一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法与流程

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法。

背景技术：

肝细胞癌在世界癌症死亡率排名中排名第二位，其具有高转移率、低预后率、难以治疗等特点。肿瘤的恶性侵袭与转移，导致患者肿瘤复发，治疗效果不佳，预后效果比较差。肿瘤细胞一旦转化为恶性细胞，它的侵袭和迁移能力也会变得异常强大。肿瘤细胞并不只限于单个细胞的迁移。在许多肿瘤类型中，通常观察到的侵袭单元是细胞群，群体的行为决定恶性功能。二维(two-dimensional，2d)细胞培养已广泛应用于生物学研究，但在二维水平生长的细胞并不能精确地模拟体内的状态。相比于2d培养，三维(three-dimensiona，3d)细胞培养通过运用再造细胞外基质(比如matrigel、collageni、水凝胶等)、构建支架或借助一定的载体，能够模拟体内细胞生存环境，为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境，更有利于开展肿瘤细胞向周围组织侵袭和迁移的研究，以及建立更接近体内真实环境的药敏筛选模型。但目前的肿瘤类器官3d培养技术还存在一定不足(science364,2019，952–955.)，如：不同器官肿瘤类模型形态不易区分，缺乏代表性；培养周期较长，培养价格相对还是太高；类器官培养多局限于基质胶、水凝胶等基质材料中，该类方式限制了类器官与外界的气体交换和物质代谢，交换局限性严重影响了类器官所需营养物质的吸收以及代谢废物的清除。针对上述不足，本专利技术提供了一种肝肿瘤无支架3d类器官的培养方法，并将其应用于抗肿瘤药物药敏筛选。该培养体系可实现肝肿瘤原代细胞的外快速增殖、提高肝肿瘤3d类器官建模及培养成功率、大幅度降低培养成本和培养周期。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基及培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：一种用于构建肝肿瘤无支架类器官的培养基，其特征在于，由血清替代物n2和b27、noggin、双抗、表皮生长因子、成纤维生长因子、选择性rock1抑制剂、alk5抑制剂、p38mapk抑制剂、n-乙酰半胱氨酸、r-spondin蛋白、烟酰胺、wnt3a细胞因子、肝细胞生长因子、primocin^tm、胎牛血清和基础培养基advanceddmem/f12组成。

作为本发明进一步的方案，所述血清替代物n2和b27的终浓度分别为1％和2％(体积百分含量)；所述noggin的终浓度为100ng/ml；所述双抗的终浓度为1-2％(体积百分含量)；所述表皮生长因子(egf)的终浓度为50-100ng/ml；所述成纤维生长因子(fgf-10)的终浓度为10-20ng/ml；所述选择性rock1抑制剂(y-27632)的终浓度为10-20μmol/l；所述alk5抑制剂(a83-01)的终浓度为0.5-1.0μmol/l；所述p38mapk抑制剂(sb202190)的终浓度为5-15μmol/l；所述n-乙酰半胱氨酸的终浓度为0.5-1.5mmol/l；所述r-spondin蛋白的终浓度为100-200ng/ml；所述烟酰胺的终浓度为5-15mmol/l；所述wnt3a细胞因子的终浓度为50-100ng/ml；所述肝细胞生长因子(hgf)的终浓度为50-100ng/ml；所述primocin^tm的终浓度为100-200μg/ml；胎牛血清的终浓度为5％(体积百分含量)；余量均为advanceddmem/f12。

表1肝癌类器官专用完全培养基组成

作为本发明进一步的方案，双抗(青霉素/链霉素混合液)中添加有glutamax成分，该成分的添加有利于类器官3d细胞球的生长。

一种肝肿瘤无支架类器官培养方法，将将分离获取的肝肿瘤原代细胞接种至超低吸附u型96孔板中，并加入上述培养基，对孔板进行离心，1000rpm离心3min，促进肝肿瘤原代细胞聚集，培养至形成肝肿瘤组织类器官。

作为本发明进一步的方案，肝肿瘤原代细胞接种数量范围为1000～12000细胞/孔。

作为本发明进一步的方案，纯化后的原代细胞接种数量范围为2000-6000细胞/孔。

作为本发明进一步的方案，细胞接种且离心孔板后，在24h内可形成凝聚的细胞球形态，此时为了维持初步形成的细胞球的稳定，在接种前4天内每2天更换一次培养基，4天后再每天更换培养基，以维持养分的供应。

所用基础培养基为advanceddmem/f12培养基。所用原代细胞抗生素为primocin^tm，此成分的添加有助于避免原代细胞的污染，尤其可避免乙肝病毒的感染。上述肝癌类器官培养方法中，必须添加r-spondin，此成分有助于肝癌类器官的形成。上述肝癌类器官培养方法中，必须添加n-乙酰半胱氨酸，此成分有助于维持肝癌类器官外形的规则圆润。

