；或者10.(3)氨基酸序列分别如seqidno:25-27所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:28-30所示的vlcdr1-3。11.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：氨基酸序列分别如seqidno:5-7所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:8-10所示的vlcdr1-3。12.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)如seqidno:1所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，(b)如seqidno:2所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr。某些实施方案中，所述重链可变区(vh)中含有的3个cdr和/或所述轻链可变区(vl)中含有的3个cdr由kabat、chothia或imgt编号系统定义。在某些示例性实施方案中，所述重链可变区(vh)中含有的3个cdr和/或所述轻链可变区(vl)中含有的3个cdr由imgt编号系统定义。13.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：14.(i)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：seqidno：1所示的序列，或与seqidno：1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与seqidno：1相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；15.和/或，16.(ii)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：seqidno：2所示的序列，或与seqidno：2相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与seqidno：2相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。17.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：如seqidno:1所示的vh和如seqidno:2所示的vl。18.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段是5f5或其抗原结合片段、其嵌合抗体、或其人源化抗体，或它们的变体，所述变体基本保留了其所源自的单克隆抗体或其抗原结合片段的生物学功能。19.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具备以下生物学功能中的一项或多项：20.(a)特异性结合cvb1实心颗粒(感染性颗粒)，例如通过elisa测定；21.(b)基本不结合或不结合cvb1空心颗粒(非感染性颗粒)，例如通过elisa测定；22.(c)检测cvb1病毒(例如cvb1实心颗粒)在样品中的存在或其水平；23.(d)诊断受试者是否感染了cvb1病毒；24.(e)在体外或受试者(例如人)体内中和cvb1；例如以不低于6000(例如6000-10000，7000-10000，7000-9000，或8000-9000，例如约8100-8200)的中和效价在体外中和cvb1，例如通过实施例7所述的中和实验测定；25.(f)抑制或阻断cvb1对细胞的感染；26.(g)预防和/或治疗cvb1感染或与cvb1病毒感染相关的疾病。27.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：氨基酸序列分别如seqidno:15-17所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:18-20所示的vlcdr1-3。28.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(a)如seqidno:11所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，(b)如seqidno:12所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr。某些实施方案中，所述重链可变区(vh)中含有的3个cdr和/或所述轻链可变区(vl)中含有的3个cdr由kabat、chothia或imgt编号系统定义。在某些示例性实施方案中，所述重链可变区(vh)中含有的3个cdr和/或所述轻链可变区(vl)中含有的3个cdr由imgt编号系统定义。29.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：30.(i)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：seqidno：11所示的序列，或与seqidno：11相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与seqidno：11相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；31.和/或，32.(ii)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：seqidno：12所示的序列，或与seqidno：12相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与seqidno：12相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。33.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：如seqidno:11所示的vh和如seqidno:12所示的vl。34.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段是8a10或其抗原结合片段、其嵌合抗体、或其人源化抗体，或它们的变体，所述变体基本保留了其所源自的单克隆抗体或其抗原结合片段的生物学功能。35.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具备以下生物学功能中的一项或多项：36.