一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明涉及一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。

背景技术：

赛拉嗪（xylazine，xyl）为镇痛性化学保定药，主要用于马、牛、羊等动物的镇静与镇痛。研究表明，赛拉嗪在食源性动物组织中的残留对消费者造成的健康风险很大，长期使用含有赛拉嗪残留动物源食品可能会出现恶心、呕吐、头晕，个别患者会出现精神失常。因此，建立有效的赛拉嗪残留检测方法，对有效控制牛奶产品中赛拉嗪的残留，保障广大人民群众的身体健康，具有深远的意义。

赛拉嗪的传统检测方法有高效液相色谱，液相色谱/串联质谱和气相色谱/串联质谱等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对赛拉嗪的高效、快速的检测方法。酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测赛拉嗪的前提是得到对赛拉嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对赛拉嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对赛拉嗪具有较高的检测灵敏度，可以用来建立赛拉嗪的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株abc09，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号cgmccno.19162。

赛拉嗪单克隆抗体，它由所述保藏编号为cgmccno.19162的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株abc09分泌产生。

免疫原赛拉嗪-bsa的合成，具体步骤如下：

（1）赛拉嗪半抗原的制备：将赛拉嗪（570mg，2.59mmol）和1,5-戊二酰氯（480.99mg，2.85mmol）溶于二氯甲烷（5ml），并在冰浴中冷却。然后将溶解在二氯甲烷（5ml）中的三乙胺（tea）（314.18mg，3.10mmol）添加至所述溶有赛拉嗪的混合液中。添加30min后，温度逐渐升至室温。通过薄层色谱法（tlc）证明原料已被消耗。将反应混合物在真空中浓缩，并通过快速柱色谱法纯化（dcm：meoh，1：0逐渐增加至40：1），得到化合物1（660mg，1.70mmol，产率65.60％（w/w））。将化合物1（660mg，1.70mmol）溶于n，n-二甲基甲酰（3ml）。然后将溶液加入水（3ml）中，在其中白色固体会分离出来。过滤收集产物，随后用dcm洗涤3次，并在真空下干燥。产生的白色固体即为赛拉嗪半抗原（412mg，1.23mmol，产率72.65％（w/w））。半抗原合成路线详见实施例1杂交瘤细胞株abc09的制备。

（2）免疫原赛拉嗪-bsa的制备：称取1.48mg的赛拉嗪半抗原将其溶解在600μldmf中，然后加入2.52mgedc，1.52mgnhs，该混合物在室温搅拌6h，得到反应液a；称取5mgbsa，溶解于0.1m硼酸盐缓冲液中，得到溶液b；随后，逐滴将a液加入到b液中，室温反应8h，即得偶联物赛拉嗪-bsa混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原赛拉嗪-bsa。

本发明的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：

（1）小鼠的免疫：将免疫原赛拉嗪-bsa与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用赛拉嗪-bsa完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测血清效价和抑制；

（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（peg4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株abc09。

杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-elisa测定灵敏度和特异性。

所述赛拉嗪单克隆抗体的应用，建立赛拉嗪含量的免疫检测方法，应用于食品中赛拉嗪的检测。

进一步地，所述检测领域为乳品和其他含有赛拉嗪的食品检测。

本发明的有益效果：本发明提供的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对赛拉嗪具有较好的特异性和检测灵敏度（ic50值为0.39ng/ml），为检测乳品和其他含有赛拉嗪的食品中赛拉嗪含量提供了免疫学方法。本发明提供的赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测赛拉嗪的试剂盒，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株abc09，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号cgmccno.19162。

附图说明

图1abc09赛拉嗪单克隆抗体对赛拉嗪的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将赛拉嗪完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic-elisa筛选细胞上清，最终得到了对赛拉嗪有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1杂交瘤细胞株abc09的制备

（1）完全抗原的制备：

a、半抗原合成路线如下：

将赛拉嗪（570mg，2.59mmol）和1,5-戊二酰氯（480.99mg，2.85mmol）溶于二氯甲烷（5ml），并在冰浴中冷却。然后将溶解在二氯甲烷（5ml）中的三乙胺（314.18mg，3.10mmol）添加至混合物。添加30分钟后，温度逐渐升至室温。通过薄层色谱法证明原料已被消耗。将反应混合物在真空中浓缩，并通过快速柱色谱法纯化（二氯甲烷：meoh，1：0逐渐增加至40：1），得到化合物1（660mg，1.70mmol，产率65.60％（w/w））。将化合物1（660mg，1.70mmol）溶于n,n-二甲基甲酰（3ml）。然后将溶液加入水（3ml）中，在其中白色固体会分离出来。过滤收集产物，随后用二氯甲烷洗涤3次，并在真空下干燥。产生的白色固体即为赛拉嗪半抗原（412mg，1.23mmol，产率72.65％（w/w））。

b、称取1.48mg的赛拉嗪半抗原将其溶解在600μldmf中，然后加入2.52mgedc，1.52mgnhs，该混合物在室温搅拌6h，得到反应液a1；称取5mgbsa(赛拉嗪半抗原与bsa摩尔比为60:1)，溶解于0.1m硼酸盐缓冲液中，得到溶液b1；随后，逐滴将a1液加入到b1液中，室温反应8h，即得偶联物赛拉嗪-bsa混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原赛拉嗪-bsa。

（2）包被原赛拉嗪-ova的制备：

称取2.23mg赛拉嗪半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐3.82mg，n-羟基琥珀酰亚胺2.40mg，用600μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，得到a2液，室温搅拌反应6h。称取5mg鸡卵清白蛋白ova（赛拉嗪半抗原与ova摩尔比为60:1），溶解于3ml0.1m硼酸盐缓冲溶液中，得到b2溶液，在室温条件下，逐滴将a2液加入到b2液中，室温反应8h，即得偶联物赛拉嗪-ova混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测，并不直接用于免疫小鼠，是制备单抗必需的。

（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的赛拉嗪完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血（小鼠断尾采血5μl+995μl抗体稀释液=抗血清），使用ic-elisa测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培养基在5%co2培养箱中。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到﹙1~4﹚×10⁷，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。第1min，将1ml的peg4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mlrpmi-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mlrpmi-1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基。然后37℃温育5min。离心（800rpm，8min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5%co2培养箱中培养。

（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清，1%的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用赛拉嗪为标准品，用ic-elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对赛拉嗪标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株abc09。

（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

实施例2赛拉嗪单克隆抗体的ic50的测定

碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（pbs）：8.0gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4•12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

洗涤液（pbst）：1000ml的0.01mol/lph7.4的pbs溶液中加入0.5ml的tween–20；

pbst：含0.05%tween–20的pbs；

抗体稀释液：含有0.1%明胶的洗涤缓冲液；

tmb显色液：a液：na2hpo4•12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1:5混合即为tmb；显色液，现用现混。

（1）包被：将包被原赛拉嗪-ova用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液从1µg/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2h；

（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清（小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清）从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入50μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。

用ic-elisa测定单克隆抗体赛拉嗪的ic50为0.39ng/ml，说明对赛拉嗪有很好的灵敏度，可用于赛拉嗪免疫分析检测。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。