作为本发明进一步的方案，将手术取下的肝癌组织剪碎成1mm²大小的组织碎块，随后使用含双抗的pbs溶液漂洗干净，100g离心2min收集组织块沉淀，加入2-3倍体积的组织消化液，充分混匀后37℃消化30～60min，每隔10min观察一次消化状态，并用力震荡，直至观察到组织出现弥散状态时即可终止消化，收集细胞；

分离的原代肿瘤细胞悬液1000rpm/min离心3分钟，除上清，收集沉淀，加入适量专用培养基重悬，利用差速贴壁法进行细胞纯化。纯化后的细胞进行接种，按照2500细胞/孔的密度接种至超低吸附96孔板u形培养板中，每孔补充表1的专用培养基150μl，放入37℃、5％co2培养箱中培养；

接种后30分钟细胞由于重力聚集，24小时内即可形成3d细胞球，之后细胞球开始组装，越来越紧致，3-4天之后达到稳定，体积开始增大，每天更换一次完全培养基，所培养的球体形态完整规则、圆润饱满、边界清晰，连续培养10天仍可维持细胞球形态与活力的稳定。

作为本发明进一步的方案，所述组织消化液为0.1％ⅰ型胶原酶+0.1％ⅳ型胶原酶+hank's溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的专用肝肿瘤类器官培养基针对肝癌患者来源肿瘤细胞的生长特点，实现肿瘤原代细胞的体外增殖，并可快速构建无支架肝肿瘤类器官，24小时内即可形成3d细胞球。本发明提供的无支架肝肿瘤类器官培养基及培养方法，可促进肝肿瘤类器官的长期稳定生长，形成的类器官保留了患者肿瘤组织的异质性，适用于体外肝癌化疗药的药敏检测及肿瘤相关的研究。本发明为化疗药物的体外药敏筛选提供了一种有效的体外研究模型，可以准确预测患者对药物的反应，有助于临床患者的个体化治疗，降低耐药，提高疗效。

附图说明

图1为本发明实施例建立类器官体系效果图(其中a为接种后1天，b为接种后5天，c为接种后10天)。

图2为本发明实施例完全培养基中缺少不同成分时所形成类器官的外观形态差异对比图(其中a为专用完全培养基，b为缺r-spondin培养基，c为缺n-乙酰半胱氨酸培养基)。

图3为本发明实施例2d普通培养原代肝癌细胞免疫荧光鉴定结果图(其中a为cea抗原鉴定结果，b为ck7抗原鉴定结果，c为p53抗原鉴定结果，d为cd44抗原鉴定结果)。

图4为本发明实施例3d培养无支架类器官细胞球免疫荧光鉴定结果图(其中a为cea抗原鉴定结果，b为ck7抗原鉴定结果，c为p53抗原鉴定结果，d为cd44抗原鉴定结果)。

图5本发明实施例给药第7天后2d常规培养(a)和类器官3d培养(b)的细胞活性抑制率图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的阐述。

肝癌原代细胞类器官的制备：

将手术取下的肝癌组织剪碎成1mm²大小的组织碎块，随后使用含双抗的pbs溶液漂洗干净，100g离心2min收集组织块沉淀。加入2-3倍体积的组织消化液(0.1％ⅰ型胶原酶+0.1％ⅳ型胶原酶+hank's溶液)，充分混匀后37℃消化30～60min，每隔10min观察一次消化状态，并用力震荡，直至观察到组织出现弥散状态时即可终止消化，收集细胞。

分离的原代肿瘤细胞悬液1000rpm/min离心3分钟，除上清，收集沉淀，加入适量专用培养基重悬，利用差速贴壁法进行细胞纯化。纯化后的细胞进行接种，按照2500细胞/孔的密度接种至超低吸附96孔板u形培养板中(sumitomobakelite公司，或其他同类型市售产品)，每孔补充表1的专用培养基150μl，放入37℃、5％co2培养箱中培养。

接种后30分钟细胞由于重力聚集，24小时内即可形成类器官球，之后细胞球开始组装，越来越紧致，3-4天之后达到稳定，体积开始增大。每天更换一次完全培养基。实验结果如图1所示，本发明技术能够有效地培养肝癌原代细胞无支架类器官球，且接种24h内即可形成类器官，所培养的球体形态完整规则、圆润饱满、边界清晰，连续培养10天仍可维持细胞球形态与活力的稳定。