(a)特异性结合cvb1实心颗粒(感染性颗粒)，例如通过elisa测定；37.(b)特异性结合cvb1空心颗粒(非感染性颗粒)，例如通过elisa测定；38.(c)检测cvb1病毒(例如cvb1实心颗粒及空心颗粒)在样品中的存在或其水平；39.(d)诊断受试者是否感染了cvb1病毒；40.(e)在体外或受试者(例如人)体内中和cvb1；例如以不低于10000(例如10000-15000，11000-15000，12000-15000，12000-14000，或13000-14000，例如约131000-131100)的中和效价在体外中和cvb1，例如通过实施例7所述的中和实验测定；41.(f)抑制或阻断cvb1对细胞的感染；42.(g)预防和/或治疗cvb1感染或与cvb1病毒感染相关的疾病。43.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：氨基酸序列分别如seqidno:25-27所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:28-30所示的vlcdr1-3。44.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)如seqidno:21所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，(b)如seqidno:22所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr。某些实施方案中，所述重链可变区(vh)中含有的3个cdr和/或所述轻链可变区(vl)中含有的3个cdr由kabat、chothia或imgt编号系统定义。在某些示例性实施方案中，所述重链可变区(vh)中含有的3个cdr和/或所述轻链可变区(vl)中含有的3个cdr由imgt编号系统定义。45.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：46.(i)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：seqidno：21所示的序列，或与seqidno：21相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与seqidno：21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；47.和/或，48.(ii)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：seqidno：22所示的序列，或与seqidno：22相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列，或与seqidno：22相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。49.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：如seqidno:21所示的vh和如seqidno:22所示的vl。50.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段是9a3或其抗原结合片段、其嵌合抗体、或其人源化抗体，或它们的变体，所述变体基本保留了其所源自的单克隆抗体或其抗原结合片段的生物学功能。51.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段具备以下生物学功能中的一项或多项：52.(a)特异性结合cvb1实心颗粒(感染性颗粒)，例如通过elisa测定；53.(b)特异性结合cvb1空心颗粒(非感染性颗粒)，例如通过elisa测定；54.(c)检测cvb1病毒(例如cvb1实心颗粒及空心颗粒)在样品中的存在或其水平；55.(d)诊断受试者是否感染了cvb1病毒；56.(e)在体外或受试者(例如人)体内中和cvb1；例如以不低于1000(例如1000-5000，1000-4000，1000-3000，或2000-3000，例如约2000-2100)的中和效价在体外中和cvb1，例如通过实施例7所述的中和实验测定；57.(f)抑制或阻断cvb1对细胞的感染；58.(g)预防和/或治疗cvb1感染或与cvb1病毒感染相关的疾病。59.在某些实施方案中，上述任一单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。在某些实施方案中，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的保守置换。60.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链包含鼠免疫球蛋白的重链恒定区(ch)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，61.所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链包含鼠免疫球蛋白的轻链恒定区(cl)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。62.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(ch)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；和/或，63.所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(cl)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)。64.在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区是鼠igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。在某些实施方案中，所述重链恒定区是人igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。65.在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。在某些实施方案中，所述轻链恒定区是鼠κ轻链恒定区。在某些实施方案中，所述轻链恒定区是人κ轻链恒定区。66.在某些实施方案中，上述任一单克隆抗体的抗原结合片段选自scfv、di-scfv、(scfv)2、fab、fab’、(fab’)2、fv、或二硫键稳定的fv(dsfv)。67.在某些实施方案中，上述任一单克隆抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。68.在本技术中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的生物学功能。69.衍生的抗体70.本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，单克隆抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对cvb1病毒的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(peg)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。71.在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素。72.在本文中，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，dynabeads)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。73.在某些实施方案中，所述可检测的标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。74.在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。75.抗体的制备76.本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的dna分子。将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。77.本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见morimotoetal.,j.biochem.biophys.methods24:107-117(1992)andbrennanetal.,science229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewedinhudson,curr.opin.immunol.11:548-557(1999)；littleetal.,immunol.today,21:364-370(2000))。比如，fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将fab’片段化学偶联形成f(ab’)2片段(carteretal.,bio/technology,10:163-167(1992))。另外，fv、fab或f(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。78.因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。79.在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。80.在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如cho(例如cho-k1、cho-s、chodg44)。81.在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。82.检测方法和试剂盒83.本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性结合cvb1病毒，从而可用于检测cvb1病毒在样品中的存在或其水平，以及任选地根据cvb1病毒在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了cvb1病毒。84.因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。85.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括二级抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述二级抗体还包括可检测的标记。86.在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含：带有可检测的标记的本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些示例性实施方案中，所述试剂盒包含：本发明的抗体或其抗原结合片段(例如不带有可检测的标记)，和带有可检测的标记的二级抗体。87.在某些实施方案中，所述试剂盒包含能够特异性结合cvb1的第一抗体和第二抗体，所述第一抗体和第二抗体彼此不同；其中，17所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:18-20所示的vlcdr1-3；或者(ii)氨基酸序列分别如seqidno:25-27所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:28-30所示的vlcdr1-3。102.在某些实施方案中，所述检测是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。103.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素。在某些实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料、放射性核素或生物素)的二级抗体来检测所述单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在cvb1病毒或cvb1病毒颗粒。104.在某些实施方案中，所述方法为双抗体夹心法，其包括以下步骤：105.(1)将所述样品与第一抗体接触，以形成抗体-抗原复合物，所述第一抗体选自包含下述cdr的单克隆抗体或其抗原结合片段：氨基酸序列分别如seqidno:5-7所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:8-10所示的vlcdr1-3；106.(2)使所述抗体-抗原复合物与能够特异性结合cvb1的第二抗体接触，以形成抗体-抗原-抗体复合物，所述第二抗体选自能够特异性结合cvb1的另外的单克隆抗体或其抗原结合片段、或者多克隆抗体；和107.