专用完全培养基中，primocin^tm必须添加，因临床获取的肝癌组织，其来源患者多伴有乙肝，乙肝病毒会导致该患者原代肿瘤细胞提取分离的失败。

r-spondin和n-乙酰半胱氨酸在类器官模型建立中的作用比较；

实验分为3组：专用完全培养基组、缺r-spondin培养基组(其余成分组成与专用完全培养基组完全一致)和缺n-乙酰半胱氨酸培养基组(其余成分组成与专用完全培养基组完全一致)。分离得到的原代肝癌肿瘤细胞悬液，随机等分为3份，离心后分别用三种不同的培养基进行混悬后计数。按2500细胞/孔的密度接种至超低吸附96孔板u形培养板中，每实验组接种不少于9个复孔。

结果如图2所示，按照本发明专用完全培养基所培养的类器官细胞球形态圆润完整、边界线分明；缺少其中的成分r-spondin时，所成细胞球边缘有崩解现象出现，球体完整性降低；缺少其中的成分n-乙酰半胱氨酸时，所成细胞球球体规则性降低，甚至会出现一孔多球的现象。

肝癌原代细胞及肿瘤类器官的表面抗原鉴定；

对培养稳定的肝癌原代细胞(2d)及形成的类器官(无支架3d细胞球)进行cea(癌胚抗原)、ck7(细胞角蛋白7)、p53(抑制基因p53抗原)和cd44(多肽抗原)四个抗原的表达分布鉴定。cd44抗原可作为肝细胞癌干细胞表面标志物。

鼠抗人单克隆cea抗体购自eastcoastbio公司；鼠抗人单克隆ck7、p53、cd44抗体购自abcam公司；二抗驴抗鼠488抗体购自southernbiotech公司；dapi购自碧云天公司。

免疫荧光鉴定采用间接免疫荧光法，结果见图3、4所示。cea、ck7、p53、cd44这四种表面抗原在原代细胞及类器官细胞球都有表达，且在原代细胞表面cea、cd44的表达更强，ck7、p53的表达则相对较弱；而在类器官上这4个抗原的荧光信号强度都有显著增强，且相对而言仍然是cea、cd44的表达更强。免疫荧光结果显示从肝癌组织分离所得的原代细胞确为肝癌原代细胞，而此原代细胞培养而成的类器官细胞球后能够增强原代细胞的干性，从而体现类器官细胞球在结构及原代特性上的优势。

药敏筛选；

采用生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(atp-tca)，研究比较了肝癌原代细胞体外2d常规培养和采用本专利培养体系建立的肝癌原代细胞类器官3d细胞球对药物的敏感性。普通96孔板(2d常规培养)和类器官培养96孔板(无支架类器官3d培养)的接种密度均为：2500细胞/孔；类器官培养96孔板接种后离心3min，1000rpm。化疗药选择治疗肝癌的一线用药吉西他滨、奥沙利铂、紫杉醇、索拉菲尼及两药联合，给药浓度依据其血浆峰值浓度(ppc)进行设定，吉西他滨为25μg/ml，奥沙利铂为1.0μg/ml，紫杉醇为13.8μg/ml，索拉菲尼为10μg/ml。给药浓度梯度设定为0％、25％、50％、100％、200％ppc。分别再给药第3、5、7天进行细胞atp测定，计算药物对细胞活性的抑制率，给药第7天的检测结果见图5。根据细胞atp测定结果对测试药物的敏感性进行评价，如表2所示。

表2药物敏感性评价结果

从类器官的接种到获得药敏结果最少仅需10天，类器官形成3天即可达到稳定状态，开始药敏筛选实验，给药7天即可获得药敏结果。根据atp-tca药敏评价标准，给药7天后类器官对吉西他滨、奥沙利铂及二者的联合给药反应为耐药；对紫杉醇反应为耐药，对索拉菲尼反应为轻度敏感，对二者的联合给药反应为强敏感。2d普通培养状态下的原代肝癌细胞对吉西他滨、联合给药反应为强敏感，对奥沙利铂反应为耐药；对紫杉醇反应为耐药，对索拉菲尼及二者的联合用药反应为强敏感。通过比较2d细胞培养和类器官3d细胞球的药敏筛选结果，提示类器官与临床有更好的相关性，类器官3d细胞球药敏筛选会得到更精准的结果，相较于目前常规培养的2d原代肿瘤细胞，本专利技术说建立的类器官3d模型更有利于个体化治疗方案的提出。

另外，从检测结果来看，2d普通培养和类器官3d细胞球状态的肝癌细胞均对奥沙利铂、紫杉醇反应为耐药，反应了此例患者对这两种药物的个体化耐药特性；而含有索拉菲尼的给药方案体现了对肝癌细胞活性的显著抑制作用，这与索拉菲尼在临床肝癌治疗中的广泛应用相一致。

以上所述为本发明较佳实施例，对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理与精神的情况下，对实施方式所进行的改变、修改、替换和变型仍落入本发明的保护范围之内。