(3)测定所述抗体-抗原-抗体复合物的量。108.在某些实施方案中，所述多克隆抗体是包含多克隆抗体的抗血清。所述抗血清是指经cvb1病毒免疫的免疫动物(例如非人哺乳动物，例如鼠、兔、羊等)的血清，其中包含针对cvb1的多克隆抗体。109.在某些实施方案中，所述第二抗体选自包含下述cdr的单克隆抗体或其抗原结合片段：110.(i)氨基酸序列分别如seqidno:15-17所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:18-20所示的vlcdr1-3；或者111.(ii)氨基酸序列分别如seqidno:25-27所示的vhcdr1-3，和/或，氨基酸序列分别如seqidno:28-30所示的vlcdr1-3。112.在某些实施方案中，所述第一抗体包被于固相载体的表面。113.在某些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的，例如可以根据cvb1病毒在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了cvb1病毒。在此类实施方案中，所述样品可以为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。114.在某些实施方案中，所述方法可以用于非诊断目的，例如所述样品并非来自受试者的样品，例如溶瘤病毒样品或疫苗样品。115.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。116.在另一个方面，提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测cvb1病毒在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了cvb1病毒。117.在某些实施方案中，所述检测是免疫学测定，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。118.在某些实施方案中，所述试剂盒通过如上所述的检测方法来检测cvb1病毒在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了cvb1病毒。119.在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。120.治疗方法和药物组合物121.本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可用于体外或在受试者体内中和cvb1病毒，阻断或抑制cvb1病毒对细胞的感染，以及用于预防和/或治疗受试者的cvb1病毒感染或与cvb1病毒感染相关的疾病。122.因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。123.在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂。124.在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为单一组合物的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。125.在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。126.在另一个方面，本发明提供了用于中和柯萨奇病毒b1型(cvb1)的方法，其包括使用本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或药物组合物。所述方法可用于在体外或受试者(例如人)体内中和cvb1病毒。127.在某些实施方案中，所述方法用于中和样品中柯萨奇病毒b1型(cvb1)的毒力。在某些实施方案中，所述方法包括：将包含cvb1病毒的样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或药物组合物接触。128.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。129.在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗受试者的cvb1感染或与cvb1病毒感染相关的疾病的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或药物组合物。130.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。131.在某些实施方案中，所述与cvb1病毒感染相关的疾病包括无菌性脑膜炎、心肌炎、脑膜脑炎、手足口病、胸痛或新生儿爆发性肝炎伴凝血障碍。132.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。133.在另一个方面，本发明涉及本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于：134.(1)在体外或受试者(例如人)体内中和cvb1病毒；和/或135.(2)用于预防或治疗受试者的cvb1病毒感染或与cvb1病毒感染相关的疾病。136.在某些实施方案中，所述与cvb1病毒感染相关的疾病包括无菌性脑膜炎、心肌炎、脑膜脑炎、手足口病、胸痛或新生儿爆发性肝炎伴凝血障碍。137.在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。138.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。139.本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、或者本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的重组蛋白，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。140.本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段、或药物组合物通过静脉注射或推注给予。141.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。142.在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。143.在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。144.术语定义145.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。146.如本文中所使用的，术语“柯萨奇病毒b1型(cvb1)”是指，小核糖核酸病毒科(picomaviridae)、肠道病毒属(enterovirus)、柯萨奇病毒(coxsackivirus)b组中的一种，其基因组为单股正链rna。cvb1的基因组序列或cdna序列是本领域熟知的，并且可参见各种公共数据库(例如，genbank数据库登录号：mg780414)。cvb1存在两种类型的病毒颗粒：空心颗粒(无rna，无感染性)，实心颗粒(有rna，具有感染性)，这两种病毒颗粒均具有免疫原性。147.如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(lc)和一条重链(hc))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循kabat,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定义。148.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883)或imgt编号系统(lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。149.在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat、chothia或imgt编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过imgt编号系统确定。150.如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。151.术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。152.如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(例如，scfv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linearantibody)、纳米抗体(技术来自domantis)、结构域抗体(技术来自ablynx)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于holliger等,2005；natbiotechnol,23:1126-1136中。153.如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在n端到c端的方向上由重链可变区(vh)、重链恒定区ch1结构域、铰链区(hr)、重链恒定区ch2结构域、重链恒定区ch3结构域组成；并且，当所述全长抗体为ige同种型时，任选地还包括重链恒定区ch4结构域。优选地，“全长重链”是在n端到c端方向上由vh、ch1、hr、ch2和ch3组成的多肽链。“全长轻链”是在n端到c端方向上由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在cl和ch1之间的二硫键和两条全长重链的hr之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由vh和vl对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。154.如本文中所使用的，术语“fd片段”意指由vh和ch1结构域组成的抗体片段；术语“dab片段”意指由vh结构域组成的抗体片段(ward等人,nature341:544546(1989))；术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段；术语“fab’片段”意指还原连接f(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的fd片段(由vh和ch1结构域组成)组成。155.如本文中所使用的，术语“fv片段”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段。fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个cdr赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的cdr)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。156.如本文中所使用的，术语“fc片段”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。157.如本文中所使用的，术语“scfv”是指，包含vl和vh结构域的单个多肽链，其中所述vl和vh通过接头(linker)相连(参见，例如,bird等人,science242:423-426(1988)；huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988)；和pluckthun，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，roseburg和moore编，springer-verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情况下，scfv的vh与vl之间还可以存在二硫键。如本文中所使用的，术语“di-scfv”是指，由两个scfv连接形成的抗体片段。158.如本文中所使用的，术语“双抗体”意指，其vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,holligerp.等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)，和poljakr.j.等人,structure2:1121-1123(1994))。159.上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。160.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。161.在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。162.如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mab”具有相同的含义且可互换使用可互换，其是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外，修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。163.如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(chimericantibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(u.s.p4,816,567tocabillyetal.；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:68516855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。164.如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分cdr区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非cdr区(例如，可变区fr和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。165.本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的dna可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。166.为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如cabilly等人的美国专利no.4,816,567)。例如，将编码vh的dna可操作的连接至编码重链恒定区的另一dna分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242)，包含这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，但是通常优选为igg1或igg4恒定区。例如，将编码vl的dna可操作的连接至编码轻链恒定区cl的另一dna分子以获得全长轻链基因(以及fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat，e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，fifthedition，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nihpublicationno.91-3242)，包含这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。167.为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠cdr区插入人源框架序列(参见winter的美国专利no.5,225,539；queen等人的美国专利nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及lo,benny,k.c.,editor,inantibodyengineering:methodsandprotocols,volume248,humanapress,newjersey,2004)。168.如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(spr)在biacore仪中测定。169.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。170.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。171.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。172.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。173.本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology-asynthesis(2ndedition,e.s.golubandd.r.gren,eds.,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。174.如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。175.如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。176.如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。177.如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。178.如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。179.发明的有益效果180.本发明的单克隆抗体或抗原结合片段对cvb1实心颗粒和/或空心颗粒具有良好的亲和力，能够特异性检测cvb1病毒或病毒颗粒。此外，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段还能够中和cvb1的毒力，从而用于预防和治疗cvb1感染以及与cvb1感染相关的疾病。因此，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段具有重大的临床价值。181.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。附图说明182.图1显示了利用蔗糖梯度密度离心方法分离的cvb1不同类型病毒颗粒的透射电镜分析结果。183.图2显示了不同单克隆抗体与cvb1病毒实心颗粒和空心颗粒的结合活性。184.图3显示了基于单克隆抗体5f5的双抗体夹心elisa法对cvb1病毒颗粒的检测结果。185.图4显示了基于单克隆抗体5f5、8a10和9a3的免疫荧光试验对被cvb1病毒感染的细胞的检测结果。186.图5显示了单克隆抗体5f5、8a10和9a3在小鼠模型中对cvb1感染的预防活性评价。187.图6显示了单克隆抗体5f5、8a10和9a3在小鼠模型中对cvb1感染的治疗活性评价。188.序列信息189.本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。190.表1：序列的描述191.192.193.具体实施方式194.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。195.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。196.实施例1：cvb1病毒颗粒的制备197.1.1病毒的培养：198.本实施例所用的cvb1毒株为301(genbankno.mt129657)，培养病毒用细胞为人横纹肌瘤细胞rd(ccl-136tm)。首先将rd细胞培养于10cm培养皿(nest)中，培养基为含10％胎牛血清(paa)的mem培养基(gibco)。细胞汇合率达到80％时，换成无血清mem培养基，按moi＝0.1的量来接种病毒。37℃培养，3天后待细胞完全病变后，收获病毒。病毒收获方法为：将细胞刮下后冻融3次，离心去除细胞碎片，取细胞裂解上清，经0.22μm滤膜过滤后获得病毒原液，-80℃冻存备用。199.1.2蔗糖密度梯度离心分离获得不同性质的病毒颗粒：200.通过peg8000对上述获得的病毒原液进行浓缩沉淀，沉淀条件为6％peg6000，0.3mol/lnacl，4℃沉淀过夜。再经10000g离心取沉淀，沉淀用pbs重悬。随后进行蔗糖梯度离心，蔗糖梯度为15％-50％，sw41ti转头120000g离心2.5h，分别取样进行电镜负染观察。结果如图1所示，蔗糖梯度离心可有效分离获得cvb1病毒实心颗粒和空心颗粒。201.实施例2：单克隆抗体的制备202.取实施例1制备的cvb1病毒原液与弗氏完全佐剂混合乳化均匀，对6-8周龄balb/c雌鼠进行多点注射，包括背部皮下注射、腹股沟皮下注射、足垫注射、四肢肌肉注射等途径注射免疫原，注射剂量为500μl/只次。后每隔2周加强一次，以相同方式进行加强免疫，免疫原为实施例1制备的cvb1病毒原液与弗氏非完全佐剂的混合物，每次免疫前采集20μl尾静脉血或200μl眼球静脉血以备滴度测定。用间接elisa测定血清滴度，当小鼠血清滴度达到平台期后，小鼠停止免疫并休息两个月后进行融合。融合前72h，直接向小鼠脾脏注射100μlcvb1病毒原液(不加佐剂)，进行免疫加强。72h后，处死小鼠收集小鼠抗血清(小鼠多抗血清)，同时取小鼠脾脏制成细胞悬液(悬于rpmi1640培养基中)，细胞计数板计数。按1/6于脾细胞的数量与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0混合，随后使用50％聚乙二醇(peg)进行细胞融合。将细胞悬液与等体积的饲养细胞(balb/c小鼠巨噬细胞及胸腺细胞)混合后，置入96孔细胞培养板中(200μl/孔)，5％co2，37℃。3天后，用含次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸腺嘧啶核苷的1640培养基半换液。七天后，用cvb1病毒原液包被elisa板，用间接elisa方法检测杂交瘤细胞培养上清。对于elisa阳性的细胞孔，利用有限稀释法进行克隆化。203.单克隆抗体的纯化：取10周龄的健康balb/c小鼠，腹腔注射石蜡油，每只0.5ml。2-7天后，收集克隆化的杂交瘤细胞，离心去上清，加入不含血清的1640ht培养基，调节细胞密度至2×105-2×106个/ml,每只小鼠注射0.5ml。7-10天后小鼠腹部增大，开始收集腹水。3000rpm离心15min，吸取中间澄清的液体，-20℃保存。腹水采集完毕后进行抗体纯化。将腹水用0.02mol/l、ph7.4的pbs对倍稀释，搅拌下缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，4℃过夜。4℃，12000rpm离心15min，弃上清。将沉淀溶于适量的pbs中，装入透析袋中，放入50-100倍体积的0.02mol/lpb(ph7.4)中，4℃下搅拌脱盐12h左右，期间更换3次透析液。将透析过得抗体用proteina柱(ge)在akta纯化系统下纯化，0.02mol/lpb(ph7.4)条件下亲和挂柱，用0.1m的柠檬酸洗脱，洗脱液即为纯化的抗体。将洗脱液透析至0.02mol/lpb(ph7.4)中，-20℃保存。204.实施例3：可特异结合cvb1病毒颗粒的单抗的筛选205.elisa实验(间接法)：将实施例1制备的cvb1病毒实心颗粒抗原和空心颗粒抗原分别用20mmpb7.4稀释100倍，包被96孔酶标板，100μl/孔，37℃包被2h，用pbst洗板1次，用相关封闭液(20mmpb7.4含150mmnacl,0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，200μl/孔，4℃封闭过夜。将实施例2制备的待测单克隆抗体样品(0.1mg/ml)，取100μl加入酶标板，37℃孵育1h。pbst洗板5次，加入gam-hrp(辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体，购自美国bio-rad公司，稀释液配方同封闭液)，37℃孵育30min。pbst洗板5次，加入tmb显色液显色15min，终止液终止，酶标仪(tecansunrise)读值。最终从30余株单克隆抗体中筛选获得3株可特异性结合cvb1病毒颗粒的单抗5f5、8a10和9a3，部分抗体的筛选结果如图2所示，其中5f5可特异性的结合cvb1实心颗粒，而与空心颗粒无明显反应，8a10和9a3均可特异性结合cvb1病毒实心颗粒和空心颗粒，且结合活性明显优于其他单抗。206.进一步对单抗5f5、8a10和9a3进行可变区序列分析，其vh和vl序列如下表所示。进一步，基于imgt数据库(http://www.imgt.org/imgt_vquest/analysis)确定了三株单抗的cdr序列。207.表2：单抗可变区序列[0208][0209][0210]实施例4：cvb1实心颗粒抗原检测方法的建立[0211]本实施例以5f5作为包被单抗，建立双抗体夹心酶联免疫检测方法来检测cvb1实心颗粒抗原。[0212]4.1辣根过氧化酶标记抗体的制备：[0213]取hrp、naio4各1mg，加超纯水溶解；然后向hrp溶液中逐滴加入naio4溶液，边加边摇晃混匀，并将混好的溶液置于4℃，避光30min；取1μl乙二醇溶于超纯水中，逐滴加入，边加边摇晃混匀，室温避光静置30min，至此酶氧化过程完成。在氧化hrp的过程中，用ph9.6的50mmcb缓冲液透析纯化的抗体。hrp氧化完后，将透析好的抗体与hrp按所需比例混合，于50mmcb缓冲液中透析6h以上；然后用新鲜配制的nabh4溶液终止，nabh4量为0.2mg；摇匀，4℃静置2h。然后用ph7.2的10mmpbs透析过夜。[0214]通过上述方法制备获得三种hrp标记抗体：多抗-hrp，与cvb1病毒颗粒结合的鼠多抗(实施例2中制备的小鼠多抗血清)；8a10-hrp，与cvb1病毒颗粒结合的单抗(实施例3中筛选的8a10)；9a3-hrp，与cvb1病毒颗粒结合的单抗(实施例3中筛选的9a3)。[0215]4.2elisa实验(双抗夹心elisa)[0216]将5f5单抗用20mmpb7.4稀释至0.1μg/ml浓度，包被96孔酶标板，100μl/孔，37℃包被2h。用pbst洗板1次，用相关封闭液(20mmpb7.4含150mmnacl，0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，200μl/孔，4℃封闭过夜。将不同的cvb1病毒样品用封闭液稀释100倍，按100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h。pbst洗板5次，4.1中制备获得的hrp标记抗体(多抗-hrp、8a10-hrp或9a3-hrp)，37℃孵育30min。pbst洗板5次，加入tmb显色液显色15min，终止液终止，酶标仪(tecansunrise)读值。结果如图3所示，5f5无论与多抗配对还是与单克隆抗体配对，都可检测出cvb1实心颗粒抗原，而检测不出空心颗粒抗原。以上结果表明，以5f5为包被抗体的双抗体夹心elisa方法，可以用于cvb1实心颗粒抗原的检测。[0217]实施例5：抗体亚型的鉴定[0218]将实施例1制备的cvb1病毒实心颗粒抗原用20mmpb7.4稀释100倍，包被96孔酶标板，100μl/孔，37℃包被2h，用pbst洗板1次，用相关封闭液(20mmpb7.4含150mmnacl,0.5％酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，200μl/孔，4℃封闭过夜。取稀释500倍的单抗100μl加入酶标板，37℃孵育1h。pbst洗板5次，分别加入标记hrp的抗igg1,igg2a,igg2b,igg3和igm的羊抗鼠二抗(thermo)。37℃孵育30min。pbst洗板5次，加入tmb显色液显色15min，终止液终止，酶标仪(tecansunrise)读值。结果显示单抗5f5、8a10和9a3均为igg2a亚型。[0219]实施例6：单克隆抗体5f5、8a10和9a3用于检测cvb1感染的细胞[0220]将rd细胞铺于24孔细胞培养板中(500μl，5×104/孔)，孔内预先铺上圆形盖玻片。待细胞贴壁后，接种cvb1病毒，5000tcid50/孔，同时设置细胞空白对照。12h后，用枪尖吸去上清，用pbs洗液洗一次，1ml/孔。吸去pbs，加4％多聚甲醛，1ml/孔，常温避光固定15min。加0.5％tritonx-100(pbs配制)通透，1ml/孔，室温，10min。[0221]pbs洗三次，每次3min。把一张封口膜拉平固定在24孔细胞培养板板盖上，在封口膜上对应每孔滴加50μl山羊血清。加好后，用弯针头将铺有细胞的盖玻片掀起，镊子夹住边缘，细胞面朝下盖在膜上，放入湿盒，37℃，1h。将盖玻片按原孔放回24孔板中，细胞面朝上，pbs洗三次，每次3min。取抗体(1mg/ml)用2％bsa稀释200倍，加至细胞上(操作方法同封闭过程)，37℃封闭1h。将盖玻片按原孔放回24孔板中，细胞面朝上，pbs洗三次，每次3min。用2％bsa稀释二抗gam-fitc(sigma)，1:500倍稀释，湿盒避光37℃孵育30min(操作方法同封闭过程)。将盖玻片按原孔放回24孔板中，细胞面朝上，pbs洗三次，每次3min。用pbs按1:2000比例稀释dapi(invitrogen)，加至细胞上(操作方法同封闭过程)，室温避光5min。将盖玻片按原孔放回24孔板中，细胞面朝上，pbs洗三次，每次3min。避光。在干净载玻片上做好标记，将封片剂(70％甘油，2.5％防促灭剂)30μl左右滴于擦净的载玻片上盖上有细胞的盖玻片，指甲油封边缘，避光晾干。荧光显微镜下观察并拍照。结果如图4所示，被cvb1病毒感染的细胞有绿色荧光，而空白对照无绿色荧光。以上结果表明单抗5f5、8a10和9a3均可用于检测cvb1感染的细胞。[0222]实施例7：单克隆抗体5f5、8a10和9a3的中和效价[0223]中和实验：用传统中和实验方法鉴定杂交瘤细胞培养上清或粗纯抗体的中和活性。将人横纹肌肉瘤细胞(rd)铺于96孔细胞培养板中(5×103/孔)。10h后将待测样品用无血清mem培养基进行倍比稀释(以8倍稀释为起点，进行2倍比稀释，稀释10个梯度)，每份样品至少重复4孔。用无血清mem将cvb1病毒稀释至100tcid50/50μl的浓度，取50μl加入上述已梯度稀释的单抗样品孔中。37℃孵育1h后，将单抗与病毒混合液100μl加入预铺有rd细胞的96孔细胞培养板中。37℃，5％co2培养，连续观察7天并记录细胞病变。可以抑制50％以上细胞孔病变的最大稀释倍数作为该样品的中和效价。结果显示，单抗5f5、8a10和9a3均具有较高的体外中和活性，中和效价分别约为8192、131072和2048。[0224]实施例8：单克隆抗体5f5、8a10和9a3在小鼠体内预防cvb1感染实验[0225]实验新生鼠分组如下：选用一日龄balb/c小鼠，设置抗体预防组和pbs对照组，每组15只。新生鼠饥饿4h后，对其腹腔注射单抗(5f5、8a10和9a3)，剂量为30μg/只；pbs对照组腹腔注射同体积的pbs。4h后，对抗体预防组和pbs对照组的新生鼠腹腔注射感染cvb1病毒，攻毒剂量为100tcid50。以上动物均连续观察20天。[0226]实验结果如图5所示，pbs对照组小鼠在攻毒后7天大部分死亡；而5f5、8a10和9a3预防组体症均正常，未见异常。说明单抗5f5、8a10和9a3均有预防cvb1感染的作用。[0227]实施例9：单克隆抗体5f5、8a10和9a3的小鼠体内治疗实验[0228]由于单抗5f5、8a10和9a3对cvb1病毒均具有较高的中和活性，因此将其用于单抗治疗cvb1感染动物模型试验中则可能保护cvb1感染鼠免于发病。[0229]实验新生鼠分组如下：选用一日龄balb/c小鼠，设置抗体保护组和pbs对照组，每组15只。新生鼠饥饿4h后，对抗体保护组和pbs对照组的新生鼠腹腔注射感染cvb1病毒，攻毒剂量为100tcid50。抗体保护组在攻毒后24h，对其腹腔注射单抗(5f5、8a10和9a3)，剂量为30μg/只；pbs对照组腹腔注射同体积的pbs。以上动物均连续观察20天。[0230]实验结果见图6，pbs对照组小鼠，出现消瘦症状，攻毒后4天出现后肢瘫痪症状，攻毒后7天大部分小鼠死亡；相比之下，单抗5f5、8a10和9a3保护组体症均正常，未见异常。说明单抗5f5、8a10和9a3均可有效治疗被cvb1感染的小鼠。[0231]尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12